Summary
Um método simples para obter e manter a haste espermatogónias e linhas de células progenitoras a partir de ratos adultos, é aqui apresentada. O método utiliza células de alimentação provenientes do compartimento de células somáticas do testículo do rato adulto. Esta técnica é aplicável a linhagens de camundongos comuns, incluindo transgênico, knock-out, e bater-nos camundongos.
Abstract
Tronco espermatogônias e as células progenitoras (SSCS) dos testículos representam um exemplo clássico de células-tronco adultas de mamíferos e preservar a fertilidade por quase toda a vida do do animal. Embora os mecanismos precisos que controlam a auto-renovação e diferenciação in vivo são difíceis de estudo, vários sistemas têm sido desenvolvidos anteriormente para propagar SSC murinos in vitro, utilizando uma combinação de meios de cultura e as células especializadas do alimentador 1-3.
Mais em incursões in vitro sobre a biologia do SSC ter derivado de linhas celulares a partir de recém-nascidos, possivelmente devido à dificuldade na obtenção de linhas de células adultas 4. No entanto, os testículos continua a amadurecer-se até ~ 5 semanas de idade na maioria das estirpes de ratinho. No período pós-natal precoce, mudanças drásticas ocorrem na arquitectura dos testículos e na biologia de ambos células somáticas e de espermatogénese, incluindo alterações nos níveis de expressão de células estaminais numerosos relacionadagenes. Portanto, as linhas-neonatal derivados SSC não pode inteiramente recapitular a biologia do SSC adultos que persistem após o testículo adulto chegou a um estado estacionário.
Vários fatores têm dificultado a produção de linhas de adultos SSC historicamente. Em primeiro lugar, a proporção de células-tronco funcionais pode diminuir durante a idade adulta, quer devido a factores intrínsecos ou extrínsecos 5,6. Além disso, como com outras células-tronco adultas, tem sido difícil para enriquecer suficientemente SSC a partir de células adultas totais testiculares sem o uso de uma combinação de estratégias de triagem ou imuno outros 7. Estratégias geralmente utilizadas incluem a utilização de ratinhos criptorquídios como uma fonte de células do doador, devido a uma maior proporção de células estaminais para outros tipos de células 8. Com base na hipótese de que a remoção de células somáticas a partir da cultura inicial perturba as interacções com o nicho de células estaminais que são essenciais para a sobrevivência SSC, que anteriormente desenvolvidos métodos para derivar l adultoines que não necessitam de imuno ou doadores criptorquídios mas sim empregar enriquecimento série de SSC em cultura, a seguir referido como SESC 2,3.
O método descrito a seguir envolve um procedimento simples para derivar linhas adultos SSC, dissociando adulto dador túbulos seminíferos, seguido por plaqueamento das células em alimentadores que compreendem uma linha celular de estroma testicular (JK1) 3. Através de série passagem, fortemente aderente, contaminando germinativas células não estão esgotados a partir da cultura de enriquecimento concomitante de SSC. Culturas produzidas desta forma contém uma mistura de espermatogônias em diferentes estágios de diferenciação, as quais contêm, com base em SSC a longo prazo a capacidade auto-renovação. O cerne do método SESC é que ele permite SSC para fazer a transição difícil de auto-renovação in vivo a longo prazo de auto-renovação in vitro num microambiente radicalmente diferente, produz linhas de longo prazo do CCD, livre de contaminaçãocélulas somáticas, e desse modo permite a manipulação experimental subsequente de SSC.
Protocol
1. Preparação de células de alimentação
Note-se que todos os reagentes descritos em seguida devem ser preparadas de forma estéril (ver Tabelas 1 e 2). Este protocolo utiliza a linha celular de JK1 (Cell Biolabs, Inc., catálogo # CBA-315) como alimentadores, que é um derivado de transformada de rato adulto células testiculares somáticas e foi descrito em outro lugar 3. Note-se também que todos os procedimentos com animais deve ser realizado de acordo com as diretrizes institucionais e regulamentos.
- JK1 células podem ser mantidas em cultura e utilizadas com sucesso como alimentadores-se a passagem 39. Cultura JK1 células em uma placa de cultura de 100 milímetros de células (BD Falcon, catálogo # 353003), com 10 ml de meio esterilizado por filtração alimentador de crescimento (DMEM, suplementado com 10% soro fetal de bovino [FBS], 2 mM L-glutamina e antibióticos). Quando a cultura atinge 95% de confluência, as células divididas 1:06 -1:10 ratio.
- Remova o meio de confluente mono célula JK1 alimentadorcamada.
- Lavar camada de células uma vez com PBS sem cálcio e magnésio.
- Adicionar pré-aquecido tripsina / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; catálogo Corning Cellgro, # 25-051-CI), e incubar a 37 ° C durante 5-10 min.
- Inactivar a tripsina com um volume igual de meio de crescimento do alimentador. Recolher as células e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Re-suspender as células em meio de crescimento do alimentador.
- Pré-revestimento de poços múltiplos placas de cultura de células por adição de 0,4% de solução suficiente para cobrir a gelatina bem e remover depois de 5 min à temperatura ambiente.
- Placa ~ 250 células por mm2 em gelatina-revestido placa de cultura de células (por exemplo, formato de 48 poços ou de 6 poços). Incubar a cultura a 37 ° C durante 16 a 24 horas.
- Remover o meio de cultura a partir de poços. CUIDADO: Para inactivar o crescimento celular, adicionar uma solução fresca de mitomicina-C a 10 ug / ml diluído em DMEM a cada poço (200 ul, por exemplo / poço de uma placa de 48 poços). A mitomicina-C é tóxico. Manuseie e descarte-a com cuidado. Incubar a37 ° C durante 4 horas.
- Remover a mitomicina C-solução a partir de células. Lavar 3 vezes com DMEM antes de células-tronco do chapeamento.
- Remover DMEM alimentador de células de poços e adicionar meio suficiente de células estaminais (100 ul / poço de uma placa de 48 poços, ver Tabela 3), para evitar a dessecação dos alimentadores durante passaging. Adicionar SSC mesmo dia, como descrito abaixo nas secções 3.1 e 3.4, utilizando os tamanhos indicados de poços contendo alimentadores.
2. Dissociação de Rato tecido testicular para obter células germinativas dos doadores
- Colheita testículos adultos de mouse em forma estéril e armazenar temporariamente os testículos em uma placa de Petri coberta (sem qualquer líquido acrescentado). O prato tem colocado imediatamente em gelo para evitar a dessecação e manter a viabilidade celular.
- Usando estéreis pinça fina e uma tesoura bem em uma capa de cultura de células, fazer uma incisão transversal na túnica albugínea sem completamente atravessa em testículos (ou seja, corte ~ ½ - ¾ distância through) e utilizar uma pinça para espremer para fora dos túbulos seminíferos em um canto da placa; túnica de descarte e tecido em anexo. Manter em gelo durante placa para manter o tecido refrigerados, mantendo assim a sua integridade e prevenir a evaporação.
- Rapidamente mince túbulos com uma tesoura fina de mola, pelo menos, 3 minutos por testículo, mantendo placa em gelo.
- Recolher os fragmentos dos túbulos num tubo cónico de 50 ml e lava-se em ~ 40 ml de soro de PBS / 1% de albumina bovina, refrigerada.
- Centrifugar a 60 xg durante 10 minutos para separar os fragmentos dos túbulos de espermatozóides e detritos. Elimine o sobrenadante.
- Num tubo cónico de 15 ml, ressuspender o sedimento em 3 ml por testículo de pré-aquecida tampão de dissociação (DMEM, 0,05% de tripsina, colagenase tipo I de 0,03%, 80% U / ml de DNAse I e 0,5 de albumina sérica bovina; Ver Tabela 2 para detalhes mais específicos de dissociação buffer).
- Colocar o tubo cónico horizontalmente num suporte de um conjunto agitador a 150 rpm a 37 ° C durante 15 minutos para maximizar agitation.
- Girar para baixo a 60 xg durante 10 minutos para separar as células individuais a partir de pedaços não dissolvidas.
- Guardar os pedaços de pelotização contendo até a próxima etapa. Recolher o sobrenadante do passo 2.8 e adicionar 3 ml de DMEM/10% de soro fetal bovino para neutralizar tampão de dissociação. Coloque o tubo em gelo temporariamente.
- Repetir o passo 2,6-2,7 com o pellet a partir do passo guardado 2,9 a re-digest pedaços restantes após a etapa 2.8.
- Adicionar um volume igual de DMEM/10% de FBS para neutralizar tampão de dissociação.
- Recombinam suspensão do passo 2,11 com suspensão de células guardadas a partir do passo 2.9. Centrifugar durante 5 minutos a 300 x g.
- Ressuspender o granulado em meio de células estaminais em um volume de 16 ml por cada par de testículos (ver Tabela 3).
3. Chapeamento de suspensão de células de testículo
- Placa 2 ml de suspensão de células por poço numa placa de 6 poços contendo células alimentadoras mitoticamente inactivadas com mitomicina-C-e o local de uma cultura de células de incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Depois de 48 horas de médio, aspirado, adicionar 2 ml de meio fresco e voltar a incubadora.
- Após 48 horas, adicionar 0,5 ml de meio fresco de células estaminais a cada poço e voltar a incubadora.
- Após 48 horas, em seguida alimentar as células três vezes por semana depois disso, como se segue, até grandes colónias discretas (> 50 células) aparece (dentro de 7 a 21 dias). Da primeira e segunda alimentação em cada semana (por exemplo segunda-feira e Sexta-Feira) remover aproximadamente 50% do meio e adiciona de volta a 50% em volume de meio fresco. Para uma alimentação terceiro (por exemplo, sexta-feira), aspirar todo o meio e substituir com 2 ml de meio fresco. Esta abordagem baseia-se no raciocínio de que evitar mudanças de meio completo minimiza as flutuações nas concentrações de sinais parácrinos que são secretadas para o meio de cultura de 9.
4. Picking colônia de primeira passagem
- Remover médio de colónias em poços contendo a ser passadas e adicionar meio fresco de células estaminais.
- Identificar colônias usando uma objetiva de 10x. Com o microscópio ligeiramente de-concentrado, colónias SSC na borda do poço aparecerá como homogéneas aglomerações luminosas, compostas por muitas células de 11-12 um de diâmetro, em que é difícil ou impossível de distinguir as bordas das células individuais, uma vez que as células aparecem fundidos (Figura 1A). Não-SSC colônias pode parecer mais escuro, mais granular, ou menos homogêneo, com fronteiras discerníveis (Figura 1A, encarte).
- Utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL, com o conjunto de pipetteman de 50 ul, em primeiro tomar-se a partir do meio e assim expulsar para molhar a ponta. Em seguida, deslocar o suavemente com a ponta da colónia antes de retirar rapidamente 50 ul de meio para deslocar a colónia por aspiração para dentro da ponta (Figura 1B).
- Expelir o meio contendo a colónia em um poço de uma placa de 48 poços contendo células alimentadoras inactivadas com 100 ul de meio de células estaminais (Figura 1C).
- Repita o passo4,3 e adicionar até 8 colónias para o bem mesmo sem ultrapassar 500 ul por poço.
- Repita os passos 4,3-4,5 para preparar poços da placa de 48 cavidades com colónias de passagem um CCD.
- Wells estará pronto para dividir em 7-14 dias ou depois de grandes aglomerações de até 500 células surgiram (Figura 1D).
5. Expansão subseqüente e passaging de SSCs por trituração
- Células de passagem deve ser subcultivados para alimentadores frescas após até 14 dias a uma razão de divisão de 1:2 para os primeiros três passagens e, em seguida, 01:04 - 01:06 (a cada 7 dias) depois disso, como se segue. Triturar suavemente colónias fora de um poço semi-confluentes (por exemplo, ~ 300.000 SSC / poço de placa de 6 poços), com uma ponta de pipeta ml por meio de lavagem através das células. As colónias podem ser vistas de extracção. Muita força com o fluxo de líquido causará células alimentadoras indesejados para sair também.
- Recolher as células triturados num tubo cónico e centrifugar a 300 xg durante5 min. Nota: Um passo tripsinização pode ser adicionado com segurança aqui, se desejado pelo investigador.
- Aspirar o sobrenadante e re-suspensão em meio fresco com células-tronco através de uma profunda pipetando para cima e para baixo para interromper colônias.
- SSC placa em células alimentadoras recém-preparados inativadas com mitomicina-C, como descrito na seção 1.
- Alimentar as células três vezes por semana, como se segue. Para a alimentação primeiro e segundo (por exemplo segunda-feira e Sexta-Feira) adicionar 50% em volume de meio fresco. Para uma alimentação terceiro (por exemplo, sexta-feira), aspirar todo o meio e substituir com 2 ml de meio fresco. Placas vai se tornar confluentes em 7-10 dias. As culturas devem ser constituídos por células germinativas> 98% (isto é, <1% de células somáticas contaminantes) após passagens 5-7, com base na coloração imunológica (por exemplo, utilizando o marcador de células germinativas murino GCNA) para distinguir as células germinativas de células somáticas 10. Nota: Estes métodos foram desenvolvidos de acordo com as normas e exigências estabelecidas pela Instituiçãoal Animal Care e do Comitê Uso do Weill Cornell Medical College.
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Representative Results
A aparência do tipo passagem de zero selvagem, as colónias adultas SSC depois de 7 dias é mostrado na Figura 1. Tridimensionais colónias são constituídas por uma camada de células planas ligadas aos alimentadores ou matriz extracelular underling depositados pelos alimentadores com múltiplas camadas de SSC que crescem no topo. Enquanto SSC saudáveis são brilhantemente refrangente e uniformemente 11-12 um de diâmetro, as bordas das células são difíceis de distinguir e o tamanho das colónias pode ser altamente variável, tanto no interior do poço e entre os poços preparados a partir de ratos diferentes. Visualização das colónias é auxiliado por um microscópio de fase com um mostrador digital e um plano ligeiramente de-focalizada focal, o que melhora o contraste entre as colónias altamente homogéneos SSC e células somáticas contaminantes que estão presentes em passagem precoce (0-2) culturas e fazer não formam colônias bem embalado (ver Figura 1A inset). Note-se que a morfologia das células de alimentação muda gradualmente after de comutação de DMEM/10% de meio de cultura de células-tronco, após inactivação com mitomicina-C.It É também importante notar que a suspensão de células inicial não é filtrada ou esticado, pois aglomerados residuais de células somáticas são pensados para aumentar a sobrevivência de SSC a o tempo de colocação inicial e não deve ser removido até que colónias SSC são estabelecidos. Serial passaging (> 5-7 vezes) é necessária para purificar as células germinativas de homogeneidade próximo (> 98%) e destroem células residuais somáticas. Se experiências subsequentes requerem especificamente o enriquecimento de células-tronco da população total de células germinais na cultura, então a selecção de células utilizando pérolas imunomagnéticas ou citometria de fluxo pode ser utilizado para purificação adicional, por exemplo, conter o enriquecimento de células podem ser obtidas utilizando anticorpos contra Thy1 , CD9, α6 integrina e outros 11. A identidade do SSC deve ser posteriormente confirmada usando a imunofenotipagem, a expressão do gene e, por transplante, uma vez que transplantatanálise de íons é o único meio para definitivamente avaliar a quantidade de células-tronco autênticos, funcionais 12,13.
Figura 1. Morfologia das colônias iniciais ES, testiculares células do estroma e alimentadores. Uma, Aspecto de colônias nascentes SSC ~ 5 dias após o início do cultivo. Mostra Inset contaminantes células somáticas como monócitos em uma cultura de zero passagem. Seleção B, e colheita de colônias individuais de primeira passagem (~ 14 dias) para 48 poços. A estrutura de preto é a ponta da pipeta. C, Aspecto de inativadas JK1 células alimentadoras. D, Grandes colônias anteriores a subcultura de rotina. As setas indicam colônias SSC. Barra de escala em A é 100 mm (Inset, 50 m) e no BD é de 200 m.
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Discussion
Este método para derivar SSCs adultos utilizando células adultas derivadas de testículos de alimentação é robusto e tem êxito quando comuns origens genéticas (por exemplo, FVB, C57BL6 e 129SV/C57Bl/6 mista) e diferentes cepas mutantes foram empregados 2,3,7,14. Na verdade, o microambiente criado pelo sistema de cultura é suficiente para superar algumas barreiras genéticas para manter SSC adultos in vivo (por exemplo, no caso de plzf - / - de animais) 7. Enquanto que empregamos JK1 células como alimentadores, não transformadas células testiculares somáticas adultas podem também ser usados com igual eficácia como JK1 células 2,3.
SESC foi concebido para se obter de forma eficiente a longo prazo linhas adultos SSC. Infelizmente, a elevada eficiência é obtida com uma solução de compromisso para a seguinte razão. Uma limitação notável do processo é que a omissão de uma etapa de filtragem ou esforço no momento da colocação inicial e a manipulação a que procedure envolve, o que pode afectar a sobrevivência celular, podem causar variabilidade substancial no número de células semeadas de poço para poço, o que impede a quantificação eficaz na fase inicial de formação de colónia. No entanto, ensaios quantitativos podem ser realizadas com culturas de passagem um pouco mais tarde, altura em que uma suspensão de células individuais podem ser facilmente preparadas por tripsinização padrão (> passagem 5-7).
Porque SSC adultas em cultura podem ser expandidas e mantidas indefinidamente, este protocolo permite a produção eficiente de linhas celulares que podem ser utilizados subsequentemente em uma forma similar a outros estabelecidas culturas primárias ou de linhas de células (isto é, as análises de expressão de genes e de proteínas ou expressão ectópica de um gene de interesse). No entanto, é essencial para finalmente confirmar os resultados obtidos utilizando análise de transplante como o padrão de ouro ou outro substituto ensaio validado, tal como o ensaio de formação de cachos SSC 12,15.
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Disclosures
MS recebe royalties do Weill Cornell Medical College através de uma licença de celular Biolabs, Inc. para distribuir JK1 células.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo New York State Department of Health (C026878). MS foi um New York Stem Cell Foundation Fellow-Druckenmiller. Suportado em parte pela Research Grant No. 5-AF11-571 da March of Dimes Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | - | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercapt–thanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. | |||
References
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