Cilia genererade vätskeflöde i Kupffer s vesikel (KV) styr vänster-höger mönstring av zebrafisk embryot. Här beskriver vi en teknik för att modulera genfunktion specifikt i KV celler. Dessutom visar vi hur man levererar fluorescerande pärlor i KV att visualisera vätskeflöde.
Inre organ som hjärta, hjärna och tarm utvecklar vänster-höger (LR) asymmetrier som är kritiska för deras normala funktioner 1. Rörliga flimmerhår är involverade i upprättandet LR asymmetri i ryggradsdjur embryon, inklusive mus, groda, och zebrafisk 2-6. Dessa "LR cilier 'generera asymmetrisk fluidflöde som är nödvändig för att utlösa en konserverad asymmetrisk Nodal (TGF-β superfamiljen) signaleringskaskad i den vänstra sidoplattan mesoderm, vilket är tänkt att ge LR mönstring information för att utveckla organ 7. Således, för att förstå mekanismerna bakom LR mönstring, är det viktigt att identifiera gener som reglerar organisationen av LR cilierade celler, motilitet och längd LR cilier och deras förmåga att generera robusta asymmetriska flödet.
I zebrafisk embryo är LR cilier ligger i Kupffer s vesikler (KV) 2,4,5. KV består av ett enda skikt av monociliated epitelcellersom innesluter en vätskefyllda hålrum. Ödet kartläggning har visat att KV är härledd från en grupp av ~ 20-30 celler kända som dorsala föregångaren celler (DFCS) som migrerar vid den dorsala BLASTODERM marginalen under epiboly stegen 8,9. Under tidiga somit stadier, till DFCS kluster och differentierar till cilierade epitelceller bilda KV i tailbud av embryot 10,11. Förmågan att identifiera och spåra DFCS-i kombination med optisk transparens och snabb utveckling av zebrafisk embryo-make zebrafisk KV en utmärkt modell för att studera LR cilierade celler.
Intressant stamfäder DFC / KV cellhärstamning behåller cytoplasmiska broar mellan äggula cellen upp till 4 timmar efter befruktning (HPF), medan cytoplasmiska broar mellan äggulan cellen och andra embryonala celler nära efter 2 HPF 8. Med utnyttjande av dessa cytoplasmiska broar, utvecklade vi en scen-specifik injektion strategi att leverera morfolino oligonucleotides (MO) uteslutande DFCS och knockdown funktionen av en riktad gen i dessa celler 12. Denna teknik skapar chimära embryon som genfunktion slås ned i DFC / KV härstamning utvecklas inom ramen för en vildtyp embryo. För att analysera asymmetrisk vätskeflöde i KV, injicera vi fluorescerande mikropärlor till KV lumen och spela pärla rörelse med videomicroscopy 2. Fluidflöde är lätt visualiseras och kan kvantifieras genom att spåra vulst förskjutning över tiden.
Här, med hjälp av steg-specifika DFC-riktad teknik gen ÖVERVÄLDIGANDE och injektion av fluorescerande mikropärlor i KV att visualisera flödet presenterar vi ett protokoll som ger en effektiv metod för att karakterisera den roll en speciell gen under KV utveckling och funktion.
Använda steg-specifika injektioner att rikta MO till DFC / KV cellhärstamning är en användbar metod för att studera cell-autonomi geners funktion och undvika pleiotropa fenotyper som orsakas av den globala gen knockdown. Dock kan dessa injektioner vara tekniskt utmanande. Injektion av MO mellan de 256-cell och 1.000-cell steg kan resultera i tre möjliga utfall: 1) MO förblir aggregeras vid injektionsstället, 2) Mo diffunderar hela gulan och går DFC / KV celler eller 3) i MO diffunderar i hela gulan och går in …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Fiona Foley för utmärkt labb stöd och zebrafisk vård. Detta arbete stöddes en AHA predoctoral gemenskap GW (11PRE5730027) och NHLBI bidrag till HJY (R01HL66292) och JDA (R01HL095690).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | |
Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | |
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |