Summary

Enriquecimiento de serie de la madre de espermatogonias y células progenitoras (SSC) en Cultura para la derivación de largo plazo de ratones adultos Líneas SSC

Published: February 25, 2013
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Summary

Un método sencillo para obtener y mantener la madre de espermatogonias y las líneas de células progenitoras de ratones adultos se presenta aquí. El método utiliza las células de alimentación se originan en el compartimiento de células somáticas de los testículos de ratón adulto. Esta técnica es aplicable a las cepas de ratones comunes, incluyendo transgénicos, knock-out y knock-en ratones.

Abstract

Madre de espermatogonias y células progenitoras (SSC) de los testículos representan un ejemplo clásico de las células madre adultas de mamífero y preservar la fertilidad durante casi toda la vida del animal. Aunque los mecanismos precisos que gobiernan la auto-renovación y diferenciación in vivo son difíciles de estudio, los sistemas se han desarrollado varios previamente para propagar las ESC murinas in vitro usando una combinación de medios de cultivo especializados y células alimentadoras 1-3.

La mayoría de las incursiones in vitro sobre la biología de las ESC han derivado líneas celulares de los recién nacidos, posiblemente debido a la dificultad en la obtención de líneas de células adultas 4. Sin embargo, el testículo continúa madurando hasta ~ 5 semanas de edad en la mayoría de las cepas de ratón. En el periodo post-natal período, los cambios dramáticos se producen en la arquitectura de los testículos y en la biología de las células somáticas y de espermatogénesis, incluyendo alteraciones en los niveles de expresión de numerosas células madre relacionadogenes. Por lo tanto, neonatalmente derivados de las líneas SSC no completamente puede recapitular la biología de las ESC adultos que persisten después de los testículos adultos ha alcanzado un estado estable.

Hay varios factores que han dificultado la producción de líneas de CSS históricamente adultos. En primer lugar, la proporción de células madre funcionales puede disminuir durante la edad adulta, ya sea debido a factores intrínsecos o extrínsecos 5,6. Además, como con otras células madre adultas, que ha sido difícil para enriquecer las SSC suficientemente partir de células adultas testiculares totales sin utilizar una combinación de inmunoselección u otras estrategias de clasificación 7. Estrategias comúnmente empleadas incluyen el uso de ratones criptórquidos como una fuente de células donantes debido a una mayor proporción de células madre para otros tipos de células 8. Sobre la base de la hipótesis de que la eliminación de las células somáticas de la cultura inicial altera las interacciones con el nicho de células madre, que son esenciales para la supervivencia SSC, previamente desarrollado métodos para derivar l adultoines que no requieren inmunoselección o donantes criptórquidos sino más bien emplear enriquecimiento de serie de las ESC en cultivo, denominado en lo sucesivo SESC 2,3.

El método se describe a continuación implica un procedimiento sencillo para derivar líneas SSC adultos mediante la disociación de adulto donante túbulos seminíferos, seguido de plaqueo de las células en los alimentadores que comprenden una línea de células del estroma testicular (JK1) 3. A través de pasada en serie, fuertemente adherente, contaminando las células germinales no se agotan a partir del cultivo de enriquecimiento concomitante de SSC. Los cultivos producidos de esta manera contienen una mezcla de espermatogonias en diferentes estadios de diferenciación, que contienen las ESC, en base a largo plazo la capacidad de auto-renovación. El quid de la SESC método es que permite a CSC para hacer la difícil transición de la auto-renovación en vivo a largo plazo de la auto-renovación in vitro en un microambiente radicalmente diferente, produce a largo plazo las líneas de cooperación Sur-Sur, libre de contaminacióncélulas somáticas, y permite así la posterior manipulación experimental de las ESC.

Protocol

1. Preparación de células de alimentación Tenga en cuenta que todos los reactivos descritos a continuación deben ser preparados en forma estéril (ver Tablas 1 y 2). Este protocolo emplea la línea celular JK1 (célula Biolabs, Inc., catálogo # CBA-315) como alimentadores que es un derivado transformado de células adultas de ratón testiculares somáticos y se ha descrito en otra parte 3. Tenga en cuenta también que todos los procedimientos c…

Representative Results

La aparición de paso por cero de tipo salvaje, las colonias adultas SSC después de 7 días se muestra en la figura 1. Tridimensionales colonias están compuestas de una capa de células planas unidas a los alimentadores o de la matriz extracelular subordinado depositados por los alimentadores con múltiples capas de las ESC que crecen en la parte superior. Mientras las ESC sanos son brillantes refráctil y de manera uniforme 11 a 12 m de diámetro, los bordes de las celdas son difíciles de distinguir…

Discussion

Este método para derivar las ESC adultos con testículos adultos derivados de células de alimentación es robusto y ha tenido éxito cuando comunes orígenes genéticos (por ejemplo FVB, C57BL6 y mixtos 129SV/C57Bl/6) y diferentes cepas mutantes fueron empleados 2,3,7,14. De hecho, el microambiente creado por el sistema de cultivo es suficiente para superar algunas de las barreras genéticas a mantener las SSC adultos in vivo (por ejemplo, en el caso de PLZF – / – de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Estado de Nueva York Departamento de Salud (C026878). SM fue un New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Apoyado en parte por Beca de Investigación N º 5-FY11-571 de la March of Dimes Foundation.

Materials

Name of Reagent/ Material Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-013 Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA Mediatech 25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34) Life Technologies 10639-011 Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements various see Table 3 Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells Cell Biolabs, Inc. CBA-315 Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION) Sigma-Aldrich M4287 Toxic; Handle with care.
Gelatin Sigma-Aldrich G1890 0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope Advanced Microscopy Group
Table 1. Specific reagents and equipment.
*See Table 3
DMEM Corning 10-013 Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250) Life Technologies 27250-018 Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml Worthington CLS1 235 Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I Sigma-Aldrich DN25 Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin ICP Bio ABRE-100g Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM Life Technologies 10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement Life Technologies 10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids Sigma-Aldrich M7145 1X
MEM Vitamin solution Life Technologies 11120-052 1X
L-glutamine Mediatech 25-005 2 mM
bovine serum albumin ICP Bio ABRE 0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution Mediatech 30-004-CI 1X
D(+)glucose Sigma-Aldrich G8769 6 mg/ml
β-estradiol Sigma-Aldrich E2758 30 ng/ml
progesterone Calbiochem 5341 60 ng/ml
fetal bovine serum variable n/a 1%
bovine holo-transferrin Sigma-Aldrich T1283 100 μg/ml
insulin Gemini Bio-Products 700-112P 25 μg/ml
human GDNF Life Technologies PHC7041 10 ng/ml
human bFGF Life Technologies PHG0023 10 ng/ml
mouse EGF Life Technologies PHG0313 20 ng/ml
putrescine Research Organics 0778P 60 μM
sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261 30 nM
pyruvic acid Alfa Aesar A13875 30 μg/ml
DL-lactic acid J.T. Baker 0196-04 1 μg/ml
β-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023 50 μM
ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 100 μM
D-biotin Sigma-Aldrich B4639 10 μg/ml
Table 3. Stem cell medium
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.

References

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Cite This Article
Martin, L. A., Seandel, M. Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines. J. Vis. Exp. (72), e50017, doi:10.3791/50017 (2013).

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