Enriquecimiento de serie de la madre de espermatogonias y células progenitoras (SSC) en Cultura para la derivación de largo plazo de ratones adultos Líneas SSC

Summary

Un método sencillo para obtener y mantener la madre de espermatogonias y las líneas de células progenitoras de ratones adultos se presenta aquí. El método utiliza las células de alimentación se originan en el compartimiento de células somáticas de los testículos de ratón adulto. Esta técnica es aplicable a las cepas de ratones comunes, incluyendo transgénicos, knock-out y knock-en ratones.

Abstract

Madre de espermatogonias y células progenitoras (SSC) de los testículos representan un ejemplo clásico de las células madre adultas de mamífero y preservar la fertilidad durante casi toda la vida del animal. Aunque los mecanismos precisos que gobiernan la auto-renovación y diferenciación in vivo son difíciles de estudio, los sistemas se han desarrollado varios previamente para propagar las ESC murinas in vitro usando una combinación de medios de cultivo especializados y células alimentadoras ^1-3.

La mayoría de las incursiones in vitro sobre la biología de las ESC han derivado líneas celulares de los recién nacidos, posiblemente debido a la dificultad en la obtención de líneas de células adultas ^4. Sin embargo, el testículo continúa madurando hasta ~ 5 semanas de edad en la mayoría de las cepas de ratón. En el periodo post-natal período, los cambios dramáticos se producen en la arquitectura de los testículos y en la biología de las células somáticas y de espermatogénesis, incluyendo alteraciones en los niveles de expresión de numerosas células madre relacionadogenes. Por lo tanto, neonatalmente derivados de las líneas SSC no completamente puede recapitular la biología de las ESC adultos que persisten después de los testículos adultos ha alcanzado un estado estable.

Hay varios factores que han dificultado la producción de líneas de CSS históricamente adultos. En primer lugar, la proporción de células madre funcionales puede disminuir durante la edad adulta, ya sea debido a factores intrínsecos o extrínsecos ^5,6. Además, como con otras células madre adultas, que ha sido difícil para enriquecer las SSC suficientemente partir de células adultas testiculares totales sin utilizar una combinación de inmunoselección u otras estrategias de clasificación ^7. Estrategias comúnmente empleadas incluyen el uso de ratones criptórquidos como una fuente de células donantes debido a una mayor proporción de células madre para otros tipos de células ^8. Sobre la base de la hipótesis de que la eliminación de las células somáticas de la cultura inicial altera las interacciones con el nicho de células madre, que son esenciales para la supervivencia SSC, previamente desarrollado métodos para derivar l adultoines que no requieren inmunoselección o donantes criptórquidos sino más bien emplear enriquecimiento de serie de las ESC en cultivo, denominado en lo sucesivo SESC ^2,3.

El método se describe a continuación implica un procedimiento sencillo para derivar líneas SSC adultos mediante la disociación de adulto donante túbulos seminíferos, seguido de plaqueo de las células en los alimentadores que comprenden una línea de células del estroma testicular (JK1) ^3. A través de pasada en serie, fuertemente adherente, contaminando las células germinales no se agotan a partir del cultivo de enriquecimiento concomitante de SSC. Los cultivos producidos de esta manera contienen una mezcla de espermatogonias en diferentes estadios de diferenciación, que contienen las ESC, en base a largo plazo la capacidad de auto-renovación. El quid de la SESC método es que permite a CSC para hacer la difícil transición de la auto-renovación en vivo a largo plazo de la auto-renovación in vitro en un microambiente radicalmente diferente, produce a largo plazo las líneas de cooperación Sur-Sur, libre de contaminacióncélulas somáticas, y permite así la posterior manipulación experimental de las ESC.

Protocol

1. Preparación de células de alimentación Tenga en cuenta que todos los reactivos descritos a continuación deben ser preparados en forma estéril (ver Tablas 1 y 2). Este protocolo emplea la línea celular JK1 (célula Biolabs, Inc., catálogo # CBA-315) como alimentadores que es un derivado transformado de células adultas de ratón testiculares somáticos y se ha descrito en otra parte 3. Tenga en cuenta también que todos los procedimientos c…

Representative Results

La aparición de paso por cero de tipo salvaje, las colonias adultas SSC después de 7 días se muestra en la figura 1. Tridimensionales colonias están compuestas de una capa de células planas unidas a los alimentadores o de la matriz extracelular subordinado depositados por los alimentadores con múltiples capas de las ESC que crecen en la parte superior. Mientras las ESC sanos son brillantes refráctil y de manera uniforme 11 a 12 m de diámetro, los bordes de las celdas son difíciles de distinguir…

Discussion

Este método para derivar las ESC adultos con testículos adultos derivados de células de alimentación es robusto y ha tenido éxito cuando comunes orígenes genéticos (por ejemplo FVB, C57BL6 y mixtos 129SV/C57Bl/6) y diferentes cepas mutantes fueron empleados ^2,3,7,14. De hecho, el microambiente creado por el sistema de cultivo es suficiente para superar algunas de las barreras genéticas a mantener las SSC adultos in vivo (por ejemplo, en el caso de PLZF ^{– / – de…}

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	–
			Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
			Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
			Table 3. Stem cell medium
			*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
			**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.