Summary
Мы описываем метод флуоресцентной микроскопии, Co-трансляционной активации путем расщепления (CoTrAC), чтобы изображение производстве белковых молекул в живых клетках с одной молекулой точности без возмущающей функции белка. Этот метод был использован следовать стохастической динамики экспрессии фактора транскрипции, λ-репрессор CI
Abstract
Мы описываем метод флуоресцентной микроскопии, Co-трансляционной активации путем расщепления (CoTrAC), чтобы изображение производстве белковых молекул в живых клетках с одной молекулой точности без возмущающей функции белка. Этот метод позволяет подсчитать количество молекул белка производится в одной ячейке в течение последовательного, пять минут времени Windows. Это требует флуоресцентного микроскопа с лазерным возбуждением плотности мощности ~ 0,5 до 1 кВт / см 2, что является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить одну флуоресцентных молекул белков в живых клетках. Флуоресцентные репортера, используемые в этом методе состоит из трех частей: мембранной ориентации последовательности, быстро созревания, желтый флуоресцентный белок и последовательность протеазы признание. Репортер трансляционно слитый с N-конца белка. Клетки, выращенные на контролируемой температурой столик микроскопа. Каждые пять минут, флуоресцентных молекул внутри клеток загружаются (а затем и сотрудничествоunted путем анализа флуоресцентных изображений), а затем photobleached так, что только недавно переведенных белков учитываются в следующее измерение.
Флуоресценция изображения в результате этого метода могут быть проанализированы путем обнаружения флуоресцентных мест в каждом изображении, назначая их на отдельные клетки, а затем присвоение клетки к клетке линий. Количество белков, продуцируемых в течение временного окна в данной ячейке рассчитывается путем деления интегрированной интенсивности флуоресценции пятен на среднюю интенсивность одного флуоресцентных молекул. Мы использовали этот метод для измерения уровня экспрессии в диапазоне 0-45 молекул в одном 5 окон мин времени. Этот метод позволил нам измерить шум в выражении λ-репрессор CI, и имеет много других потенциальных приложений в системной биологии.
Protocol
1. Рабочий процесс деформации инженерных
- Вставьте последовательности, кодирующие (а) мембрана-последовательность локализации, (б) быстрого созревания флуоресцентного белка (в) последовательность протеазы признания N-терминал и в рамке с белком интерес (например, фактор транскрипции). Мы использовали мембраны целевых TSR-Венера репортера 2 и плавленого его в последовательность протеазы признание Убиквитин (Ub) для подсчета количества выразил бактериофага λ-репрессор белковых молекул CI. Подробнее о том, как мы построили гибридный белок TSR-Венера-Ub-CI, заменив дикого типа CI кодирующей области и включение в конструкцию E. хромосомы кишечной использованием λ Красной рекомбинации 3, подробно описаны в работе. 1.
- Убедитесь, что все модификации путем секвенирования.
- Преобразование плазмиды, кодирующей протеазу, характерные для признания последовательности использовали выше в штамм, выразив флуоресцентные репортер и белокВ поступательного синтеза. Мы использовали Ubp1 протеазы, которая расщепляет сразу после С-концевой остаток Убиквитин 4.
2. Культура клеток и подготовка образцов
- Выберите один E. Колония кишечной интерес с прожилками свежей пластинке агара в 1 мл M9 минимальной СМИ 5 дополнен 1X MEM аминокислот и соответствующих антибиотиков. Инкубировать в шейкере на желаемую температуру достаточно долго, чтобы достичь OD 600> 1,0 (оптической плотности при 600 нм).
- Развести культуры в 1 мл свежей среды M9 с соответствующими антибиотиками, чтобы OD 600 = 0,02. Инкубировать в шейкере при соответствующей температуре. Начальная плотность сотовой может быть увеличен в случае необходимости для низкотемпературного роста.
- Когда OD 600 = 0,2-0,3 (при 37 ° C с начальной клеточной культуры при OD 600 = 0,02, это займет 3-4 часа), начать подготовку агарозном геле панели (шаг 3).
- Клетки готовы для работы с изображениями, когда OD
- Передача 1 мл инкубировали культуры в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, центрифуги при 10000 х г в течение 1 мин в настольной микроцентрифуге.
- Удалите супернатант и добавляют 1 мл свежей среды M9 и ресуспендируют осадок осторожно.
- Центрифуга при 10000 х г в течение 1 мин.
- Повторите шаг 1,6 и 1,7. Удалите супернатант.
- Аккуратно ресуспендируют в 1 мл M9 СМИ. Клетки могут быть непосредственно использованы для визуализации микроскопа или разбавленный 10 - 100-кратный для обеспечения низкой плотности клеток для интервальной съемки изображений. Обратите внимание, что низкая плотность клетки имеют важное значение для расширенной визуализации интервальной съемки. Камера изображений (этап 4) запечатан в ходе эксперимента. В связи с экспоненциальным ростом клеток, высокой начальной концентрации клеток могут в значительной степени истощить кислорода в камере после длительного роста в гель площадку, снижение флуоресцентного белка и созревание влияет рост клеток.
3. Приготовьте раствор агарозы
- Взвешивание 10-20 мглегкоплавкие температуры агарозы в 1,5 мл микроцентрифужных трубку.
- Добавить соответствующий объем M9 минимальной среде без антибиотиков, чтобы сделать 3% агарозном решение.
- Нагрейте раствор агарозы в течение 30 мин при 70 ° С, чтобы расплавить, переворачивая трубку для того, чтобы решение полностью расплавляется и однородной. Гель площадку можно заливать в этот момент (этап 4) или температура может быть снижена до 50 ° С и выдерживают в течение нескольких часов для последующего использования.
4. Подготовка Gel Pad по палате
- Около 50 минут до визуализации, промыть Microaqueduct слайд с водой.
- Промыть не убрал покровного стекла (с помощью строгих методов очистки, таких как описано в 6) и Microaqueduct слайд стерильной водой и сухим путем продувки сжатым воздухом.
- Установите резиновую прокладку на Microaqueduct слайд так, чтобы она покрывала входы и выходы на стекле стороны Microaqueduct слайд (это может быть модифицирован для применения вКакой носитель перфузии через образец). Применяют 50 мкл раствора агарозы (шаг 3) в центре Microaqueduct слайд.
- Топ решение агарозы с очищенную, сухую стеклянную крышку.
- Пусть решение агарозном стоять при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Между тем, подготовка ячейки образца (шаг 2).
- Аккуратно снимите крышку стекла от верхней площадки геля. Добавить 1,0 мкл промытых культуры клеток в верхней части геля площадку. Подождите ~ 2 мин для культуры, поглощаемой гель площадку. Важно не ждать так долго, что overdries гель площадку, но достаточно долго, что клетки должным образом соблюдать гель площадку. Идеальное время ожидания зависит от температуры и влажности.
- Во время ожидания, высушите другую предварительно очищенные стеклянной крышкой.
- Крышка образца с новой стеклянной крышкой обеспечения того, чтобы стеклянной крышкой и Microaqueduct слайде хорошо выровнен.
- Установите камеру с контролируемой температурой роста в соответствии с инструкциями производителя.Теперь она может быть использована для работы с изображениями на микроскопе (шаг 5).
5. Изображений и приобретение Timelapse фильмы
- Включите лазерный микроскоп и в соответствии с инструкциями завода-изготовителя (например, лазерное, возможно, потребуется разогревается в течение ~ 0,5 часа до начала эксперимента).
- Блокировка собрал камеру на сцену вставки на микроскопе. Установите температуру роста камеры и цели нагревателя при температуре 37 ° C или другого желаемого роста температуры.
- Если изображение выше комнатной температуры, в центре внимания или гель площадку, как правило, значительно дрейфовать в течение ~ 15 мин после первой смены температуры. На практике, использовать это время, чтобы найти регионах, представляющих интерес и изменять изображения скрипты, необходимые для эксперимента.
- Найти клетки под микроскопом и сохранить положение каждой ячейки после центрирования его в течение предопределенного и приведены в соответствие изображений регионе. Более одной клетке может быть отображена в каждом окне захвата изображений. Для интервальной съемки изображений по тлюбого поколения, убедитесь, что отображаемого клеток изначально отделены от других клеток по меньшей мере, несколько сотен мкм, так что другие колонии не войдете в области визуализации во время роста.
- Регулировка интенсивности лазерного возбуждения, так что почти все флуоресцентные молекулы photobleach в течение 6 экспозиций (рис. 5).
- Использование автоматизированных сценариев изображения / журнала, приобретение Timelapse данных с помощью алгоритма, описанного в экспериментальном рабочий процесс на рисунке 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные результаты эксперимента CoTrAC отслеживания производства λ-репрессор CI показаны на рисунках 4 и 5. В этом эксперименте, 12 колоний были обследованы на каждые 5 мин. В каждый момент времени, в колонии впервые autofocused и централизованное в рамках изображений регионе. Далее, центрированной / целенаправленной позиции были сохранены и образ светлого был приобретен. Сцена была затем перемещаются на ~ 0,5 мкм вдоль оси перехода от светлого фокальной плоскости в плоскость рассекает клетки (без фазового контрастного или дифференциального интерференционного контраста (DIC) Оптика, полупрозрачные объекты могут быть отображены на несколько вне фокуса самолеты 8). Наконец, шесть изображений были получены с интервалом в 1 секунду, каждый с 100 мс экспозиции (На рисунке 5 показана одна такая точка времени). Это повторяется для всех ячеек в каждый момент времени. Потому что почти все Venus молекул photobleached в каждой временной точке, флуоресценцияпроцентов мест в рисунках 4 и 5 соответствуют Венеры молекулы, которые созрели (стали флуоресцентные) в течение последних 5 мин. Венера молекул созревают быстрее в естественных условиях с периодом полураспада ~ 2-7 мин 1, 2, 7 и расщепления Ubp1 очень эффективна 4, 9. Таким образом, число белковых молекул произведенного с момента последнего измерения можно точно судить по числу молекул Venus рассчитывает на мембране.
Рисунок 1. Использование CoTrAC считать выражением одной молекулы фактора транскрипции. (1) Репортер в том числе мембранных локализации последовательности TSR, быстрого созревания YFP Венеры и Убиквитин (Ub) выражается в поступательное слияния с фактором транскрипции от продвиэ регулируется фактором транскрипции. (2) протеазы Ubp1 со-поступательно расщепляет растущей полипептидной после C-концевого остатка Ub. (3) TSR-Венера-Ub репортер локализуется на мембране, где он может рассчитывать на одного -молекулярном уровне. (4) транскрипционный фактор может регулировать свое выражение. Метод мультфильма.
Рисунок 2. Схема камеры образцов, используемых в CoTrAC экспериментов. Клетки помещаются между агарозном геле панели и крышку стекла. Microaqueduct слайдов и объективные проводится при фиксированной температуре с помощью электронного контроллера. Подготовка образцов.
Рисунок 3. Workflow типичного эксперимента CoTrAC. Экспериментыпсихического процесса.
Рисунок 4. Типичные данные Timelapse от эксперимента CoTrAC. Изображения из одной колонии показаны на 25 минутные интервалы. В этом эксперименте были получены данные каждые 5 минут из 12 различных колоний. (A) Светлое изображение. (B) Венера (YFP) флуоресценции изображение (средний фон вычитается из счета для изменения фона всему полю изображения с течением времени). (C ) Наложение изображения показывает полюс локализации TSR-Венера-Ub репортера молекул и неоднородность в число молекул производится в течение 5 мин временных окон в разных клетках (светлое изображение переворачивается и Венера изображение полосовым фильтром). Нажмите чпрежде чем, чтобы увеличить цифру.
Рисунок 5. Типичные данные из одной точки времени в эксперименте CoTrAC. (A) Венера (YFP) флуоресцентных изображений. Шесть 100 мс экспозиции были приобретены в начале каждого 5 промежуток времени мин. Каждый из 6 кадров был отделен на 900 мс, чтобы дать время для временно темные молекул Венеры, которая погас, чтобы стать флуоресцентные. (B) Для анализа изображения 6 вычитается из изображений 1 до коррекции небеленой молекул и автофлуоресценции фоне. Места в этом образе локализованы в конкретных линий клеток и количественно их комплексной интенсивности флуоресценции. (C) средние интегрированные флуоресценции колонии построена в течение 6 фотографий (такКрышка линия). Установка этой линии экспоненциальный спад плюс постоянное смещение (пунктирная линия) дает полураспада время 1 сек. В этом эксперименте, Венеры молекулы photobleach гораздо быстрее, чем сотовые автофлуоресценции, таким образом, это означает, что примерно половина от общего числа молекул Венера photobleached в каждом кадре. Фотообесцвечивания прогресса в одной точке времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод CoTrAC может быть обобщен для измерения производства других белков, где обычные N-или С-концевых флуоресцентного белка слияния могут привести к нарушению активности белка. Стратегия CoTrAC имеет три уникальных преимуществ по сравнению с существующими методами. Во-первых, со-поступательные слияния гарантирует, что одной молекулы флуоресцентного репортер производится для каждой молекулы белка, позволяющие точный подсчет белков производство в режиме реального времени. Во-вторых, мембрана-целевого репортер TSR-Венера дает возможность одной молекулы флуоресцентного обнаружения журналистам, что позволяет обнаружения белков, высказанные на очень низком уровне. Третье и самое главное, со-поступательные расщепления флуоресцентные репортер позволяет интерес белка сохранить свою почти последовательность дикого типа и нормально функционировать, использующих Убиквитин как протеазы распознавания последовательности в E. палочки, белки-мишени только отличаются от дикого типа пептидных последовательностей в том, что первые N-терминал N </ EM>-формил-метионин изменилось в метионин.
При использовании CoTrAC метод, важно иметь в виду, что метод CoTrAC измеряет количество молекул белка производится на каждом 5-минутные перерывы окно, которое отличается от измерения количества белковых молекул в клетку настоящего (т. е. Концентрация белка). Большинство одноклеточных флуоресценции экспрессии генов анализы мера концентрации белка, который является сбалансированным результате производства белка и деградации. Таким образом, скорость разложения белка интереса, должно быть рассмотрено, если измерения концентрации используется для вывода информации производства белка. Кроме того, концентрация белка зависит от колебаний, вызванных перегородки белка между двумя дочерними клетками при делении клеток, которые могут иметь значение для низкого уровня выражения белков и ошибочно интерпретированы как связанные с динамикой производства белка. Метод CoTrAC может быть модификацийFied для измерения концентрации белка, не фотообесцвечивания вновь образующихся молекул репортером, но это должно быть сделано с дополнительной проверке. Надо убедиться, что темпы деградации люминесцентных репортер и белок похожи, и что они оба так же разделена на две дочерние клетки при делении клеток, так что концентрация флуоресцентного репортер отражает то, что белка интерес.
Отметим, что в то время как CoTrAC не меняет последовательность белка, добавление ген-репортер меняет последовательности мРНК. Таким образом, транскрипции и трансляции динамики и / или мРНК цены стенограммы деградация может быть возмущенным. Если метод CoTrAC используется для наблюдения белка в дикий тип контекста, важно, чтобы сравнить уровни экспрессии белка-мишени, как в свое последовательность дикого типа и с CoTrAC флуоресцентной метки синтеза (например, в исх. 1, по сравнению CI выражение в нашем CoTrAC строительствот к, что в дикого типа lysogen). Ниже мы обсудим соображения необходимы для обобщения CoTrAC метод.
Во-первых, мы обсудим возможность использования последовательностей, кроме TSR-Венера-Ub. Общие требования: (1) журналист должен быть локализован в некоторой позиции в клетке так, чтобы она не распространяют быстро (с TSR, журналисты находятся в клетке полюсов 1). Это необходимо для одной молекулы обнаружения флуоресцентные молекулы белка, как сигнал от быстро диффундирующего флуоресцентные молекулы белка, как правило, не может быть определен выше аутофлуоресцентной фона ячейки; (2), флуоресцентного белка должно быть достаточно ярким, чтобы быть обнаружены на одиночных молекул уровня и должен созреть (стать флуоресцентные) достаточно быстро для нужного приложения (Венера является самой созревание флуоресцентного белка на сегодняшний день 7), (3), флуоресцентного белка должно быть photobleached после обнаружения, так что новые флуоресцентные белки могут быть де-защищена в последующие моменты времени (флуоресцентные белки, которые являются слишком устойчивы к фотообесцвечивания нежелательно как чрезмерное воздействие лазера может привести к фототоксичности артефакты), (4), последовательность протеазы признанию, не могут оставлять любые остаточные аминокислоты на белки Интересно, что будет возмущать его функциональность (Ubp1 расщепляет сразу после карбокси-концевой остаток Ub, не оставляя никаких дополнительных остатков на всех).
Во-вторых, необходимо убедиться, что репортер надлежащим образом выраженного и расщепляются. Протеолитические расщепления отделения репортер из интересующего белка должно быть эффективным; расщепления эффективность может быть измерена с помощью вестерн-блот против репортера, интерес белка или оба (антитела являются коммерчески доступными для многих флуоресцентные белки, такие как анти-GFP антител JL- 8 из Clontech, который связывает Венера в вестерн-блот). Следует обеспечить, чтобы ни нерасщепленного гибридный белок обнаружен в кляксы против лизатов клеток, экспрессирующих слияниябелка на более высоких уровнях, чем те, ожидается в CoTrAC экспериментов. Кроме того, репортер и интерес белка должно быть произведено в соотношении 1:1 после расщепления. Это может быть проверено путем измерения интенсивности полос дрова в борьбе с репортером и анти-белка интересов, западные пятна нормированные интенсивности полос в нерасщепленного штаммы не хватает протеазы. Если репортер и белок присутствует в соотношении 1:1 после расщепления, то:
Заметим, что поскольку западные показатель концентрации белка кляксы, в результате соотношение будет отклоняться от 1:1, если репортер и интерес белка обладают разной скоростью деградации после расщепления.
В-третьих, следует убедиться, что белок обладает ожидаемой функциональностью после расщепления. Наличие большого репортер построить слияния и / или локализации к клеточной мембране, как ожидается, инактивирует большинство факторов транскрипции (λ-репрессор CI был одним изmpletely неактивных без Ubp1 выражение в наших экспериментах 1). Трансформация протеазы, экспрессирующих плазмид следует активировать белок, освобождая белок от громоздких поступательного теги синтеза. Это явление приводит к другим возможным CoTrAC приложений. Расщепление на Ub карбокси по Ubp1 была использована подвергать неканонических амино-концевых аминокислот выяснить бактериальной N-конце правило деградации белков 9. Если слияние с большими, ассоциированных с мембранами репортер инактивирует фактор транскрипции (или других белков, таких как фермент), его деятельность может быть быстро восстановлены вызывающим выражением протеазы. CoTrAC может быть использован для очень быстро "включить" существующий пул транскрипционных факторов путем удаления / добавления ингибитора / со-активатора или в противном случае инициирования выражения протеазы или деятельности. Наконец, выражение флуоресцентные репортер может возмутить клеточной физиологии и оно должно быть обеспечено, что такие свойства, как клеткиВремя цикла не изменяются, а в эксперимент, описанный в ссылке. 1, мы использовали Tsr белка мембраны локализация последовательности, потому что Tsr уже высоко выразил мембранного белка и небольшое увеличение экспрессии Tsr был не повлияет на поведение клеток.
В-четвертых, когда репортер последовательности, кроме специально обсуждался TSR-Венера-Ub используется, соответствующий протокол изображения также должны быть изменены по мере необходимости. Например, различные флуоресцентные белки потребуются различные протоколы освещения, чтобы добиться хорошего баланса между эффективной обнаружения флуоресцентных молекул белка, фототоксичности от лазерного воздействия и фотообесцвечивания. В идеале, лазерного возбуждения должна быть на пике поглощения выбранной флуоресцентного белка;-пик возбуждения требует более высокой интенсивности возбуждения (и, следовательно, высокие фототоксичности и автофлуоресценции фона) для достижения того же флуоресцентное излучение белка и фотообесцвечивания характеристики. Кроме того,визуализации частота может быть изменена, чтобы быть быстрее или медленнее, чем на 5 мин в зависимости от толерантности клеток к фототоксичности лазерного воздействия. В наших экспериментах, 12 отдельных E. палочки колонии были обследованы каждые 5 минут и затем в течение 7-8 циклов клетки до наблюдения существенные недостатки фототоксичности 1.
Наконец, после покадровой фильмы белка производства, приобретенных в результате эксперимента CoTrAC (примеры показаны на рисунках 4 и 5), флуоресцентные экспрессии белка должна быть определена количественно путем определения флуоресцентные пятна, соответствующие одному или нескольким молекулам, назначение молекул отдельных клеток и отслеживание клеточных клонов. Мы описали настраиваемого Matlab для изучения λ-репрессор производства CI 1. Короче говоря, нужно сначала определить контуры отдельных клеток и времени точки, соответствующие деления клеток в светлое изображение при отслеживании клеточных клонов через последующий кадр изображенияс. Мы обнаружили, что 5 минут интервал времени был достаточно коротким, что ячейки в одном кадре обычно соответствует ячейке в предыдущем кадре, с которым она разделяет большинство пикселей в сегментированных изображений. В случаях, когда случайные большие сдвиги колоний между двумя последовательными кадрами не наблюдалось, ручное назначение отдельных клеток, чтобы их линии не требуется. Далее, нужно определить флуоресцентные пятна и количественной оценки их интенсивности. Мы обнаружили, что флуоресцентные пятна могут быть идентифицированы путем (1) полосовой фильтрации флуоресценции изображение, чтобы удалить низкочастотные фоновой флуоресценции (например, автофлуоресценции) и высокочастотных помех, (2) пороговой изображения на основе интенсивности флуоресценции и (3) выявление объектов больше, чем несколько пикселей в изображении thresholded. Объекты в thresholded изображения были пригодны для 2-мерного гауссова функция плюс постоянный фон, и интегральной интенсивности месте было принято как продукт подходит амплитуды и дисперсии.В наших опытах, несколько TSR-Венера-Ub журналисты часто совместно локализованных на полюсах клетки, создавая пятна, которые были ярче, чем от одного TSR-Венера молекул. Число молекул Венера в одном месте количественно путем деления интегральной интенсивности месте по интенсивности флуоресценции одной молекулы Венеры, которая была количественно с помощью низких уровня выражения штамм, в котором пятна редко содержат более одного флуоресцентного белка молекулу. Это измерение может быть дополнена с в пробирке измерения одной флуоресцентных молекул белка привязана к стеклу. Мы обнаружили, что флуоресцентные свойства белков во многом схожи в в естественных условиях и в пробирке систем с аналогичными условиями буфера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У нас нет никаких раскрытий.
Acknowledgments
Плазмиды pCG001 выражения Ubp1 была любезно предоставлена Rohan Baker на Джон Кертин Школа медицинских исследований. Эта работа финансировалась по март Dimes грант 1-2011 финансового года, марте Dimes Василия О'Коннор Автор научный сотрудник Award # 5-FY20 и NSF КАРЬЕРА награду 0746796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
