Summary
성인 마우스에서 spermatogonial 줄기 및 전구 세포 라인을 도출하고 유지하는 간단한 방법은 여기 제공됩니다. 방법은 성인 마우스 testis의 체세포 구획에서 발생하는 피더 세포를 활용합니다. 이 기술은 유전자 변형, 노크 - 아웃 등의 일반적인 마우스 변종에 적용하고, 똑 -의 생쥐.
Abstract
Spermatogonial 줄기와 testis의 전구 세포는 (SSCs) 성인 포유류의 줄기 세포의 고전적인 예를 나타냅니다과 동물의 거의 평생 불임을 보존 할 수 있습니다. 생체에 자기 갱신과 차별화에 적용되는 정확한 메커니즘은 연구에 도전하고 있지만, 다양한 시스템은 전문 문화 미디어 및 1-3 피더 세포의 조합을 사용하여 체외에서 손쥐 SSCs를 전파하는 이전에 개발되었습니다.
SSCs의 생물에 체외 forays의 대부분은 성인 세포 라인에게 4 취득의 어려움으로 인해 neonates에서 세포 라인을 도출했습니다. 그러나, testis는 대부분의 마우스 변종에 세 ~ 5 주가 지나야까지 성숙을 계속하고 있습니다. 초 후 산후 시대에는 극적인 변화가 testis의 아키텍처와 체세포와 많은 줄기 세포 관련의 표현 수준의 변경 등의 spermatogenic 세포, 모두의 생물학에서 발생유전자. 따라서 neonatally - 파생 SSC 라인이 완전히 성인 testis가 정상 상태에 도달 한 후 계속 성인 SSCs의 생물학을 요점을 되풀이하지 않을 수 있습니다.
여러 가지 요인이 역사적으로 성인 SSC 라인의 생산을 방해하고 있습니다. 첫째, 기능 줄기 세포의 비율은 고유 또는 외부 요인으로 인해 5,6하거나, 성인기 동안 감소 할 수 있습니다. 또한, 다른 성인의 줄기 세포와 마찬가지로, 그것은 immunoselection 또는 다른 정렬 전략 7의 조합을 사용하지 않고 전체 성인 고환 세포에서 충분히 SSCs을 풍요롭게하기 어려운되었습니다. 일반적으로 고용 전략은 다른 세포 유형 8 줄기 세포의 높은 비율로 인해 공여 세포의 원천으로 cryptorchid 마우스의 사용을 포함합니다. 초기 문화의 체세포 세포의 제거는 SSC의 생존에 필수적인 줄기 세포 틈새와의 상호 작용을 방해하는 가설을 바탕으로, 우리는 이전에 성인 리터를 추출하는 방법을 개발immunoselection 또는 cryptorchid 기증자를 필요로하지만, 오히려 문화에 SSCs의 일련 농축을 채용하지 않는 아이 네스는 SESC 2,3로 이하라고.
아래에서 설명하는 방법은 고환 stromal 세포 라인 (JK1) 3으로 구성 피더에 대한 세포의 도금에 이어 성인 기증자 정액을 운반하는 tubules를 dissociating하여 성인 SSC 라인을 파생하는 간단한 절차를 수반. 시리얼을 통해 비 배아 세포를 오염, 강하게 자기편, passaging 것은 SSCs의 수반하는 농축과 문화의 고갈됩니다. 이러한 방식으로 생산 문화는 장기적으로 자기 갱신 능력에 따라 SSCs를 포함하는 차별화의 다른 단계에서 spermatogonia의 혼합물을 포함합니다. SESC 방법의 요점은 그것이 근본적으로 다른 microenvironment의 체외에서 장기간 자기 갱신에 생체의 자기 갱신의 어려운 전환을 할 SSCs 수 있다는 것입니다, 오염 무료, 장기 SSC 라인을 생산체세포의 세포, 그리고이를 SSCs의 후속 실험 조작을 할 수 있습니다.
Protocol
1. 피더 셀의 준비
아래에 설명 된 모든 시약은 (표 1 및 2 참조) 살균 방식으로 준비해야합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 고환 체세포 세포의 변화를 파생하고 다른 3 설명 된 피더로 JK1 세포주 (셀 Biolabs, 주식회사, 카탈로그 # CBA-315)를 사용하고 있습니다. 모든 동물 절차 기관 지침 및 규정에 따라 수행되어야한다고도합니다.
- JK1 세포는 문화에 유지 통로 39 성공적으로 피더를 사용할 수 있습니다. 필터 소독 피더 성장 매체 10 ML과 100mm 세포 배양 접시 (BD 팔콘, 카탈로그 # 353003)의 문화 JK1 세포를 (DMEM와 함께 보충 10% 태아 소 혈청 [FBS], 2 MM L-글루타민과 항생제). 문화가 95 %의 합류에 도달하면, 세포에게 1시 6분 -1:10 비율을 분할.
- 합류 JK1 피더 셀 모노에서 매체를 제거합니다층.
- 칼슘, 마그네슘없이 PBS로 한 번 셀 레이어를 씻으십시오.
- 미리 예열 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1X (0.05 % trypsin/0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 코닝 Cellgro, 카탈로그 # 25-051 - CI)를 추가하고 37 번 ° C 5-10 분에 품다.
- 피더 성장 매체의 동일한 볼륨과 트립신을 비활성화. 세포를 수집하고 5 분 300 XG에 원심 분리기. 피더 성장 매체에 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 잘 덮어 실온에서 5 분 후 제거하기에 충분한 0.4 % 젤라틴 용액을 추가하여 사전 코트는 멀티도 세포 배양 접시.
- 판 ~ 젤라틴 - 코팅 세포 배양 판에 mm 2 당 250 세포 (예를 들어 48도 또는 6 - 잘 형식). 16-24 시간에 37 ° C에서 문화를 품다.
- 우물에서 문화 매체를 제거합니다. 주의 : 세포 성장을 비활성화로 DMEM에 희석 10 μg / ML에서 미토 마이신-C의 새로운 솔루션을 추가하려면 각도 (예를 들어 200 μl / 잘 48 잘 접시). 미토 마이신-C는 독성이 있습니다. 처리 및 관리와 함께 폐기하십시오. 에 품다37 ° C 4 시간에.
- 세포에서 미토 마이신-C 솔루션을 제거합니다. 도금의 줄기 세포 이전에 DMEM으로 3 번 씻으십시오.
- 피더 세포 우물에서 DMEM을 제거하고 충분한 줄기 세포 매체 (100 μl / 잘 48 잘 접시의, 표 3 참조)을 추가 passaging 동안 피더의 탈수를 방지하기 위해합니다. 피더를 포함하는 우물의 지정된 크기를 사용하여 섹션 3.1 또는 3.4에서 아래에 설명 된대로, 당일 SSCs를 추가합니다.
2. 마우스 Testis 조직의 분리는 기증자 배아 세포를 구하는
- 수확 성인 마우스 살균 방식으로 고환 일시적으로 덮인 페트리 접시 (모든 액체없이 추가)에 고환을 저장합니다. dessication을 방지하고 세포 생존 능력을 유지하기 위해 음식은 얼음에 즉시 배치해야합니다.
- ¾ 거리 thr - 무균 고급 집게 및 세포 배양 동네에서 고급 가위를 사용하여 완전히 testis (즉, 잘라 내기 ~ ½를 끊어 버렸네없이 혈관의 albuginea의 가로 절개를ough)과 접시의 코너에 정액을 운반하는 tubules의를 쥐어 짜 집게를 사용하여, 폐기 혈관 및 첨부 조직. 이를 통해 자사의 무결성을 유지하고 증발을 방지 조직은 차가운 유지하기를 통해 얼음 판세요.
- 얼음 판을 유지하면서 빠르게, 봄날의 가위 testis 당 최소 3 분으로 tubules를 이기다.
- 50 ML 원뿔 튜브에 가느 다란 관 조각을 수집하고 알부민 차가운 PBS / 1퍼센트 소 혈청의 ~ 40 ML에 씻는다.
- 마리의 정자 수야과의 잔해로부터 가느 다란 관 조각을 분리 할 수 10 분 60 XG에 원심 분리기. 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 15 ML 원뿔 튜브에 미리 예열 분리 버퍼의 testis 당 3 ML (DMEM, 0.05 % 트립신, 0.03 %의 Collagenase 유형 I, 80 U / DNAse I의 ML와 0.5 % 소 혈청 알부민에 펠렛을 resuspend, 표를 참조하십시오 해리 버퍼의보다 구체적인 내용은 2).
- 을 최대화하기 위해 15 분에 37 ° C에서 150 rpm에서에 쉐이커 세트의 랙에 수평으로 원뿔 튜브를 삽입합니다gitation.
- undissociated 덩어리에서 분리 한 세포를 10 분 60 XG에 스핀 다운.
- 다음 단계까지 펠릿이 포함 된 청크를 저장합니다. 단계 2.8에서 표면에 뜨는 수집하고 해리 버퍼를 중화 할 수있는 3 ML DMEM/10 % 태아 소 혈청을 추가합니다. 일시적으로 얼음에 튜브를 삽입합니다.
- 단계 2.9에서 저장 한 환약을 2.6-2.7 단계를 단계 2.8 이후에 남은 재 다이제스트 덩어리에 반복합니다.
- 해리 버퍼를 무력화 DMEM/10 % FBS의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 단계 2.9에서 저장된 세포 현탁액과 단계 2.11에서 재결합 정지. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 고환의 쌍 당 16 ML의 볼륨에서 줄기 세포 매체에 Resuspend 펠릿 (표 3 참조).
3. 고환 세포 현탁액의 도금
- 세포 현탁액의 플레이트 2 ML 당 잘에서 6 잘 플레이트 포함 피더 세포 37 &에서 세포 배양 인큐베이터에서 미토 마이신-C, 장소와 mitotically-inactivated℃ 일, C 5 % CO 2.
- 48 시간, 대기음 매체 후, 2 ML 신선한 매체를 추가하고 보육 돌아갑니다.
- 48 시간 후, 각도에 0.5 ML 신선한 줄기 세포 매체를 추가하고 보육 돌아갑니다.
- 48 시간 후, 이후 세포에게 일주일에 세 번 이후로 큰 신중한 식민지 (> 50 세포) (7-21일 이내) 나타날 때까지 다음 먹이를. 매주 먹이 첫 번째와 두 번째 (예 : 월요일, 수요일)에 대한 매체의 ~ 50 %를 제거하고 신선한 매체의 볼륨에 의해 다시 50 %를 추가 할 수 있습니다. 셋째 수유를 들어 (예 : 금요일), 모든 매체를 대기음 2 ML 신선한 매체로 대체합니다. 이 접근 방식은 전체 매체 변화의 소지를 없애기는 문화 매체 9에 숨겨진 paracrine 신호의 농도의 변동을 최소화하는 근거에 기반을두고 있습니다.
4. 제 1 통로에 대한 식민지 따기
- passaged 할 우물 포함 식민지에서 미디어를 제거하고 신선한 줄기 세포 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 가 10 배 목표를 사용하여 식민지를 식별합니다. 현미경 약간 드 중심으로 잘의 가장자리에서 SSC의 식민지는 세포부터가 어렵거나 개별 셀 테두리를 판별하는 것은 불가능입니다 많은 11-12 μm의 직경 세포로 구성되어 균일 한 밝은 clumps로 나타납니다 (그림 1A) 융합 나타납니다. 비 SSC 식민지가 뚜렷한 경계 (그림 1A, 삽입)로, 어두운, 더 세분화, 이하 동질 나타날 수 있습니다.
- 50 μl에 pipetteman 세트로, 200 μl 피펫 팁을 사용하여 먼저 우물에서 미디어를지고 끝 오줌에 배출. 그런 다음, 부드럽게 빠르게 팁 (그림 1B)로 흡입하여 식민지를 제거합니다 매체의 50 μl이 박탈되기 전에 끝으로 식민지를 자극.
- 줄기 세포 매체 (그림 1C)의 100 μl로 inactivated 피더 세포를 포함하는 48 잘 접시의 잘 하나에 식민지를 포함하는 매체를 배출.
- 단계를 반복합니다물론 당 500 μl를 초과하지 않고 같은 잘 ~ 8 식민지로 4.3과를 추가 할 수 있습니다.
- 통과 한 SSC의 식민지로 48 잘 접시의 추가 우물을 준비하는 4.3-4.5 단계를 반복합니다.
- 웰스는 7-14일 또는 최대 500 세포 (그림 1D) 부상하는 큰 clumps 후 분할 할 준비가 될 것입니다.
5. 분쇄에 의한 SSCs의 후속 확장 및 Passaging
- 통로 한 곳에서 셀은 1시 6분 (매 7 일) 이후에 다음과 같이에 처음 3 구절에 대한 1시 2분의 분할 비율로하고 1시 4분 14 일 이후에 새로운 피더에 최대 subcultured해야합니다. 부드럽게 세포에서 매체를 세정하여 1 ML 피펫 팁을 준 합류 잘 나가지 식민지 (예를 들면 ~ 300,000 SSCs / 잘 6 잘 접시의) 씹다. 식민지는 분리 볼 수 있습니다. 액체의 흐름과 너무 많은 힘이 원치 않는 피더 세포가 너무 내려 와서하게됩니다.
- 300 XG에서 원뿔 튜브와 원심 분리기에 triturated 세포를 수집5 분 거리에 있습니다. 참고 : 탐정이 원하는 경우 trypsinization 단계가 안전하게 여기에 추가 할 수 있습니다.
- 표면에 뜨는을 대기음 철저히 식민지를 방해하고를 아래로 pipetting하여 신선한 줄기 세포 매체에 다시 일시 중지합니다.
- 미토 마이신-C와 inactivated 신선하게 조리 된 피더 세포에 판 SSCs는 제 1 절에 설명되어 있습니다.
- 세포에게 주당는 다음 세 번 먹이. 첫 번째와 두 번째 수유를 들어 (예 : 월요일, 수요일) 신선한 매체의 볼륨에 의해 50 %를 추가 할 수 있습니다. 셋째 수유를 들어 (예 : 금요일), 모든 매체를 대기음 2 ML 신선한 매체로 대체합니다. 접시는 7~10일에 합류 될 것입니다. 문화는 체세포의 세포 10 일부터 배아 세포를 구별 할 (예 : 손쥐 세균 세포 마커 GCNA를 사용하여) immunostaining에 따라 5-7 통로 후> 98 %의 배아 세포 (즉, <1 % 오염 체세포 세포)로 구성해야합니다. 참고 :이 방법은 기관에 의해 명시된 규정 및 요구 사항을 준수 개발웨일 코넬 의과 대학에서 알 동물 관리 및 사용위원회.
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Representative Results
통로 제로 야생 타입의 외관, 7 일 후에 성인 SSC의 식민지는 그림 1에 표시됩니다. 입체 식민지가 상단에 성장 SSCs의 여러 레이어와 피더에 의해 증착 모이통 또는 부하 세포 외 기질에 부착 된 평면 세포의 층으로 구성되어 있습니다. 건강한 SSCs는 밝은 refractile하고 균일 11-12 μm의 직경 있지만, 셀 테두리는 구분하기가 어렵 있으며, 콜로니의 크기가 아니라 내에서 서로 다른 생쥐에서 준비 우물 사이에 높은 변수가 될 수 있습니다. 식민지의 시각화는 디지털 디스플레이와 초기 통로 (0-2) 문화에 존재하고 어떻게 매우 균일 한 SSC의 식민지와 오염 체세포 세포 사이의 대비를 향상 약간 드에 초점을 맞춘 초점 평면과 위상 현미경에 의해 도왔입니다 단단히 포장 식민지 (그림 1A는 삽입 참조) 형성하지. 피더 세포의 형태가 점차 AF 변경됩니다체세포 세포의 잔여 clumps가에 SSCs의 생존을 향상시키기 위해 생각되어 있기 때문에 적이는 미토 마이신-C.It과 불 활성화 한 후 세포 배양 매체를 막기 위해 DMEM/10 %에서 전환하면, 초기 세포 현탁액을 필터링하거나 긴장되어 있지 않습니다하는 것도 중요합니다 SSC의 식민지가 설립 될 때까지 초기 도금 및 시간은 제거하지 않아야합니다. (> 5-7 회) passaging 시리얼은 근처의 동질성 (> 98%)로 배아 세포를 정화하고 잔류 체세포의 세포를 고갈이 필요합니다. 후속 실험 구체적으로 문화에 배아 세포의 총 인구에서 줄기 세포의 농축을 필요로한다면, 셀 선택 immunomagnetic 구슬을 사용하거나 유동 세포 계측법은 더 정화 고용 될 수있다; 예를 들어, 세포 농축을 막기는 Thy1에 대한 항체를 사용하여 얻을 수있다 , CD9, α6 인테그린 등 11. SSCs의 정체성은 이후 transplantat부터 immunophenotyping, 유전자 발현 및 이식에 의한를 사용하여 확인해야합니다이온 분석 definitively 12,13 정통 기능성 줄기 세포의 양을 평가하는 유일한 수단입니다.
1 그림. 초기 SSC의 식민지, 고환 stromal 세포와 피더의 형태. A, ~ 오일 초기 도금 후 초기 SSC의 식민지 외관. 통로 제로의 문화에 단핵 세포와 같은 체세포의 세포를 오염 삽입 보여줍니다. 48 잘 접시에 B, 선택과 제 1 통로 (~ 14 일)에 대한 개별 식민지 따기. 검은 색 구조는 피펫 팁입니다. C, inactivated JK1 피더 세포의 모양. 일상 subculturing 이전 D, 대형 식민지. 화살표는 SSC의 식민지를 나타냅니다. 의 스케일 바는 100 μm (삽입, 50 μm)이며, BD에 200 μm이다.
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Discussion
성인 testis-파생 피더 세포를 사용하여 성인 SSCs를 파생를위한이 방법은 강력한이며, 일반적인 유전 적 배경 (예 : FVB, C57Bl6 및 혼합 129SV/C57Bl/6)과 다른 돌연변이 변종이 2,3,7,14을 고용했을 때 성공했습니다. 7 사실, 문화 시스템에 의해 생성 된 microenvironment는 생체에 성인 SSCs를 (- - / 동물 plzf의 경우 등) 유지에 유전 장벽의 일부를 극복하기에 충분합니다. 우리가 피더로 JK1 세포를 고용하지만, 비 변환 성인 고환 체세포의 세포는 JK1 세포 2,3 동등한 효과와 함께 사용할 수 있습니다.
SESC는 효율적으로 장기 성인 SSC 라인을 얻기 위해 설계되었습니다. 불행하게도, 높은 효율은 다음과 같은 이유로 트레이드 오프를 달성된다. 절차의 중요한 제한입니다 초기 도금시 필터링이나 긴장 단계의 누락 및 조작이 procedur전자는 세포 생존에 영향을 미칠 수있는 관련, 초기 식민지 형성의 단계에서 효과적인 quantitation를 precludes 잘에 우물에서 도금 전화 번호에 상당한 변화를 일으킬 수 있습니다. 그러나, 양적 assays은 단일 세포 현탁액 쉽게 표준 trypsinization (> 통로 5-7)에 의해 준비 할 수있는 시간에 약간 나중에 통로 문화와 수행 할 수 있습니다.
문화의 성인 SSCs를 확장하고 거의 무한정 유지 될 수 있기 때문에,이 프로토콜은 다른 설립 주요 문화 또는 셀 라인 (즉, 유전자 및 단백질 표현 분석 또는 이소성 표현에 비슷한 방식으로 이후 사용할 수있는 세포 라인의 효율적인 생산을 가능하게 관심 유전자). 그럼에도 불구하고, 그것은 궁극적으로 금 표준 또는 SSC 클러스터 형성 검정 12,15 같은 다른 검증 대리 분석,로 이식 분석을 사용하여 결과를 확인하기 위해 필수적입니다.
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Disclosures
MS는 JK1 세포를 배포 할 셀 Biolabs 주식회사에 라이센스를 통해 웨일 코넬 의과 대학에서 로열티를 받게됩니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 뉴욕 국무부 (C026878)에 의해 지원되었다. MS는 뉴욕 줄기 세포 재단 - Druckenmiller 연구원이었다. 천 재단의 3 월부터 연구 기금 5 호 - FY11-571의 일부를 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | - | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercapt–thanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. | |||
References
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