Summary
Eine einfache Methode zur Ableitung und pflegen Spermatogonien Stamm-und Vorläuferzellen Zelllinien aus erwachsenen Mäusen wird hier vorgestellt. Das Verfahren nutzt Feeder-Zellen, die aus dem somatischen Zellkompartiment der adulten Maus Hoden. Diese Technik ist für die gemeinsame Mausstämmen, auch transgenen Knock-out und Knock-in Mäusen.
Abstract
Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) der Hoden sind ein klassisches Beispiel für adulten Stammzellen und die Erhaltung der Fruchtbarkeit für fast die gesamte Lebensdauer des Tieres. Während die genauen Mechanismen, die Selbsterneuerung und Differenzierung in vivo zu regeln Studie sind anspruchsvoll, wurden verschiedene Systeme zuvor murinen SSCs in vitro unter Verwendung einer Kombination von speziellen Kulturmedien und Feeder-Zellen 1-3 Propagation entwickelt.
Die meisten in vitro Streifzüge in die Biologie der SSCs haben Zelllinien von Neugeborenen, möglicherweise aufgrund der Schwierigkeiten bei der Beschaffung Erwachsenen Zelllinien 4 abgeleitet. Jedoch weiterhin die Hoden zu reifen bis ~ 5 Wochen alt in den meisten Mausstämmen. In den frühen postnatalen Phase treten dramatischen Veränderungen in der Architektur der Hoden und in der Biologie der sowohl somatische und spermatogenen Zellen, einschließlich Änderungen in Expression von zahlreichen Stammzellen-bezogeneGene. Daher kann abgeleitet SSC neonatal-Linien nicht vollständig rekapitulieren die Biologie von erwachsenen SSCs, die nach der erwachsenen Testis einen stationären Zustand erreicht hat persistieren.
Mehrere Faktoren haben die Produktion von Erwachsenen SSC Linien behindert historisch. Erstens kann der Anteil an funktionellen Stammzellen im Erwachsenenalter verringern, entweder durch intrinsische oder extrinsische Faktoren 5,6. Weiterhin, wie bei anderen adulten Stammzellen, ist es schwierig gewesen, um ausreichend SSCs bereichern aus Gesamt erwachsenen Hodenzellen ohne Verwendung einer Kombination von Immunselektion oder andere Sortier Strategien 7. Üblicherweise eingesetzten Strategien zählen die Verwendung von Mäusen kryptorchiden als Quelle von Donorzellen aufgrund einer höheren Verhältnis von Stammzellen zu anderen Zelltypen 8. Basierend auf der Hypothese, dass die Entfernung von somatischen Zellen aus der Vorkultur Interaktionen mit der Stammzell-Nische, die für SSC Überleben stört, haben wir bisher entwickelten Methoden zur Ableitung von Erwachsenen lines die keine Immunselektion und kryptorchiden Spendern einzusetzen sondern seriellen Anreicherung von SSC in Kultur, nachfolgend als 2,3 SESC.
Das nachfolgend beschriebene Verfahren führt zu einer einfachen Prozedur zum Ableiten erwachsenen SSC Linien durch Dissoziieren erwachsenen Spenders Samenleiter, durch Plattieren von Zellen auf einer Feeder testikulären stromalen Zelllinie (JK1) 3 umfasst gefolgt. Durch serielle Passagierung, stark haftenden, nicht-verunreinigenden Keimzellen aus der Kultur bei gleichzeitiger Anreicherung von SSCs abgereichert. Kulturen auf diese Weise hergestellte enthalten eine Mischung aus Spermatogonien in verschiedenen Stadien der Differenzierung, welche enthalten SSC, über langfristige Selbsterneuerung Fähigkeit auswählt. Der Kern des SESC Methode ist, dass SSCs ermöglicht, den schwierigen Übergang von der Selbst-Erneuerung in vivo-bis langfristigen Selbsterneuerung in vitro in einer radikal anderen Mikroumgebung zu machen, produziert langfristige SSC Linien, frei von verunreinigendensomatischen Zellen und ermöglicht dadurch anschließenden experimentellen Manipulation von SSCs.
Protocol
Ein. Vorbereitung der Feeder-Zellen
Beachten Sie, dass alle Reagenzien im Folgenden beschriebenen steril vorbereitet werden (siehe Tabellen 1 und 2). Dieses Protokoll nutzt die JK1 Zelllinie (Cell Biolabs, Inc., Katalog # CBA-315) als Zubringer, die eine transformierte Derivat des erwachsenen Maus Hoden somatischen Zellen ist und wurde an anderer Stelle 3 beschrieben. Beachten Sie auch, dass alle Tierversuche im Einklang mit den institutionellen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt werden.
- JK1 Zellen in Kultur gehalten werden und erfolgreich als Zubringer aufgebraucht, um den Durchgang 39. Kultur JK1 Zellen in einer 100 mm Zellkulturschale (BD Falcon, Katalog # 353.003) mit 10 ml steril filtriert Feeder Wachstumsmedium (DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum [FBS], 2 mM L-Glutamin und Antibiotika). Wenn die Kultur 95% Konfluenz erreicht, spaltete sich die Zellen 1.06 -1:10 Verhältnis.
- Entfernen Medium von konfluenten JK1 Feederzellschicht monoSchicht.
- Waschen Zellschicht einmal mit PBS ohne Calcium und Magnesium.
- Hinzufügen vorgewärmten Trypsin / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, Katalog Nr. 25-051-CI), und Inkubieren bei 37 ° C für 5-10 min.
- Inaktivieren Trypsin mit einem gleichen Volumen von Feeder Wachstumsmedium. Sammle Zellen und zentrifugieren bei 300 xg für 5 min. Resuspendieren Zellen in Feeder Wachstumsmedium.
- Pre-coat Multi-Well-Zellkultur-Platten, indem genug 0,4% Gelatinelösung zur Deckung der gut und entfernen Sie nach 5 min bei Raumtemperatur.
- Platte ~ 250 Zellen pro mm 2 in Gelatine-beschichteten Zellkulturplatte (z. B. 48-Well-oder 6-Well-Format). Inkubieren bei 37 ° C für 16 bis 24 Stunden.
- Entfernen Kulturmedium aus Brunnen. ACHTUNG: Um das Zellwachstum zu inaktivieren, fügen Sie eine frische Lösung von Mitomycin-C mit 10 ug / ml in DMEM verdünnt, um jede Vertiefung (zB 200 ul / Vertiefung für eine 48-Well-Platte). Mitomycin-C toxisch ist. Behandeln und entsorgen Sie es mit Sorgfalt. Inkubation bei37 ° C für 4 Stunden.
- Entfernen Mitomycin-C-Lösung von Zellen. 3 x waschen mit DMEM vor dem Beschichten Stammzellen.
- Entfernen DMEM von Feeder-Zellen Brunnen und fügen Sie genug Stammzellen Medium (100 &mgr; l / Well einer 48-Well-Platte, siehe Tabelle 3), um ein Austrocknen der Anleger während der Passage zu verhindern. Fügen SSCs am selben Tag, wie unten in den Abschnitten 3.1 bzw. 3.4 beschrieben, mit angegebenen Größen von Brunnen mit Feeder.
2. Dissoziation von Maus Hodengewebe Erhalten Donor Germ Cells
- Ernte erwachsenen Maus Hoden in sterile Mode und vorübergehend die Hoden in einem überdachten Petrischale (ohne Flüssigkeit hinzugefügt). Das Gericht muss sofort auf Eis gestellt Austrocknung zu verhindern und zu pflegen Lebensfähigkeit der Zellen.
- Mit einer sterilen feinen Pinzette und eine feine Schere in einer Zellkultur Kapuze, einen Querinzision in der Tunica albuginea, ohne sie komplett Durchtrennung der Hoden (dh Schnitt ~ ½ - ¾ Abstand through) und verwenden Pinzette zu verdrängen Samenkanälchen in eine Ecke der Platte; discard Tunica und die angeschlossenen Gewebe. Halten Platte auf Eis überall zu halten Gewebe gekühlt und somit die Erhaltung seiner Integrität und verhindert Verdunstung.
- Schnell Hackfleisch Tubuli mit feiner Feder Schere mindestens 3 min pro Hoden, während Platte auf Eis.
- Sammeln die Tubulus-Fragmente in einem 50 ml konischen Röhrchen und waschen in ~ 40 ml gekühltem PBS / 1% Rinderserumalbumin.
- Zentrifugieren bei 60 × g für 10 min, um Fragmente aus Tubulus Spermatozoen und Schutt zu trennen. Überstand verwerfen.
- In einem 15 ml konischen Röhrchen, das Pellet in 3 ml pro Testis vorgewärmtes Dissoziationspuffers (DMEM, 0,05% Trypsin, 0,03% Collagenase Typ I, 80 U / ml DNAse I und 0,5% Rinderserumalbumin; Siehe Tabelle 2 für mehr spezifische Details Dissoziationspuffer).
- Platzieren Sie die konischen Rohr horizontal in einem Gestell in einem Schüttler bis 150 Upm bei 37 ° C für 15 min, um eine Maximierunggitation.
- Spin-Down bei 60 xg für 10 min zu trennen einzelner Zellen aus undissoziierten Brocken.
- Speichern Sie die Pellets, welche Brocken bis zum nächsten Schritt. Collect Überstand aus Schritt 2.8 und 3 ml DMEM/10% fötalem Rinderserum, um Dissoziationspuffers neutralisieren. Zeigen Röhrchen auf Eis vorübergehend.
- Wiederholen Sie Schritt 2,6 bis 2,7 mit dem gespeicherten Pellet aus Schritt 2,9 bis wieder Digest Stücke, die nach Schritt 2,8.
- Hinzufügen eines gleichen Volumens von DMEM/10% FBS zu Dissoziationspuffers neutralisieren.
- Rekombinieren Suspension aus Schritt 2,11 mit gespeicherten Zellsuspension aus Schritt 2.9. Zentrifuge 5 min bei 300 x g beträgt.
- Pellet in Stammzellen Medium in einem Volumen von 16 ml pro Paar Hoden (siehe Tabelle 3).
3. Beschichtung von Hodenkrebs Zellsuspension
- Plate 2 ml Zellsuspension pro Well in einer 6-Well-Platte mit Feeder-Zellen mit Mitomycin-C und in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 & mitotisch-inaktiviertdeg, C in 5% CO 2.
- Nach 48 Stunden absaugen medium, 2 ml frisches Medium und zum Inkubator.
- Nach 48 Stunden, 0,5 ml frische Stammzellen Medium in jede Vertiefung und zum Inkubator.
- Nach 48 Stunden, anschließend füttern Zellen dreimal pro Woche danach wie folgt bis große, diskrete Kolonien (> 50 Zellen) erscheinen (innerhalb von 7 bis 21 Tage). Für die erste und zweite Fütterung pro Woche (zB Montag und Mittwoch) zu entfernen ~ 50% der mittleren und wieder hinzufügen 50% Vol. frisches Medium. Für das dritte Fütterung (z. B. Freitag), absaugen alle mittel-und ersetzen mit 2 ml frisches Medium. Dieser Ansatz basiert auf der Überlegung, dass die Vermeidung von Vollmedium Veränderungen Schwankungen in Konzentrationen von parakrine Signale, die in das Kulturmedium sezerniert werden minimiert 9 basiert.
4. Colony Picking für First Passage
- Entfernen Medium aus Vertiefungen mit Kolonien passagiert werden und frisches Stammzellen Medium.
- Identifizieren Kolonien mit einem 10x-Ziel. Mit dem Mikroskop leicht defokussiert werden SSC Kolonien am Rand des auch homogen hellen Klumpen, vieler 11-12 Mikrometer Durchmesser Zellen, in denen es schwierig oder unmöglich, die einzelnen Zellrahmen bestehen erkennen erscheinen, da die Zellen gemeinsam auftreten (Abbildung 1A) fusioniert. Non-SSC Kolonien erscheinen dunkler, körnige oder weniger homogenen, mit erkennbaren Grenzen (1A, Einschub).
- Mit einer 200 ul Pipettenspitze mit dem pipetteman auf 50 ul, erster nehmen Medium aus der gut und zu vertreiben, um die Spitze zu benetzen. Dann vorsichtig anzustossen die Kolonie mit der Spitze, bevor sich rasch Rückzug 50 ul Medium, um die Kolonie durch Ansaugen in der Spitze (Abbildung 1B) zu vertreiben.
- Auszustoßen das Medium, das die Kolonie in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte, enthaltend inaktivierte feeder-Zellen mit 100 ul Medium Stammzelle (Abbildung 1C).
- Wiederholen Sie Schritt4,3 und bis zu 8 Kolonien auf die gleiche auch ohne Überschreitung 500 ul pro Vertiefung.
- Wiederholen Sie die Schritte 4,3 bis 4,5 zusätzliche Vertiefungen der 48-Well-Platte mit Durchgang eins SSC Kolonien vorzubereiten.
- Wells wird bereit sein, aufgeteilt in 7-14 Tagen oder nach großen Klumpen von bis zu 500 Zellen entstanden (Abbildung 1D).
5. Nachfolgende Expansion und Passagieren von SSCs durch Trituration
- Zellen bei Passage sollte man auf frische Anleger nach bis zu 14 Tagen bei einer Split-Verhältnis von 1:2 für den ersten 3 Passagen und dann 1.04 subkultiviert, um 1:6 (alle 7 Tage) danach wie folgt. Sanft verreiben Kolonien von einer semi-konfluenten Vertiefung (zB ~ 300.000 SSC / Vertiefung von 6-Well-Platte) mit einer 1 ml Pipette durch Waschen Medium über den Zellen. Kolonien erkennbar Ablösen werden. Zu viel Kraft mit dem Strom der Flüssigkeit bewirkt unerwünschte Feederzellen kommen auch ab.
- Sammle triturated Zellen in einem konischen Rohr und Zentrifuge bei 300 xg5 min. Hinweis: Ein Trypsinierung Schritt kann sicher hier hinzugefügt werden, wenn durch den Prüfarzt gewünscht.
- Überstand entfernen und in frischen Stammzellen Medium resuspendieren durch gründliches und Abpipettieren Kolonien stören.
- Platte SSCs auf frisch präparierten Feeder-Zellen mit Mitomycin-C inaktiviert, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
- Führen Zellen dreimal pro Woche wie folgt. Für die erste und zweite Fütterung (z. B. Montag und Mittwoch) werden 50% der frischen Medium. Für das dritte Fütterung (z. B. Freitag), absaugen alle mittel-und ersetzen mit 2 ml frisches Medium. Platten werden konfluente in 7-10 Tagen. Kulturen sollte von> 98% Keimzellen (dh <1% kontaminierenden somatische Zellen) nach 5-7 Passagen auf Immunfärbung (zB unter Verwendung der murinen Keim Zellmarker GCNA) an Keimzellen aus somatischen Zellen 10 unterscheiden basierend bestehen. Hinweis: Diese Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Anforderungen, die von der Institution gesetzt entwickeltal Animal Care und Use Committee am Weill Cornell Medical College.
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Representative Results
Das Aussehen der Passage Null Wildtyp wird Erwachsenen SSC Kolonien nach 7 Tagen in Abbildung 1 dargestellt. Dreidimensionale Kolonien werden aus einer Schicht aus flachen Zellen, die an die Speiser oder underling extrazellulären Matrix abgeschieden durch den Abzweigen mit mehreren Schichten von SSCs wachsenden oben besteht. Während gesunde SSCs hell und gleichmäßig refractile 11-12 Mikrometer Durchmesser sind, sind die Zellgrenzen schwierig zu unterscheiden, und die Größe der Kolonien kann sehr variabel sein, sowohl innerhalb der Bohrung und zwischen den Wells von verschiedenen Mäusen hergestellt. Visualisierung der Kolonien wird von einem Phasenkontrastmikroskop mit digitaler Anzeige und einer leicht de-fokussierten Brennebene, die den Kontrast zwischen sehr homogene SSC Kolonien und verunreinigen somatischen Zellen, die in frühen Passage (0-2) Kulturen sind und tun verbessert Aided bilden keine dicht gepackten Kolonien (siehe Abbildung 1A Kasten). Beachten Sie, dass die Morphologie der Feeder-Zellen allmählich af ändernter Umschalten von DMEM/10% bis Zellkulturmedium nach Inaktivierung mit Mitomycin-C.It stammen ist auch wichtig zu beachten, dass die anfängliche Zellsuspension nicht gefiltert bzw. verspannt, weil restliche Klumpen von somatischen Zellen gedacht werden, um das Überleben von SSC bei erweitern die Zeit der ersten Beschichtung und sollte nicht entfernt werden, bis SSC Kolonien gegründet werden. Serielle Passage (> 5-7 mal) erforderlich, um die Keimzellen in der Nähe Homogenität (> 98%) reinigen und entleeren restlichen Körperzellen. Wenn nachfolgenden Experimenten speziell erfordern Anreicherung von Stammzellen aus der Gesamtbevölkerung von Keimzellen in der Kultur, dann Zellselektion mit immunomagnetische Kügelchen oder Durchflusszytometrie kann zur weiteren Reinigung eingesetzt werden, zum Beispiel Stammzellen Bereicherung erhalten mit Antikörpern gegen Thy1 werden , CD9, α6 Integrin und andere 11. Die Identität SSCs Anschließend sollte bestätigt werden mittels Immunphänotypisierung, Genexpression und durch Transplantation, da transplantatIonenanalytik ist das einzige Mittel, um abschließend beurteilt die Menge der authentischen, funktionsfähige Stammzellen 12,13.
Abbildung 1. Morphologie der frühen SSC Kolonien, Hoden-Stromazellen und Feeder. A, Aussehen des entstehenden SSC Kolonien ~ 5 Tage nach der ersten Beschichtung. Inset zeigt verunreinigen monozytenähnlichen somatischen Zellen in einer Passage Null Kultur. B, Auswahl und Kommissionierung von einzelnen Kolonien ersten Durchgang (~ 14 Tage) in 48-Well-Platten. Der schwarze Struktur ist die Pipettenspitze. C, Aussehen von inaktivierten JK1 Feeder-Zellen. D, Große Kolonien vor Routine Subkultivierung. Die Pfeile zeigen SSC Kolonien. Maßstab in A beträgt 100 um (Einschub, 50 um) und BD ist 200 um.
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Discussion
Diese Methode zur Ableitung Erwachsenen SSCs mit adulten Hoden-derived Feeder-Zellen ist robust und gelungen, wenn gemeinsame genetische Herkunft (zB FVB, C57Bl6 und gemischte 129SV/C57Bl/6) und verschiedene Mutanten 2,3,7,14 beschäftigt waren. In der Tat ist die Mikroumgebung von der Kultur-System angelegt ausreicht, um einige der genetischen Barrieren zur Aufrechterhaltung erwachsenen SSCs in vivo (zB im Falle von PLZF - / - Tieren) überwunden 7. Während wir JK1 Zellen als Feeder eingesetzt, können nicht transformierte erwachsenen testikulären somatischen Zellen auch mit der gleichen Wirksamkeit wie JK1 Zellen 2,3 verwendet werden.
SESC wurde entwickelt, um effizient zu erhalten langfristige Erwachsenen SSC Linien. Leider ist die hohe Effizienz mit einem Trade-off aus dem folgenden Grund erreicht. Ein bemerkenswertes Begrenzung des Verfahrens ist, daß der Wegfall einer Filterung oder spannungsstarken Schritt zum Zeitpunkt der anfänglichen Beschichtung und die Manipulation dass die InverE beinhaltet, welche das Überleben der Zelle kann beeinflussen, können erhebliche Variabilität in Zellzahlen von Well zu Well ausplattiert, die wirksam ausschließt Quantifizierung auf der Stufe der anfänglichen Koloniebildung. Jedoch kann die quantitative Assays mit etwas späteren Durchgang Kulturen zu welcher Zeit eine Einzelzellsuspension leicht nach Standard Trypsinisierung (> Passage 5-7) hergestellt werden können, durchgeführt werden.
Weil erwachsenen SSC kann in Kultur expandiert und aufrechterhalten werden fast unbegrenzt, ermöglicht dieses Protokolls die effiziente Herstellung von Zelllinien, die anschließend in ähnlicher Weise verwendet werden kann, um andere etablierte Primärkulturen oder Zelllinien (zB Gen und Proteinexpression Analysen oder ektopische Expression von ein Gen von Interesse). Dennoch ist es wichtig, letztendlich bestätigen die Resultate mit Transplantation Analyse als Goldstandard oder anderen validierten Surrogat-Assay, wie zB SSC-Cluster-Assay 12,15.
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Disclosures
MS Lizenzgebühren von Weill Cornell Medical College in einer Lizenz to Cell Biolabs, Inc. JK1 Zellen verteilen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der New York State Department of Health (C026878) unterstützt. MS war ein New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Unterstützt in Part von Research Grant No 5-WJ11-571 aus der March of Dimes Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | - | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercapt–thanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. | |||
References
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).
- Seandel, M., et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature. 449, 346-350 (2007).
- Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells. Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).
- Ogawa, T., et al. Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines. Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).
- Schmidt, J. A., et al. In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function. Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).
- Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. Aging of male germ line stem cells in mice. Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).
- Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1. Cell. 142, 468-479 (2010).
- Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).
- Csaszar, E., et al. Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling. Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).
- Enders, G. C., May, J. J. Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female. 163, 331-340 (1994).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).
- Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).
- Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3545 (2012).
- Arnold, K., et al. Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice. Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).
- Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).
