Summary
Descreve-se um método de fluorescência microscopia, Activation Co-translacional pela clivagem (CoTrAC), a imagem a produção de moléculas de proteína de células vivas com uma única molécula de precisão, sem perturbar a funcionalidade da proteína. Este método tem sido utilizado para seguir as dinâmicas de expressão estocásticos de um factor de transcrição, o repressor CI λ
Abstract
Descreve-se um método de fluorescência microscopia, Activation Co-translacional pela clivagem (CoTrAC) a imagem a produção de moléculas de proteína de células vivas com uma única molécula de precisão, sem perturbar a funcionalidade da proteína. Este método faz com que seja possível contar o número de moléculas de proteínas produzidas em uma célula durante sequenciais, as janelas de tempo de cinco minutos. Ela requer um microscópio de fluorescência com o laser de densidade de potência de excitação de ~ 0,5-1 kW / cm 2, o que é suficientemente sensível para detectar moléculas individuais de proteínas fluorescentes em células vivas. O repórter fluorescente usada neste método consiste em três partes: uma sequência de membrana alvo, um amadurecimento rápido, proteína fluorescente amarela e uma sequência de reconhecimento de protease. O repórter é traducionalmente fundidas com o N-terminal de uma proteína de interesse. As células são cultivadas em um estágio de microscópio de temperatura controlada. De cinco em cinco minutos, moléculas fluorescentes no interior das células são criadas imagens (e mais tarde coUnted, analisando imagens de fluorescência) e, posteriormente, Foto-descoloração, de modo que apenas as proteínas recém-convertidos são contados na medição seguinte.
Imagens de fluorescência resultantes deste método podem ser analisados por detecção de manchas fluorescentes em cada imagem, atribuindo-lhes a células individuais e, em seguida, a atribuição de células de linhagens de células. O número de proteínas produzidas dentro de uma janela de tempo numa dada célula é calculado dividindo-se a intensidade de fluorescência das manchas integrada com a intensidade média de moléculas fluorescentes individuais. Foi utilizado este método para medir os níveis de expressão na gama de 0-45 moléculas individuais em janelas de tempo 5 min. Este método permitiu-nos medir o ruído na expressão do repressor λ CI, e tem muitas outras aplicações potenciais em sistemas de biologia.
Protocol
1. Fluxo de Trabalho de Engenharia tensão
- Inserir as sequências de codificação (a) uma sequência de localização da membrana, (b) uma proteína fluorescente amadurecimento rápido e (c) uma sequência de reconhecimento de protease N-terminal e para a armação com uma proteína de interesse (por exemplo, um factor de transcrição). Utilizou-se a membrana alvo Tsr-Venus repórter 2 e fundiu-o para a sequência de reconhecimento da protease de Ubiquitina (Ub) para contar o número de moléculas expressas bacteriófagos λ proteína repressora CI. Detalhes sobre como se construídas a proteína de fusão Tsr-Venus-Ub-CI, em substituição do tipo selvagem CI região codificante e que incorpora o arquétipo na E. cromossoma coli utilizando λ recombinação Red 3, estão descritos em detalhe na ref. 1.
- Verifique se todas as modificações por seqüenciamento.
- Transformar um plasmídeo que codifica uma protease específica para a sequência de reconhecimento usado acima para uma estirpe que expressa o repórter fluorescente e proteína de interesseem fusão traducional. Utilizou-se a protease Ubp1, que cliva imediatamente a seguir ao resíduo C-terminal da ubiquitina 4.
2. As células de cultura e preparar a amostra
- Escolha um E. coli colónia de interesse a partir de uma placa de agar de fresco listado em 1 ml M9 meio mínimo suplementado com 5 1X ácidos aminados do MAM e antibióticos apropriados. Incubar num agitador à temperatura desejada por tempo suficiente para alcançar OD 600> 1.0 (densidade óptica a 600 nm).
- Dilui-se a cultura em um meio M9 ml fresco com os antibióticos apropriados para a = 0,02 OD 600. Incubar num agitador à temperatura apropriada. Densidade celular inicial pode ser aumentada, se necessário para a baixa temperatura de crescimento.
- Quando o OD 600 = 0,2-0,3 (a 37 ° C, com uma cultura inicial de células de DO600 = 0,02, isso vai levar 3-4 horas), iniciar a preparação do gel de agarose a almofada (passo 3).
- As células estão prontas para imagiologia quando OD
- Transferir 1 ml da cultura incubada num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, de centrifugação a 10000 xg durante 1 minuto numa microcentrífuga de bancada.
- Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco M9 e ressuspender o pellet cuidadosamente.
- Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min.
- Repita o passo 1,6 e 1,7. Descartar o sobrenadante.
- Delicadamente ressuspender em 1 ml M9 mídia. As células podem ser directamente utilizados para imagiologia de microscópio ou 10 diluída - a 100 vezes para assegurar densidades celulares baixas para imagiologia timelapse. Note-se que as densidades celulares baixas são importantes para a imagiologia timelapse estendida. A câmara de imagem (passo 4) é vedada durante a experiência. Devido ao crescimento exponencial de células, as concentrações de células iniciais elevadas podem reduzir significativamente o oxigénio no interior da câmara após crescimento prolongado na almofada de gel, reduzindo a maturação da proteína fluorescente e que afectam o crescimento das células.
3. Preparar a solução de agarose
- Pesar 10-20 mgbaixo ponto de fusão à temperatura de agarose para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Adicionar adequado volume médio mínimo M9 sem antibióticos para fazer uma solução de 3% de agarose.
- Aquece-se a solução de agarose durante 30 min a 70 ° C para derreter, invertendo o tubo para assegurar que a solução é completamente fundida e homogénea. A almofada de gel pode ser vertido neste ponto (passo 4), ou a temperatura pode ser reduzida para 50 ° C e mantida durante várias horas para uso posterior.
4. Prepare Pad Gel na Câmara
- Cerca de 50 min antes da imagiologia, lavar uma corrediça Microaqueduct com água.
- Lavar uma cobertura de vidro limpas (usando um método rigoroso de limpeza como o descrito no ponto 6) e Microaqueduct lâmina com água estéril e seco por sopragem com ar comprimido.
- Coloque a junta de borracha na corrediça Microaqueduct modo que cubra as entradas e saídas do lado da lâmina de vidro Microaqueduct (este pode ser modificado para aplicações emque a mídia é perfundido através da amostra). Aplicar 50 ul de solução de agarose (passo 3) para o centro da lâmina Microaqueduct.
- Topo da solução de agarose com a tampa de vidro limpo, seco.
- Deixar a solução de agarose mantida à temperatura ambiente durante 30 min.
- Enquanto isso, a preparar uma amostra de células (passo 2).
- Retire cuidadosamente o vidro de cobertura da parte superior da almofada de gel. Adicionar 1,0 uL de cultura de células lavadas a parte superior da almofada de gel. Espere por ~ 2 min para a cultura a ser absorvido pela almofada de gel. É importante não esperar tanto tempo que os overdries almofada de gel, mas tempo suficiente para que as células estão devidamente aderiu à almofada de gel. O tempo ideal de espera vai variar com a temperatura e umidade.
- Enquanto espera, secar outra tampa de vidro previamente limpas.
- Cobrir a amostra com a tampa de vidro novo assegurando que a tampa de vidro deslizante e Microaqueduct estão bem alinhados.
- Montar a temperatura da câmara de crescimento controlado seguindo as instruções do fabricante.Pode agora ser usado para imagens com microscópio (passo 5).
5. Imagem e Aquisição de Filmes Timelapse
- Ligar o laser e microscópio seguindo as instruções do fabricante (por exemplo, o laser pode precisar aquecido para ~ 0,5 h antes da experiência).
- Bloquear a câmara montada na fase de inserção no microscópio. Definir a temperatura da câmara de crescimento e o aquecedor objectivo, a 37 ° C ou a temperatura de crescimento desejado outro.
- Se imaging acima da temperatura ambiente, o foco ou almofada de gel, normalmente deriva significativamente para ~ 15 min após a mudança de temperatura inicial. Na prática, usar este tempo para encontrar regiões de interesse e modificar os scripts de imagem como necessário para uma experiência.
- Encontrar as células no microscópio e armazenar a posição de cada célula após centrando-o dentro de uma região de imagem pré-definidos e alinhados. Mais do que uma célula pode ser trabalhada em cada janela de tempo de aquisição de imagem. Para timelapse imagens sobre mquaisquer gerações, assegurar que as células são inicialmente separadas imaged de outras células por pelo menos algumas centenas de ^ M, de modo que outras colónias não irá entrar na região de imagem durante o crescimento.
- Ajustar a intensidade da excitação com laser, de modo que quase toda a Fotobranqueador moléculas fluorescentes dentro de 6 posições (Figura 5).
- Usando um script de imagem automatizado / jornal, adquirir dados timelapse utilizando o algoritmo descrito no fluxo de trabalho experimental na Figura 3.
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Representative Results
Os resultados típicos de uma experiência CoTrAC rastrear a produção do repressor λ CI são mostrados nas Figuras 4 e 5. Nesta experiência, foram obtidas imagens de 12 colónias em intervalos de 5 min. Em cada ponto de tempo, a colónia foi autofocused, centralizado no interior da região da imagem latente. Em seguida, a posição centrada / foco foi armazenada e uma imagem de campo claro foi adquirido. O palco foi então translocado por ~ 0,5 m ao longo do eixo z para mover a partir do plano focal de campo claro ao plano que divide as células (sem contraste de fase ou o contraste de interferência diferencial (DIC) óptica, semi-transparentes objetos podem ser visualizados em pouco fora de foco-aviões 8). Finalmente, seis imagens foram obtidas em intervalos de 1 segundo, cada uma com uma exposição msec 100 (Figura 5 mostra um ponto de tempo tal). Este procedimento foi repetido para todas as células em cada ponto de tempo. Como quase todas as moléculas são de Vênus Foto-descoloração em cada ponto no tempo, os fluoresmanchas cento nas Figuras 4 e 5 correspondem a moléculas de Vénus amadurecidas (tornou-se fluorescente) dentro de 5 min a passado. Moléculas Venus amadurecer rapidamente in vivo, com uma meia-vida de 2-7 min ~ 1, 2, 7 e clivagem por Ubp1 é muito eficiente de 4, 9. Portanto, o número de moléculas de proteína produzida após a última medida pode ser precisamente inferida a partir do número de moléculas de Vénus contaram com a membrana.
Figura 1. Usando CoTrAC para contar a expressão de moléculas de factores de transcrição individuais (1). Um repórter incluindo a sequência de membrana Tsr-localização, a rápida maturação YFP Vénus e ubiquitina (Ub) é expressa em fusão traducional com um factor de transcrição a partir de um proer regulados pelo factor de transcrição (2). A protease Ubp1 co-tradução do polipeptídeo nascente cliva depois o resíduo C-terminal de Ub. (3) O repórter Tsr-Venus-Ub localiza na membrana onde ela pode ser contado no único -molécula nível. (4) O factor de transcrição podem regular a sua própria expressão. Caricatura método.
Figura 2. Células esquemáticos da câmara de amostra utilizada em experimentos CoTrAC. São colocados entre almofada de gel de agarose e tampa de vidro. Microaqueduct slide e objetivo são mantidos a uma temperatura fixa usando um controlador eletrônico. Preparação de amostras.
Figura 3. Fluxo de trabalho de uma experiência CoTrAC típico. Experifluxo de trabalho mental.
Figura 4. Timelapse dados típicos de um experimento CoTrAC. Imagens de uma única colônia são mostrados em intervalos de 25 min. Nesta experiência, os dados foram adquiridos a cada 5 min a partir de 12 colónias diferentes. (A) as imagens de campo claro. (B) Venus (YFP) imagem de fluorescência (médias de fundo subtraído de conta de variações do fundo do campo de imagem inteira ao longo do tempo). (C ) imagem sobreposta mostra a localização do pólo de moléculas Tsr-Vênus-Ub repórter e heterogeneidade no número de moléculas produzidas em 5 min janelas de tempo em células diferentes (imagem de campo claro é invertido e imagem Venus é banda filtrada). Clique here para ver maior figura.
Figura 5. Dados típicos de apenas um tempo, em um experimento CoTrAC. (A) Venus (YFP) imagens de fluorescência. 100 mseg seis exposições foram adquiridas no início de cada intervalo de tempo de 5 min. Cada uma das 6 posições foi separado por 900 mseg para que haja tempo para moléculas transitoriamente escuras Venus que tinha piscado fora para se tornar fluorescente. (B) Para a análise, imagem 6 é subtraída uma imagem para corrigir as moléculas não branqueado e fundo autofluorescência. Pontos nesta imagem são localizadas a linhagens celulares específicas e quantificadas pela sua intensidade de fluorescência integrada. (C) A fluorescência média integrada da colónia em A é representada com mais de 6 imagens (modolinha tampa). Encaixando esta linha para um decaimento exponencial mais um offset constante (linha tracejada) dá um meio-tempo de decaimento de 1 seg. Nesta experiência, Vénus Fotobranqueador moléculas muito mais rapidamente do que autofluorescência celular, então isso significa que, aproximadamente, metade do número total de moléculas de Vénus são Foto-descoloração em cada quadro. Fotodegradação progresso em um único momento.
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Discussion
O método CoTrAC pode ser generalizado para medir a produção de outras proteínas em que N-ou C-terminais convencionais fusões de proteínas fluorescentes podem comprometer a actividade da proteína. A estratégia CoTrAC tem três vantagens únicas sobre os métodos correntes. Em primeiro lugar, co-traducional fusão assegura que uma molécula do repórter fluorescente é produzido para cada molécula da proteína de interesse, permitindo a contagem precisa da produção de proteína em tempo real. Em segundo lugar, o repórter membrana-alvo Tsr-Vénus permite a detecção de uma única molécula de repórteres fluorescentes, permitindo a detecção de proteínas expressas em níveis muito baixos. Em terceiro lugar e mais importante, a clivagem co-traducional do repórter fluorescente permite que a proteína de interesse para reter a sua sequência quase de tipo selvagem e funcionar normalmente, utilizando ubiquitina como uma sequência de reconhecimento de protease em E. coli, as proteínas alvo apenas diferem das suas sequências de péptidos de tipo selvagem, em que o primeiro terminal-N N </ Em>-formil-metionina é alterada para metionina.
Ao utilizar o método CoTrAC, É importante ter em mente que o método CoTrAC mede o número de moléculas de proteínas produzidas em cada janela de tempo de 5 min, a qual é distinta da medição do número de moléculas de proteína por célula presentes (isto é, o proteína de concentração). A maior parte de uma única célula de fluorescência da expressão do gene da proteína ensaios concentração medida, que é o resultado do equilíbrio de proteína e degradação. Portanto, a taxa de degradação da proteína de interesse deve ser considerada cuidadosamente, se a medição da concentração é usada para inferir a informação sobre a produção de proteína. Além disso, a concentração de proteína é sujeita a flutuações causadas por partição da proteína entre duas células filhas na divisão celular, as quais podem ser significativas para baixo nível de expressão de proteínas e erradamente interpretados como resultando dinâmica da produção de proteína. O método pode ser modi CoTrACcados para medir a concentração de proteína por não fotobranqueamento moléculas repórter recém-produzidos, mas isso deve ser feito com controlo extra. Deve-se verificar que as velocidades de degradação do repórter fluorescente e a proteína de interesse são semelhantes, e que eles são ambos de forma semelhante dividida em duas células filhas sobre a divisão celular, de modo a que a concentração do repórter fluorescente que reflecte da proteína de interesse.
Notamos que, enquanto a CoTrAC não altera a sequência da proteína, a adição do gene repórter altera a sequência de mRNA. Portanto, transcrição e de tradução dinâmica e / ou taxas de degradação de mRNA transcrito pode ser perturbado. Se o método de CoTrAC é usado para observar a produção de proteína no contexto de tipo selvagem, é importante para comparar os níveis de expressão da proteína alvo tanto na sua sequência de tipo selvagem e com o tag de fusão CoTrAC fluorescente (por exemplo, na ref. Uma comparamos CI expressão na nossa construção CoTrACt para que em um lisogénio tipo selvagem). Abaixo discutimos considerações necessárias para a generalização do método CoTrAC.
Primeiro, discutimos a possibilidade de utilizar outras seqüências de Tsr-Vênus-Ub. Os requisitos gerais são os seguintes: (1) o repórter devem estar localizados a alguma posição no interior da célula, de modo que ela não se difunde rapidamente (com Tsr, repórteres estão nos pólos de células 1). Isto é necessário para uma única molécula de detecção de uma molécula de proteína fluorescente como o sinal a partir de uma molécula de proteína rápida difusão fluorescente normalmente não detectável acima do fundo autofluorescente de uma célula, (2), a proteína fluorescente deve ser suficientemente brilhante para ser detectada no uma única molécula de nível e deve amadurecer (tornar-se fluorescente) com rapidez suficiente para a aplicação desejada (Vénus é a proteína mais rápido até à data de vencimento fluorescente 7), (3), a proteína fluorescente deve ser Foto-descoloração após a detecção de modo que as proteínas fluorescentes pode ser recém dedetectado em pontos de tempo posteriores (proteínas fluorescentes que são excessivamente resistente a fotobranqueamento são indesejáveis, como a exposição ao laser excessivo pode causar artefactos de fototoxicidade), (4), a sequência de reconhecimento da protease não pode deixar quaisquer ácidos residuais aminoácidos na proteína de interesse, que perturba a sua funcionalidade (Ubp1 se unir imediatamente após o resíduo Ub carboxi-terminal, não deixando resíduos extra em tudo).
Em segundo lugar, deve-se verificar que o repórter seja expresso correctamente e clivada. A clivagem proteolítica que separa o repórter da proteína de interesse deve ser eficiente, a eficiência de clivagem pode ser medida utilizando Western blot contra o repórter, a proteína de interesse, ou ambas (os anticorpos estão comercialmente disponíveis para muitas proteínas fluorescentes, tais como o anticorpo anti-GFP JL- 8 de Clontech, que liga Vênus em Western blot). Deve-se assegurar que nenhuma proteína de fusão não clivada é detectada em blots contra os lisados de células que expressam a fusãoproteína em níveis superiores aos previstos em experimentos CoTrAC. Além disso, o repórter e da proteína de interesse devem ser produzidos numa relação de 1:1 após a clivagem. Isto pode ser verificado através da medição das intensidades das bandas clivadas no repórter e anti-proteína-de-interesse Western blots normalizados pela intensidade das bandas não clivadas em estirpes carentes protease. Se repórter e da proteína de interesse está presente em uma proporção de 1:1 após a clivagem, a seguir:
Note-se que uma vez que a concentração de proteína Ocidental blots medida, a razão resultante irá desviar-se de 1:1 se o repórter e da proteína de interesse exibem taxas de degradação diferentes, após a clivagem.
Em terceiro lugar, deve-se verificar que a proteína de interesse exibe a sua funcionalidade esperada após clivagem. A presença do repórter grande construção de fusão e / ou de localização para a membrana celular é esperado para inactivar a maioria dos factores de transcrição (a λ repressor CI foi completely inactivo sem Ubp1 expressão nas nossas experiências 1). Transformação do plasmídeo expressando-protease deve activar a proteína de interesse por proteína a libertar a marca de fusão traducional volumoso. Este fenómeno dá origem a outras possíveis aplicações CoTrAC. Clivagem no terminal carboxi por Ub Ubp1 tem sido usado para expor não canónicas amino-terminal de aminoácidos para elucidar a regra de N-final da degradação da proteína bacteriana 9. Se a fusão de um grande repórter associado à membrana inactiva um factor de transcrição (ou outra proteína tal como uma enzima), a sua actividade pode ser rapidamente recuperados por expressão da protease de indução. CoTrAC poderia ser usado para rapidamente "ligar" uma piscina preexistente de factores de transcrição através da remoção / adição de um inibidor / co-activador ou de outra forma de iniciar a expressão da protease ou a actividade. Finalmente, a expressão do repórter fluorescente podem perturbar a fisiologia celular e deve ser assegurado que as propriedades tais como a célulao tempo de ciclo são afectadas; na experiência descrita na ref. 1, utilizou-se a proteína Tsr como uma sequência de localização da membrana, porque Tsr já é uma proteína de membrana altamente expresso e um pequeno aumento na expressão Tsr não se esperava que afectam o comportamento das células.
Quarto, quando uma sequência repórter diferente do especificamente discutido Tsr-Venus-Ub é usado, o protocolo de imagem correspondente deveria também ser modificadas conforme necessário. Por exemplo, proteínas fluorescentes diferentes exigirá protocolos de iluminação diferentes para atingir um bom equilíbrio entre a detecção eficaz de moléculas de proteínas fluorescentes, fototoxicidade da exposição à radiação laser e fotobranqueamento. Idealmente, excitação laser devem estar no pico de absorvância da proteína fluorescente escolhido; fora de pico de excitação requer maiores intensidades de excitação (e portanto mais elevada a fototoxicidade e autofluorescência fundo) para obter a emissão mesma proteína fluorescente e características fotobranqueamento. Além disso, ofrequência de imagem pode ser modificada para ser mais lenta ou mais rápida do que 5 minutos, dependendo da tolerância das células para a fototoxicidade de exposição ao laser. Em nossos experimentos, 12 E. separado colônias coli foram fotografadas a cada 5 minutos e seguiu por 7-8 ciclos celulares antes de observar os defeitos substanciais fototoxicidade 1.
Finalmente, depois de lapso de tempo de produção de proteína de filmes são adquiridos numa experiência CoTrAC (exemplos mostrados nas Figuras 4 e 5), a expressão da proteína fluorescente deve ser quantificado através da detecção de manchas fluorescentes correspondentes a uma ou mais moléculas, a atribuição de moléculas a células individuais e rastrear as linhagens de células. Nós descrevemos uma rotina Matlab personalizado para estudar λ produção CI repressor 1. Em resumo, é preciso primeiro identificar contornos de células individuais e pontos de tempo correspondentes a divisão celular em imagens de campo claro ao seguir linhagens celulares através de quadro de imagem posteriors. Nós descobrimos que um intervalo de tempo de 5 min foi suficientemente curto que uma célula em um quadro geralmente corresponde à célula no quadro anterior, com o qual a maioria dos partilhada pixels de uma imagem segmentada. Nos casos em que eventuais mudanças grandes de colónias entre dois quadros subsequentes foram observadas, a atribuição manual de células individuais para as suas linhagens foi necessária. Em seguida, é preciso identificar os pontos fluorescentes e quantificar sua intensidade. Descobrimos que manchas fluorescentes podem ser identificados por (1) de passagem de banda de filtragem da imagem de fluorescência para remover de baixa frequência de fundo de fluorescência (por exemplo, autofluorescência) e ruído de alta frequência, (2) a imagem de limiar com base em intensidade de fluorescência e (3) identificar objectos maior do que alguns poucos pixels na imagem de limiar definido. Os objectos na imagem limiarizada foram ajustados a uma função gaussiana 2-dimensional mais um fundo constante, e a intensidade integrada da mancha foi tomada como o produto da amplitude em forma e variância.Em nossos experimentos, vários Tsr-Vênus-Ub repórteres muitas vezes co-localizadas nos pólos celulares, criando pontos que eram mais brilhantes do que os de simples Tsr-Vênus moléculas. O número de moléculas no interior de um único local Venus foi quantificada através da divisão da intensidade integrada da mancha com a intensidade de fluorescência de uma molécula única Vénus, a qual foi quantificada por meio de um baixo nível de expressão, em que a estirpe de manchas raramente contêm mais do que uma proteína fluorescente molécula. Esta medição pode ser ainda complementado com medições in vitro de moléculas individuais de proteínas fluorescentes aderiram a uma lâmina de vidro. Nós descobrimos que as propriedades de proteínas fluorescentes são muito semelhantes in vivo e em sistemas in vitro com condições tampão semelhantes.
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Disclosures
Nós não temos divulgações.
Acknowledgments
O pCG001 plasmídeo expressando Ubp1 foi gentilmente cedido por Rohan Baker na Curtin João Escola de Pesquisa Médica. Este trabalho foi financiado pela March of Dimes Bolsa de Investigação 1-FY2011, March of Dimes O'Connor Iniciado Basil Prêmio de Pesquisa Acadêmico # 5-FY20 e NSF concessão de CARREIRA 0.746.796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
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