Summary
Une méthode simple pour obtenir et maintenir la tige spermatogonies et des lignées de cellules souches de souris adultes est présenté ici. La méthode utilise des cellules nourricières en provenance du compartiment des cellules somatiques du testicule de souris adultes. Cette technique est applicable à des souches de souris communes, y compris transgénique, knock-out, et souris knock-in.
Abstract
Spermatogonies souches et des cellules progénitrices (CSP) du testicule représentent un exemple classique de cellules souches adultes de mammifères et préserver la fertilité de près la vie de l'animal. Bien que les mécanismes précis qui régissent l'auto-renouvellement et la différenciation in vivo sont difficiles à l'étude, différents systèmes ont été développés précédemment pour propager SSC murins in vitro en utilisant une combinaison de milieux de culture spécialisées et cellules nourricières 1-3.
Dans la plupart des incursions in vitro sur la biologie des SSC ont dérivé des lignées de cellules de nouveau-nés, probablement en raison de la difficulté d'obtenir des lignées de cellules adultes 4. Toutefois, le testicule continue d'évoluer jusqu'à environ 5 semaines d'âge dans la plupart des souches de souris. Au début des années période post-natale, des changements dramatiques se produisent dans l'architecture du testicule et de la biologie à la fois somatique et les cellules spermatiques, y compris les changements dans les niveaux d'expression de cellules souches multiples liésgènes. Par conséquent, la période néonatale lignées dérivées de CSE ne peut pas totalement récapituler la biologie des SSC adultes qui persistent après le testicule adulte a atteint un état d'équilibre.
Plusieurs facteurs ont entravé la production de lignées de CSE adultes historiquement. Tout d'abord, la proportion de cellules souches fonctionnelles peuvent diminuer pendant l'âge adulte, soit en raison de facteurs intrinsèques ou extrinsèques 5,6. En outre, comme avec d'autres cellules souches adultes, il a été difficile pour enrichir SSC suffisamment partir de cellules adultes au total des testicules sans l'aide d'une combinaison de stratégies de tri immunosélection ou autres 7. Stratégies couramment utilisées comprennent l'utilisation de souris cryptorchides comme source de cellules du donneur en raison d'un ratio plus élevé de cellules souches à d'autres types cellulaires 8. Sur la base de l'hypothèse que l'élimination des cellules somatiques de la culture initiale perturbe les interactions avec la niche de cellules souches qui sont essentiels pour la survie SSC, nous avons déjà développé des méthodes pour calculer l adulteines qui ne nécessitent pas immunosélection ou des donateurs cryptorchides mais plutôt employer l'enrichissement de série des SSC de la culture, ci-après dénommés SESC 2,3.
La méthode décrite ci-dessous implique une procédure simple pour dériver adultes lignes SSC en dissociant l'adulte donneur de tubes séminifères, suivie par dépôt de cellules sur les départs constitués d'une ligne de cellules stromales testiculaire (JK1) 3. Grâce passage en série, fortement adhérent, contaminant les cellules non germinales sont dépourvues de la culture à l'enrichissement concomitant des SSC. Cultures produites de cette manière contiennent un mélange de spermatogonies à différents stades de différenciation, qui contiennent des SSC, basée sur le long terme la capacité d'auto-renouvellement. Le point crucial de la méthode SESC est qu'il permet SSC pour rendre le passage difficile de l'auto-renouvellement in vivo à long terme d'auto-renouvellement in vitro dans un micro-environnement radicalement différent, produit à long terme des lignes SSC, libre de contaminationcellules somatiques, et permet ainsi une manipulation expérimentale subséquente des SSC.
Protocol
1. Préparation de cellules nourricières
Notez que tous les réactifs décrits ci-dessous doivent être préparés de manière stérile (voir les tableaux 1 et 2). Ce protocole utilise la lignée cellulaire JK1 (Cell Biolabs, Inc, catalogue # ABC-315) que les mangeoires qui est un dérivé de transformer des cellules adultes de souris somatiques testiculaires et a été décrit ailleurs 3. Notez également que toutes les procédures sur les animaux doit être effectuée conformément aux directives et règlements institutionnels.
- JK1 cellules peuvent être maintenues en culture et utilisées avec succès comme dispositifs d'alimentation à passage 39. Culture JK1 cellules dans une boîte de 100 mm de culture cellulaire (BD Falcon, catalogue n ° 353003) avec 10 ml de milieu de croissance d'alimentation stérilisée par filtration (DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal [FBS], 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques). Lorsque la culture atteint la confluence de 95%, divisez les cellules 1:06 -1:10 rapport.
- Éliminer le milieu de confluence JK1 mono cellules nourricièrescouche.
- Laver couche de cellules une fois avec du PBS sans calcium ni magnésium.
- Ajouter préchauffé trypsine / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM d'EDTA; Cellgro Corning, catalogue n ° 25-051-CI), et incuber à 37 ° C pendant 5-10 min.
- Inactiver la trypsine avec un volume égal de milieu de croissance chargeur. Recueillir des cellules et centrifuger à 300 xg pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance chargeur.
- Pré-manteau plaques multi-puits culture cellulaire en ajoutant suffisamment de 0,4% solution de gélatine pour couvrir le puits et retirer au bout de 5 min à température ambiante.
- Plaque ~ 250 cellules par mm 2 de gélatine revêtu plaque de culture cellulaire (par exemple le format 48-puits ou 6-puits). Incuber la culture à 37 ° C pendant 16 à 24 heures.
- Retirer milieu de culture à partir de puits. ATTENTION: Pour désactiver la croissance des cellules, ajouter une nouvelle solution de mitomycine C à 10 pg / ml dilué dans du DMEM à chaque puits (par exemple, 200 pl / puits d'une plaque de 48 puits). Mitomycine C est toxique. Manipulez et jetez-le avec soin. Incuber à37 ° C pendant 4 h.
- Retirer la mitomycine C solution de cellules. Laver 3 fois avec du DMEM avant des cellules souches de placage.
- Retirer du DMEM à partir de cellules nourricières puits et ajouter suffisamment de support de cellules souches (100 pl / puits d'une plaque 48 puits, voir le tableau 3) pour éviter la dessiccation des mangeoires au cours de passages. Ajouter SSC Le même jour, tel que décrit ci-dessous dans les sections 3.1 ou 3.4, avec des tailles indiquées de puits contenant des mangeoires.
2. Dissociation de la souris testicule tissu pour obtenir des cellules germinales des bailleurs de fonds
- Testicules de souris adultes récolte de façon stérile et stocker temporairement les testicules dans un plat recouvert de Petri (sans ajout de liquide). Le plat doit immédiatement placé sur la glace pour empêcher la dessication et de maintenir la viabilité des cellules.
- En utilisant une pince fine stériles et un ciseau bien dans une hotte de culture cellulaire, faire une incision transversale dans la tunique albuginée sans complètement sectionnant le testicule (c.-à-cut ~ ½ - ¾ à distance through) et utiliser une pince pour faire sortir les tubes séminifères dans un coin de la plaque; tunique de défausse et tissus ci-joint. Gardez la plaque sur la glace tout au long de garder les tissus réfrigérés, et sauvegardent ainsi leur intégrité et prévenir l'évaporation.
- Rapidement émincer tubules avec des ciseaux à ressort fines au moins 3 min par les testicules, tout en gardant la plaque sur la glace.
- Ramassez les fragments de tubules dans un tube conique de 50 ml et laver à ~ 40 ml de sérum de veau glacée PBS / 1% d'albumine.
- Centrifuger à 60 g pendant 10 minutes pour séparer les fragments de tubules de spermatozoïdes et de débris. Rejeter le surnageant.
- Dans un tube de 15 ml conique, remettre en suspension le culot dans 3 ml par de testicule préchauffé tampon de dissociation (DMEM, la trypsine 0,05%, 0,03% collagénase de type I, 80% d'U / ml de DNAse I et la sérum albumine bovine 0,5; Voir Tableau 2 pour des détails plus spécifiques de tampon de dissociation).
- Placer le tube conique horizontalement dans un support en un ensemble agitateur à 150 tours par minute à 37 ° C pendant 15 min afin de maximiser unegitation.
- Centrifuger à 60 g pendant 10 minutes pour séparer les cellules individuelles de morceaux non dissociées.
- Enregistrer les morceaux culot contenant jusqu'à l'étape suivante. Recueillir le surnageant de l'étape 2.8 et ajouter 3 ml DMEM/10% de sérum de veau foetal à neutraliser tampon de dissociation. Placer le tube sur la glace temporairement.
- Répétez l'étape 2,6 à 2,7 avec le culot de l'étape sauvé 2,9 à re-digérer les morceaux restants après l'étape 2.8.
- Ajouter un volume égal de DMEM/10% de FBS pour neutraliser tampon de dissociation.
- Suspension de l'étape recombinent avec suspension cellulaire 2,11 sauvegardé à l'étape 2.9. Centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
- Resuspendre le culot dans un milieu de cellules souches dans un volume de 16 ml par paire de testicules (voir le tableau 3).
3. Placage de suspension de cellules testiculaires
- Planche 2 ml de suspension cellulaire par puits dans des cellules de 6 puits plaque d'alimentation contenant mitotiquement-inactivé par la mitomycine C et placer dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ans ° C dans 5% de CO 2.
- Après 48 heures, moyen aspiration, ajouter 2 ml de milieu frais et revenir à l'incubateur.
- Après 48 heures, on ajoute 0,5 ml de milieu frais de cellules souches dans chaque puits et retourner à l'incubateur.
- Après 48 heures, puis nourrir les cellules trois fois par semaine par la suite jusqu'à ce que suit grandes colonies discrètes (> 50 cellules) semble (dans les 7 à 21 jours). Pour la première et la deuxième nourrir chaque semaine (par exemple le lundi et le mercredi) supprimer ~ 50% de la moyenne et rajouter 50% en volume de milieu frais. Pour l'alimentation du tiers (par exemple vendredi), aspirer tout moyen et remplacez-le par 2 ml de milieu frais. Cette approche est basée sur l'idée que l'évitement des changements de milieu complet minimise les fluctuations dans les concentrations de signaux paracrines qui sont sécrétées dans le milieu de culture 9.
4. Cueillette colonie de Premier Passage
- Retirer moyen de puits contenant des colonies à être repiquées et ajouter du milieu frais sur les cellules souches.
- Identifier les colonies en utilisant un objectif 10x. Avec le microscope légèrement défocalisé, les colonies SSC au bord du puits apparaît comme homogènes amas brillants, composées de nombreuses cellules 11-12 pm de diamètre, dans laquelle il est difficile, voire impossible, de discerner les bordures des cellules individuelles, puisque les cellules apparaissent fusionnés (figure 1A). Non-SSC colonies peuvent apparaître plus foncées, plus granulaire, ou moins homogène, avec des frontières discernables (figure 1A, en médaillon).
- En utilisant une pointe de pipette 200 ul, avec l'ensemble pipetteman à 50 pi, tout d'abord prendre moyennes du puits et expulser pour mouiller la pointe. Ensuite, pousser gentiment la colonie avec la pointe avant de retirer rapidement 50 ul de milieu de déloger la colonie par aspiration dans la pointe (figure 1B).
- Expulser le milieu contenant la colonie dans un puits d'une plaque à 48 puits contenant des cellules nourricières inactivées avec 100 ul de milieu de cellules souches (figure 1C).
- Répétez l'étape4.3 et ajouter jusqu'à 8 colonies au même puits sans excéder 500 pi par puits.
- Répétez les étapes 4,3 à 4,5 pour préparer d'autres puits de la plaque de 48 puits avec des colonies de passage SSC un.
- Wells sera prêt à diviser en 7-14 jours ou après de grosses touffes de jusqu'à 500 cellules ont vu le jour (figure 1D).
5. L'expansion ultérieure et repiquage des SSC par trituration
- Cellules à passage ne doit être repiquée sur mangeoires frais après un maximum de 14 jours à un rapport de division de 1:2 pour les 3 premiers passages, puis 01 heures 04-01:06 (tous les 7 jours) par la suite comme suit. Doucement triturer colonies hors d'un puits semi-confluente (par exemple ~ 300.000 SSC / puits de 6-puits) avec une pointe de pipette 1 ml de milieu de lavage à travers les cellules. Les colonies peuvent être vus se détacher. Trop de force avec le courant de liquide pourrait causer des cellules nourricières indésirables à se détacher aussi.
- Recueillir des cellules triturées dans un tube conique et centrifuger à 300 xg pendant5 min. Remarque: Une étape trypsination peuvent être ajoutés en toute sécurité ici si désiré par l'investigateur.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans un milieu de cellules souches frais en fond de pipetage de haut en bas de perturber les colonies.
- SSC plaque sur des cellules nourricières inactivées fraîchement préparés avec de la mitomycine-C, comme décrit dans la section 1.
- Nourrir les cellules trois fois par semaine comme suit. Pour l'alimentation premier et le deuxième (par exemple le lundi et le mercredi) ajouter 50% en volume de milieu frais. Pour l'alimentation du tiers (par exemple vendredi), aspirer tout moyen et remplacez-le par 2 ml de milieu frais. Plaques deviendra confluente dans les 7-10 jours. Les cultures doivent être composé de cellules germinales> 98% (c.-à <1% contaminants cellules somatiques) après des passages 5-7, basé sur immunomarquage (par exemple en utilisant la souris sur les cellules germinales marqueur GCNA) pour distinguer les cellules germinales à partir de cellules somatiques 10. Remarque: Ces méthodes ont été développées dans le respect des règlements et des exigences fixées par l'institutionprotection des animaux et le Comité al utilisation au Weill Cornell Medical College.
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Representative Results
L'apparition de passage à zéro de type sauvage, adultes colonies SSC après 7 jours est illustré à la figure 1. Tridimensionnelles colonies sont constituées d'une couche de cellules plates fixées à des dispositifs d'alimentation ou de la matrice extracellulaire subalterne déposés par les dispositifs d'alimentation avec des couches multiples de SSC croissance sur le dessus. Bien SSC sains sont brillamment réfringente et uniformément de 11 à 12 um de diamètre, les bordures de cellule sont difficiles à distinguer et à la taille des colonies peuvent être très variables, tant à l'intérieur du puits et entre puits préparés à partir de différentes souris. Visualisation des colonies est aidé par un microscope de phase avec un affichage digital et un plan légèrement de-ciblée focale, ce qui accentue le contraste entre les colonies de PVC très homogènes et contaminent les cellules somatiques qui sont présents dans le passage précoce (0-2) et les cultures ne pas former des colonies serrées (voir la figure 1A encadré). Notez que la morphologie des cellules nourricières va changer progressivement after le passage d'DMEM/10% pour endiguer milieu de culture cellulaire après inactivation par la mitomycine-C.It est également important de noter que la suspension cellulaire initiale n'est pas filtrée ou tendues, en raison des amas résiduels de cellules somatiques sont pensés pour améliorer la survie des SSC à moment de l'étalement initial et ne doit pas être retiré tant que colonies SSC sont établis. Passage en série (> 5-7 fois) est nécessaire pour purifier les cellules germinales à l'homogénéité de (> 98%) et épuisent résiduels des cellules somatiques. Si les expériences ultérieures exigent spécifiquement l'enrichissement des cellules souches de la population totale de cellules germinales dans la culture, la sélection de cellules en utilisant des perles immunomagnétiques ou cytométrie en flux peut être utilisée pour une purification supplémentaire, par exemple, provenir d'enrichissement cellulaire peut être obtenu en utilisant des anticorps contre Thy1 , CD9, α6 des intégrines et d'autres 11. L'identité des SSC devrait être confirmée ultérieurement en utilisant immunophénotypage, l'expression des gènes, et par la transplantation, car transplantatl'analyse des ions est le seul moyen de définitivement évaluer la quantité de cellules souches authentiques, fonctionnels 12,13.
Figure 1. Morphologie des colonies SSC début, testiculaires des cellules stromales et les mangeoires. A, Aspect des colonies naissantes SSC ~ 5 jours après l'étalement initial. En médaillon, monocytes contaminants comme les cellules somatiques dans une culture passage par zéro. B, de sélection et de cueillette des colonies individuelles pour premier passage (~ 14 jours) en plaques de 48 puits. La structure noire est la pointe de la pipette. C, Apparence de inactivés JK1 cellules nourricières. D, grandes colonies avant repiquage systématique. Les flèches indiquent les colonies de la SSC. La barre d'échelle en A est de 100 um (en médaillon, 50 um) et BD se trouve à 200 um.
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Discussion
Cette méthode pour dériver SSC adultes utilisant des cellules nourricières testicule adulte dérivés est robuste et a réussi quand communs origines génétiques (par exemple FVB, C57BL6 et 129SV/C57Bl/6 mixte) et différentes souches mutantes ont été utilisées 2,3,7,14. En fait, le micro-environnement créé par le système de culture est suffisante pour surmonter certains des obstacles génétiques au maintien SSC adultes in vivo (par exemple dans le cas de PLZF - / - animaux) 7. Alors que nous employons JK1 cellules que des mangeoires, non transformées adultes testiculaires des cellules somatiques peuvent également être utilisés avec la même efficacité que les cellules JK1 2,3.
SESC a été conçu pour obtenir efficacement à long terme des adultes lignes SSC. Malheureusement, la grande efficacité est obtenue avec un compromis pour la raison suivante. Une limitation notable de la procédure est que l'omission d'une étape de filtrage ou de forcer au moment de placage initiale et la manipulation que le procedure implique, ce qui peut affecter la survie des cellules, peut entraîner une variabilité importante du nombre de cellules plaquées d'un puits à qui empêche une quantification efficace au stade de la formation de colonies initiale. Cependant, les analyses quantitatives peuvent être réalisées avec des cultures passage un peu plus tard au cours de laquelle une suspension cellulaire unique peuvent être facilement préparés par traitement à la trypsine standard (> passage 5-7).
Parce SSC adultes dans la culture peut être développée et maintenue presque indéfiniment, ce protocole permet la production efficace de lignées cellulaires qui peuvent être utilisés par la suite de façon similaire à d'autres cultures établies primaires ou de lignées cellulaires (c.-à-analyses d'expression génique et protéique ou l'expression ectopique de un gène d'intérêt). Néanmoins, il est essentiel pour finalement confirmer les résultats de l'analyse en utilisant la transplantation comme l'étalon-or ou un autre test de substitution validées, tels que l'essai SSC formation d'amas 12,15.
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Disclosures
MS reçoit des redevances d'Weill Cornell Medical College grâce à une licence to Cell Biolabs, Inc pour distribuer JK1 cellules.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le ministère État de New York de la Santé (C026878). MS était à New York Stem Cell Foundation Fellow Druckenmiller. Soutenu en partie par subvention de recherche n ° 5 FY11-571 de la Mars of Dimes Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | - | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercapt–thanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. | |||
References
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