Une méthode simple pour obtenir et maintenir la tige spermatogonies et des lignées de cellules souches de souris adultes est présenté ici. La méthode utilise des cellules nourricières en provenance du compartiment des cellules somatiques du testicule de souris adultes. Cette technique est applicable à des souches de souris communes, y compris transgénique, knock-out, et souris knock-in.
Spermatogonies souches et des cellules progénitrices (CSP) du testicule représentent un exemple classique de cellules souches adultes de mammifères et préserver la fertilité de près la vie de l'animal. Bien que les mécanismes précis qui régissent l'auto-renouvellement et la différenciation in vivo sont difficiles à l'étude, différents systèmes ont été développés précédemment pour propager SSC murins in vitro en utilisant une combinaison de milieux de culture spécialisées et cellules nourricières 1-3.
Dans la plupart des incursions in vitro sur la biologie des SSC ont dérivé des lignées de cellules de nouveau-nés, probablement en raison de la difficulté d'obtenir des lignées de cellules adultes 4. Toutefois, le testicule continue d'évoluer jusqu'à environ 5 semaines d'âge dans la plupart des souches de souris. Au début des années période post-natale, des changements dramatiques se produisent dans l'architecture du testicule et de la biologie à la fois somatique et les cellules spermatiques, y compris les changements dans les niveaux d'expression de cellules souches multiples liésgènes. Par conséquent, la période néonatale lignées dérivées de CSE ne peut pas totalement récapituler la biologie des SSC adultes qui persistent après le testicule adulte a atteint un état d'équilibre.
Plusieurs facteurs ont entravé la production de lignées de CSE adultes historiquement. Tout d'abord, la proportion de cellules souches fonctionnelles peuvent diminuer pendant l'âge adulte, soit en raison de facteurs intrinsèques ou extrinsèques 5,6. En outre, comme avec d'autres cellules souches adultes, il a été difficile pour enrichir SSC suffisamment partir de cellules adultes au total des testicules sans l'aide d'une combinaison de stratégies de tri immunosélection ou autres 7. Stratégies couramment utilisées comprennent l'utilisation de souris cryptorchides comme source de cellules du donneur en raison d'un ratio plus élevé de cellules souches à d'autres types cellulaires 8. Sur la base de l'hypothèse que l'élimination des cellules somatiques de la culture initiale perturbe les interactions avec la niche de cellules souches qui sont essentiels pour la survie SSC, nous avons déjà développé des méthodes pour calculer l adulteines qui ne nécessitent pas immunosélection ou des donateurs cryptorchides mais plutôt employer l'enrichissement de série des SSC de la culture, ci-après dénommés SESC 2,3.
La méthode décrite ci-dessous implique une procédure simple pour dériver adultes lignes SSC en dissociant l'adulte donneur de tubes séminifères, suivie par dépôt de cellules sur les départs constitués d'une ligne de cellules stromales testiculaire (JK1) 3. Grâce passage en série, fortement adhérent, contaminant les cellules non germinales sont dépourvues de la culture à l'enrichissement concomitant des SSC. Cultures produites de cette manière contiennent un mélange de spermatogonies à différents stades de différenciation, qui contiennent des SSC, basée sur le long terme la capacité d'auto-renouvellement. Le point crucial de la méthode SESC est qu'il permet SSC pour rendre le passage difficile de l'auto-renouvellement in vivo à long terme d'auto-renouvellement in vitro dans un micro-environnement radicalement différent, produit à long terme des lignes SSC, libre de contaminationcellules somatiques, et permet ainsi une manipulation expérimentale subséquente des SSC.
Cette méthode pour dériver SSC adultes utilisant des cellules nourricières testicule adulte dérivés est robuste et a réussi quand communs origines génétiques (par exemple FVB, C57BL6 et 129SV/C57Bl/6 mixte) et différentes souches mutantes ont été utilisées 2,3,7,14. En fait, le micro-environnement créé par le système de culture est suffisante pour surmonter certains des obstacles génétiques au maintien SSC adultes in vivo (par exemple dans le cas de PLZF <s…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le ministère État de New York de la Santé (C026878). MS était à New York Stem Cell Foundation Fellow Druckenmiller. Soutenu en partie par subvention de recherche n ° 5 FY11-571 de la Mars of Dimes Foundation.
Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | – | |
Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
Table 2. Dissociation buffer | |||
StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
Additional supplements** | |||
Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
Table 3. Stem cell medium | |||
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. |