Seriel Berigelse af spermatogonstamceller Stem og progenitorceller (SSCs) i Kultur for Udledning af Langsigtede voksen mus SSC Lines

Summary

En simpel metode til udledning og opretholde spermatogonier stamceller og stamcelle linier fra voksne mus er vist her. Fremgangsmåden anvender fødeceller stammer fra somatiske celler rum i den voksne mus testis. Denne teknik kan anvendes til almindelige musestammer, herunder transgene, knock-out, og banke-i mus.

Abstract

Spermatogonier stamceller og progenitorceller (SSCs) af testis repræsenterer et klassisk eksempel på voksne mammale stamceller og bevare fertiliteten for næsten hele dyrets levetid. Mens de præcise mekanismer, der styrer selvfornyelse og differentiering in vivo er udfordrende at undersøgelsen har forskellige systemer blevet udviklet tidligere at udbrede murine SSCs in vitro ved hjælp af en kombination af specialiserede dyrkningsmedier og fødeceller ^1-3.

De fleste in vitro strejftog i biologi SSCs er afledt cellelinier fra nyfødte, muligvis på grund af vanskelighederne med at få voksne cellelinier ^4. Imidlertid testis fortsætter med at modne, indtil ~ 5 uger gamle i de fleste musestammer. I den tidlige post-natale periode, forekommer dramatiske ændringer i arkitekturen af ​​testiklerne og i biologi både somatiske og spermatogene celler, herunder ændringer i ekspressionsniveauer af adskillige stamcelle-relateredegener. Derfor kan neonatally-afledte SSC linier ikke fuldt rekapitulere biologi voksne SSCs, der resterer, efter at voksen testikel har nået en stabil tilstand.

Flere faktorer har forhindret produktionen af ​​voksne SSC linjer historisk. For det første kan andelen af funktionelle stamceller falde i voksenalderen, enten på grund af indre eller ydre faktorer ^5,6. Som med andre voksne stamceller, har det været vanskeligt at berige SSCs tilstrækkeligt fra samlede voksne testikulære celler uden anvendelse af en kombination af immunselektion eller andre sortering strategier ^7. Almindeligt anvendte strategier indbefatter anvendelsen af kryptorkide mus som en kilde til donorceller som følge af et højere forhold mellem stamceller til andre celletyper ^8. Baseret på den hypotese, at fjernelsen af ​​somatiske celler fra den oprindelige kultur forstyrrer interaktioner med stamceller niche, som er afgørende for SSC overlevelse, vi tidligere udviklet metoder til at udlede voksen lines, der ikke kræver immunselektion eller kryptorkide donorer, men snarere ansætte seriel berigelse af SSCs i kultur, i det følgende benævnt SESC ^2,3.

Den nedenfor beskrevne metode indebærer en enkel procedure til at aflede voksne SSC linier ved at dissociere voksen donor sædkanalerne, efterfulgt af udpladning af celler på fødere bestående af en testikel stromacelle line (JK1) ^3. Gennem seriel passage, stærkt klæbende, kontaminerende non-kønsceller er opbrugt fra kulturen med samtidig berigelse af SSCs. Kulturer er fremstillet på denne måde indeholder en blanding af spermatogonier på forskellige stadier af differentiering, som indeholder SSCs, baseret på langsigtet selvfornyelsespotentiale formåen. Det centrale i SESC metode er, at det gør det muligt SSCs at gøre den vanskelige overgang fra selvfornyelse in vivo til langsigtet selvfornyelse in vitro i en radikalt anderledes mikromiljø, producerer langsigtede SSC linjer, fri for kontaminerendesomatiske celler, og hvorved efterfølgende eksperimentel manipulation af SSCs.

Protocol

1. Fremstilling af fødeceller

Bemærk, at alle reagenser er beskrevet nedenfor bør udarbejdes i steril måde (se tabel 1 og 2). Denne protokol anvender JK1 cellelinie (Cell Biolabs, Inc., katalog # CBA-315) som fødere, som er en transformeret derivat af voksne mus testikulære somatiske celler og er blevet beskrevet andetsteds ^3. Bemærk også, at alle dyreforsøg skal udføres i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier og regler.

1. JK1 celler kan opretholdes i kultur og anvendt med succes som foderautomater op til passage 39. Kultur JK1 celler i en 100 mm cellekultur skål (BD Falcon, katalog nr. 353003) med 10 ml filtersteriliseret feeder vækstmedium (DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum [FBS], 2 mM L-glutamin og antibiotika). Når kulturen når 95% konfluens, split cellerne 01:06 -1:10 ratio.
2. Fjern medium fra konfluente JK1 feeder cell monolag.
3. Vask cellelag gang med PBS uden calcium og magnesium.
4. Tilsættes forvarmet trypsin / EDTA, 1 x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, katalog # 25-051-Cl), og der inkuberes ved 37 ° C i 5-10 min.
5. Inaktivere trypsin med et tilsvarende volumen af ​​feeder vækstmedium. Indsamle celler og centrifugeres ved 300 x g i 5 min. Resuspendere cellerne i føder vækstmedium.
6. Vedhæftningslag multi-brønds cellekultur-plader ved at tilsætte nok 0,4% gelatineopløsning at dække godt og fjerne efter 5 min ved stuetemperatur.
7. Plade ~ 250 celler pr ^mm2 i gelatine-coatede cellekultur plade (f.eks 48-brønd eller 6-brønds format). Inkuber kulturen ved 37 ° C i 16 til 24 timer.
8. Fjern dyrkningsmedium fra brøndene. ADVARSEL: For at inaktivere cellevækst, tilsættes en frisk opløsning af mitomycin-C ved 10 ug / ml fortyndet i DMEM til hver brønd (fx 200 gl / brønd til en 48 brønds plade). Mitomycin-C er giftigt. Håndteres og bortskaffes den med omhu. Inkuber ved37 ° C i 4 timer.
9. Fjern mitomycin-C opløsning fra cellerne. Vask 3 gange med DMEM før udpladning stamceller.
10. Fjern DMEM fra fødeceller brønde, og der tilsættes tilstrækkeligt stamcellemedium (100 gl / brønd af en 48 brønds plade, se tabel 3) for at forhindre udtørring af føderne under passage. Tilføj SSCs samme dag, som beskrevet nedenfor i afsnit 3,1 eller 3,4, ved hjælp af angivne størrelser af brønde indeholdende foderautomater.

2. Dissociation af Mouse Testis Tissue får du donor kønsceller

1. Harvest voksne musetestiklerne i steril måde og midlertidigt lagre testiklerne i en overdækket petriskål (uden væske tilføjet). Skålen skal anbringes umiddelbart på is for at forhindre udtørring og bevare cellelevedygtighed.
2. Med sterile fine tænger og en fin saks i en cellekultur hætte, lave et tværgående indsnit i tunica albuginea uden fuldstændigt transecting testis (dvs. cut ~ ½ - ¾ afstand through) og bruge tang til at presse ud sædkanalerne i et hjørne af pladen, udsmid tunica og fastgjort væv. Hold plade på is i hele for at holde væv kølet, og dermed bevare sin integritet og forebygge fordampning.
3. Hurtigt hakke tubuli med fine forår saks mindst 3 min pr testiklerne, samtidig med at pladen på is.
4. Indsamle tubulus fragmenter i et 50 ml konisk rør og vaskes i -40 ml afkølet PBS / 1% bovint serumalbumin.
5. Centrifuger ved 60 x g i 10 minutter for at adskille tubulære fragmenter fra spermatozoer og nedbrudt materiale. Supernatanten kasseres.
6. I et 15 ml konisk rør, pellet resuspenderes i 3 ml per testis af forvarmet dissociation buffer (DMEM, 0,05% trypsin, 0,03% collagenase type I, 80 U / ml DNAse I og 0,5% bovint serumalbumin, se tabel 2 for mere specifikke oplysninger om dissociation buffer).
7. Anbring konisk rør vandret i et stativ i et rysteapparat indstillet til 150 omdrejninger per minut ved 37 ° C i 15 minutter for at maksimere engitation.
8. Spin ned ved 60 x g i 10 minutter til adskillelse af enkelte celler fra dissocierede stykker.
9. Save the pellet indeholdende klumper indtil næste trin. Samle bundfald fra trin 2,8, og der tilsættes 3 ml DMEM/10% føtalt bovint serum til at neutralisere dissociation buffer. Anbring røret på is midlertidigt.
10. Gentag trin fra 2,6 til 2,7 med den gemte pellet fra trin 2,9 til re-fordøje bidder tilbage efter trin 2,8.
11. Tilsættes samme mængde af DMEM/10% FBS at neutralisere dissociation buffer.
12. Rekombinerer suspension fra trin 2,11 med gemte cellesuspension fra trin 2,9. Centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g.
13. Resuspender pellet i stamcellemedium i et volumen på 16 ml pr par testikler (se tabel 3).

3. Plating af Testikulær cellesuspension

1. Plade 2 ml cellesuspension pr brønd i en 6-brønds plade, der indeholder fødeceller mitotisk-inaktiveret med mitomycin-C og anbringes i en cellekultur inkubator ved 37 ° C i _5% CO2.
2. Efter 48 h, aspireringsstilling medium, tilsættes 2 ml frisk medium og vende tilbage til inkubatoren.
3. Efter 48 timer tilsættes 0,5 ml frisk stamcelle medium til hver brønd og vende tilbage til inkubatoren.
4. Efter 48 timer fodre efterfølgende celler tre gange om ugen derefter som følger indtil store, diskrete kolonier (> 50 celler) vises (inden for 7 til 21 dage). For første og anden fodring hver uge (fx mandag og onsdag) fjern ~ 50% af mediet og tilføje tilbage 50% af volumen frisk medium. For tredje fodring (f.eks fredag), aspirere alle medium og erstatte med 2 ml frisk medium. Denne fremgangsmåde er baseret på det rationale, undgåelse af komplet medium ændringer minimerer udsving i koncentrationen af parakrine signaler, der udskilles i dyrkningsmediet ^9.

4. Colony Picking for første passage

1. Fjern mediet fra brønde, der indeholdt kolonier, der skal passeret, og der tilsættes frisk stamcellemedium.
2. Identificere kolonier under anvendelse af en 10 x objektiv. Med mikroskopet let de-fokus, vil SSC kolonier på kanten af ​​brønden vist som homogene lyse klumper, der består af mange 11-12 um diameter celler, hvor det er vanskeligt eller umuligt at skelne de enkelte cellekanter, da cellerne vises smeltes sammen (figur 1A). Ikke-SSC kolonier kan virke mørkere, mere kornet eller mindre homogent, med mærkbare grænser (figur 1A, indsat).
3. Under anvendelse af en 200 pl pipettespids, med pipetteman sat til 50 pi, først optager medium fra brønden og uddrive at befugte spidsen. Derefter forsigtigt skubbe koloni med spidsen før hurtigt at trække 50 ul medium at løsne kolonien ved sugning ind i spidsen (figur 1 B).
4. Udvise medium indeholdende kolonien i en brønd i en 48-brønds plade indeholdende inaktiverede fødeceller med 100 ul stamcellemedium (figur 1C).
5. Gentag trin4,3 og tilføje op til 8 kolonier til den samme godt uden at overskride 500 pi per brønd.
6. Gentag trin fra 4,3 til 4,5 for at forberede yderligere brønde i 48 brønds plade med passage en SSC kolonier.
7. Brønde vil være klar til at opdele i 7-14 dage eller efter store klumper på op til 500 celler opstået (figur 1D).

5. Efterfølgende udvidelse og passage af SSCs ved triturering

1. Celler ved passage man skal videredyrkes på friske foderautomater efter op til 14 dage ved et split forhold på 1:2 for de første 3 passager og derefter fra 1:04 til 1:06 (hver 7. dag) derefter som følger. Forsigtigt tritureres kolonier ud for en semi-konfluent godt (f.eks ~ 300.000 SSCs / brønd på 6-brønds plade) med en 1 ml pipettespids ved vask medium hen over cellerne. Kolonier kan ses afmontering. For stor kraft med strømmen af ​​væske vil forårsage uønskede fødeceller at komme ud for.
2. Saml tritureret celler i et konisk rør og centrifugeres ved 300 x g i5 min. Bemærk: En trypsinisering trin kan sikkert sættes her, hvis det ønskes af investigator.
3. Aspirere supernatanten og resuspender i frisk stamcellemedium ved grundig pipettering op og ned for at forstyrre kolonier.
4. Plate SSCs på frisklavet fødeceller inaktiveret med mitomycin-C som beskrevet i afsnit 1.
5. Foder cellerne tre gange om ugen som følger. For første og anden fodring (f.eks mandag og onsdag) tilsættes 50% efter volumen af frisk medium. For tredje fodring (f.eks fredag), aspirere alle medium og erstatte med 2 ml frisk medium. Pladerne bliver sammenflydende i 7-10 dage. Kulturer bør bestå af> 98% kimceller (dvs. <1% kontaminerende somatiske celler) efter 5-7 passager, på grundlag af immunfarvning (fx ved hjælp af murine kimcelle markør GCNA) at skelne kimceller fra somatiske celler ^10. Bemærk: Disse metoder blev udviklet i overensstemmelse med regler og krav, der er fastsat af institutionenal Animal Care og brug Udvalg på Weill Cornell Medical College.

Representative Results

Fremkomsten af passagen nul vildtype, er voksne SSC kolonier efter 7 dage i figur 1 viste. Tredimensionale kolonier består af et lag af flade celler knyttet til foderautomater eller slave ekstracellulær matrix deponeret af føderne med flere lag af SSCs vokser på toppen. Mens sunde SSCs er klart refraktile og ensartet 11-12 um diameter, cellekanterne er vanskelige at adskille og størrelsen af ​​kolonierne kan være meget variabel, både inden i brønden og mellem brønde fremstillet ud fra forskellige mus. Visualisering af kolonierne er støttet af en fase-mikroskop med et digitalt display og en let de-fokuseret fokusplan, som forøger kontrasten mellem yderst homogene SSC kolonier og kontaminerende somatiske celler, som findes i tidlig passage (0-2) kulturer og gøre ikke dannes tætpakkede kolonier (se figur 1A indsat). Bemærk, at morfologien af ​​feeder-celler vil ændre sig gradvist ofter skift fra DMEM/10% at dæmme cellekulturmedium efter inaktivering med mitomycin-C.It er også vigtigt at bemærke, at den oprindelige cellesuspension ikke filtreres eller belastet, fordi resterende klumper af somatiske celler menes at fremme overlevelse af SSCs på når den første udpladning og bør ikke fjernes før SSC kolonier er etableret. Seriel passage (> 5-7 gange) for at oprense kimceller til næsten homogenitet (> 98%) og nedbryder resterende somatiske celler. Hvis efterfølgende eksperimenter specifikt kræver berigelse af stamceller fra den samlede population af kimceller i kulturen og derefter celleselektion med immunomagnetiske perler eller flowcytometri kan anvendes for yderligere oprensning, for eksempel celle berigelse stamceller kan opnås under anvendelse af antistoffer mod Thy1 , CD9, α6 integrin og andre ^11. Identiteten af ​​SSCs skal efterfølgende bekræftes ved anvendelse immunophenotyping, genekspression og ved transplantation, eftersom transplantation-analyse er det eneste middel til definitivt at vurdere mængden af autentiske, funktionelle stamceller ^12,13.

Figur 1. Morfologi af tidlige SSC kolonier, testikulære stromaceller og foderautomater. A, Udseende af spirende SSC kolonier ~ 5 dage efter indledende udpladning. Indpresningsdybde shows kontaminerende monocyt-lignende somatiske celler i en passage nul kultur. B, udvælgelse og plukning af individuelle kolonier for første passage (~ 14 dage), i 48-brønds plader. Den sorte struktur er pipettespidsen. C, Udseende af inaktiverede JK1 fødeceller. D, Store kolonier før rutinemæssig subkultivering. Pile angiver SSC kolonier. Målestokken i A er 100 um (indsat, 50 um) og i BD er 200 um.

Discussion

Denne metode til at udlede voksne SSCs på voksne testis-afledte fødeceller er robust og det er lykkedes, når de fælles genetiske baggrunde (f.eks FVB, C57BL6 og blandet 129SV/C57Bl/6) og forskellige mutantstammer var ansat ^2,3,7,14. Faktisk er mikromiljøet skabt af dyrkningssystemet tilstrækkeligt til at overvinde nogle af de genetiske barrierer for at opretholde voksne SSCs in vivo (fx i tilfælde af plzf ^{- / -} dyr) ^7. Mens vi beskæftiger JK1 celler som fødere, kan ikke-transformerede voksne testikulære somatiske celler også anvendes med samme effektivitet som JK1 celler ^2,3.

SESC er designet til effektivt at opnå langvarige voksne SSC linjer. Desværre er den høje effektivitet opnået med en afvejning af følgende grunde. En bemærkelsesværdig begrænsning af proceduren er, at udeladelsen af ​​en filtrering eller belaste trin på tidspunktet for første udpladning og manipulation at procedure indebærer, hvilket kan påvirke celleoverlevelse, kan forårsage betydelig variation i celleantal udpladet fra brønd til brønd, hvilket forhindrer en effektiv mængdebestemmelse på tidspunktet for indledende kolonidannelse. Imidlertid kan kvantitative assays udføres med lidt senere passage kulturer, på hvilket tidspunkt en enkelt cellesuspension kan let fremstilles ved standard-trypsinisering (> passage 5-7).

Fordi voksne SSCs i kultur kan udvides og opretholdes næsten i det uendelige, denne protokol muliggør effektiv produktion af cellelinjer, der kan anvendes efterfølgende på en lignende måde med andre etablerede primære kulturer eller cellelinier (dvs. gen og proteinekspression analyser eller ektopisk ekspression af et gen af ​​interesse). Ikke desto mindre er det vigtigt at sidste ende bekræfte resultater ved hjælp af transplantation analyse som den gyldne standard eller en anden valideret surrogat-assay, såsom SSC klyngedannelsen assay ^12,15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	-
Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercapt–thanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
Table 3. Stem cell medium
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.