Um método simples para obter e manter a haste espermatogónias e linhas de células progenitoras a partir de ratos adultos, é aqui apresentada. O método utiliza células de alimentação provenientes do compartimento de células somáticas do testículo do rato adulto. Esta técnica é aplicável a linhagens de camundongos comuns, incluindo transgênico, knock-out, e bater-nos camundongos.
Tronco espermatogônias e as células progenitoras (SSCS) dos testículos representam um exemplo clássico de células-tronco adultas de mamíferos e preservar a fertilidade por quase toda a vida do do animal. Embora os mecanismos precisos que controlam a auto-renovação e diferenciação in vivo são difíceis de estudo, vários sistemas têm sido desenvolvidos anteriormente para propagar SSC murinos in vitro, utilizando uma combinação de meios de cultura e as células especializadas do alimentador 1-3.
Mais em incursões in vitro sobre a biologia do SSC ter derivado de linhas celulares a partir de recém-nascidos, possivelmente devido à dificuldade na obtenção de linhas de células adultas 4. No entanto, os testículos continua a amadurecer-se até ~ 5 semanas de idade na maioria das estirpes de ratinho. No período pós-natal precoce, mudanças drásticas ocorrem na arquitectura dos testículos e na biologia de ambos células somáticas e de espermatogénese, incluindo alterações nos níveis de expressão de células estaminais numerosos relacionadagenes. Portanto, as linhas-neonatal derivados SSC não pode inteiramente recapitular a biologia do SSC adultos que persistem após o testículo adulto chegou a um estado estacionário.
Vários fatores têm dificultado a produção de linhas de adultos SSC historicamente. Em primeiro lugar, a proporção de células-tronco funcionais pode diminuir durante a idade adulta, quer devido a factores intrínsecos ou extrínsecos 5,6. Além disso, como com outras células-tronco adultas, tem sido difícil para enriquecer suficientemente SSC a partir de células adultas totais testiculares sem o uso de uma combinação de estratégias de triagem ou imuno outros 7. Estratégias geralmente utilizadas incluem a utilização de ratinhos criptorquídios como uma fonte de células do doador, devido a uma maior proporção de células estaminais para outros tipos de células 8. Com base na hipótese de que a remoção de células somáticas a partir da cultura inicial perturba as interacções com o nicho de células estaminais que são essenciais para a sobrevivência SSC, que anteriormente desenvolvidos métodos para derivar l adultoines que não necessitam de imuno ou doadores criptorquídios mas sim empregar enriquecimento série de SSC em cultura, a seguir referido como SESC 2,3.
O método descrito a seguir envolve um procedimento simples para derivar linhas adultos SSC, dissociando adulto dador túbulos seminíferos, seguido por plaqueamento das células em alimentadores que compreendem uma linha celular de estroma testicular (JK1) 3. Através de série passagem, fortemente aderente, contaminando germinativas células não estão esgotados a partir da cultura de enriquecimento concomitante de SSC. Culturas produzidas desta forma contém uma mistura de espermatogônias em diferentes estágios de diferenciação, as quais contêm, com base em SSC a longo prazo a capacidade auto-renovação. O cerne do método SESC é que ele permite SSC para fazer a transição difícil de auto-renovação in vivo a longo prazo de auto-renovação in vitro num microambiente radicalmente diferente, produz linhas de longo prazo do CCD, livre de contaminaçãocélulas somáticas, e desse modo permite a manipulação experimental subsequente de SSC.
Este método para derivar SSCs adultos utilizando células adultas derivadas de testículos de alimentação é robusto e tem êxito quando comuns origens genéticas (por exemplo, FVB, C57BL6 e 129SV/C57Bl/6 mista) e diferentes cepas mutantes foram empregados 2,3,7,14. Na verdade, o microambiente criado pelo sistema de cultura é suficiente para superar algumas barreiras genéticas para manter SSC adultos in vivo (por exemplo, no caso de plzf – / – de animais) 7.</su…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo New York State Department of Health (C026878). MS foi um New York Stem Cell Foundation Fellow-Druckenmiller. Suportado em parte pela Research Grant No. 5-AF11-571 da March of Dimes Foundation.
Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | – | |
Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
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DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
Table 2. Dissociation buffer | |||
StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
Additional supplements** | |||
Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
Table 3. Stem cell medium | |||
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. |