זרימת cilia שנוצר נוזל בשלפוחיות של Kupffer (KV) שולטת דפוסים של שמאל וימין של עובר דג הזברה. כאן, אנו מתארים טכניקה לווסת תפקוד גן ספציפי בתאי KV. בנוסף, אנו מראים כיצד לספק חרוזי ניאון לKV לדמיין זרימת נוזל.
איברים פנימיים כגון לב, מוח, מעיים ולפתח סימטריות שמאל ימין (LR) כי הם קריטיים עבור הפונקציות הרגילות שלהם 1. ריסים ניעתי מעורבים בהקמת LR אסימטריה בעוברי החולייתנים, כוללים עכבר, צפרדע, ודג זברה 2-6. "הריסים" הללו LR לייצר זרימת נוזל סימטרית שיש צורך לעורר סימטרי קטרי משומר (TGF-β superfamily) איתות מפל במזודרם צלחת הרוחב מהשמאל, שהוא חשב לספק מידע דפוסי LR לפיתוח איברים 7. לכן, כדי להבין את המנגנונים בבסיס דפוסי LR, זה חיוני לזיהוי גנים ששולטים בארגון של תאי ריסי LR, תנועתיות ואורך ריסי LR והיכולת שלהם לייצר תזרים חזק סימטרי.
בעובר דג הזברה, ריסי LR נמצאים בשלפוחית של Kupffer (KV) 2,4,5. KV מורכב משכבה אחת של תאי האפיתל monociliatedשמצרפים לום מלא נוזל. מיפוי הגורל הראה כי KV נגזר מקבוצה של 20-30 ~ תאים המכונית תאי גב Forerunner (DFCs) שנודדים בשולי blastoderm הגבו במהלך שלבי epiboly 8,9. במהלך השלבים מוקדמים somite, אשכול DFCs ולהתמיין לתאי אפיתל ריסים כדי ליצור KV בtailbud של העובר 10,11. היכולת לזהות ולעקוב אחר DFCs-בשילוב עם שקיפות אופטית והתפתחות מהירה של עובר דג זברת דג הזברה KV-להפוך את מערכת מודל מצוינת ללמוד תאי ריסי LR.
מעניין, אבות של המשפחה של תאי DFC / KV לשמור גשרי cytoplasmic בין תא החלמון עד 4 לאחר הפרית שעה (hpf), ואילו גשרי cytoplasmic בין תא החלמון והתאים עובריים אחרים הקרוב לאחר 2 hpf 8. ניצול של גשרי cytoplasmic אלה, פתחו אסטרטגית הזרקת שלב ספציפית, כדי לספק morpholino oligonucleotides (MO) באופן בלעדי לDFCs ומציאת הפונקציה של גן מטרה בתאים 12 אלה. טכניקה זו יוצרת עוברי chimeric שבתפקוד הגן הוא הפיל אותי בשושלת DFC / KV פיתוח בהקשר של עובר פראי מסוג. כדי לנתח את זרימת נוזל סימטרית בKV, אנחנו מזריקים microbeads ניאון לKV הלום ותנועת חרוז שיא באמצעות videomicroscopy 2. זרימת נוזל בקלות ודמיין ניתן לכמת על ידי מעקב עקירת חרוז לאורך זמן.
הנה, באמצעות טכניקת במה הספציפית DFC ממוקד מציאת הגן וההזרקה של microbeads ניאון לKV לדמיין זרימה, אנו מציגים פרוטוקול המספק גישה יעילה כדי לאפיין את תפקידו של גן מסוים בזמן ההתפתחות ותפקוד KV.
שימוש בזריקות שלב ספציפיים כדי למקד MO למשפחה של תאי DFC / KV הוא גישה שימושית ללמוד תא האוטונומיה של תפקוד גן ולהימנע פנוטיפים pleiotropic נגרמים על ידי מציאת גנים העולמית. עם זאת, הזריקות האלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית. הזרקה של MO בין שלבי 256-תא והתא 1000 עלולה לגרום לשל?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים על תמיכת פיונה פולי מעבדה מצוינת וטיפול דג זברה. עבודה זו נתמכה על מלגת AHA predoctoral לGW (11PRE5730027) ומענקי NHLBI לHJY (R01HL66292) ורשות לפיתוח ירושלים (R01HL095690).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | |
Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | |
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |