Summary
우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC), 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 메소드는 전사 인자, λ 억제 CI의 확률 표현 역학을 수행하는 데 사용되었습니다
Abstract
우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC) 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 방법은 가능한 연속 다섯 분 시간 창 동안 한 셀에서 생산되는 단백질 분자의 숫자를 계산 할 수 있습니다. 이 라이브 셀에 하나의 형광 단백질 분자를 감지 할 충분히 문자를 구분합니다 ~ 0.5-1 kW 급 / cm 2,의 레이저 여기 전력 밀도와 형광 현미경이 필요합니다. 막 타겟팅 순서, 빠른 속도로 성장하고, 노란색 형광 단백질과 단백 분해 효소 인식 순서 :이 방법에 사용되는 형광 기자는 세 부분으로 구성되어 있습니다. 기자는 translationally 관심 단백질의 N-말단에 융합되어 있습니다. 셀은 온도 조절 현미경 무대에서 성장하고 있습니다. 5 분마다, 세포 내 형광 분자 (이상 공동 이미징 아르) 형광 이미지를 분석하여 unted 만 새로 번역 된 단백질이 다음 측정에 포함됩니다 있도록 이후 photobleached.
이 방법에 의한 형광 이미지는 각 이미지의 형광 명소를 감지 개별 셀에 지정하고 세포 lineages에 셀을 지정하여 분석 할 수 있습니다. 주어진 셀에 시간 창 내에서 생산되는 단백질의 수는 단일 형광 분자의 평균 강도에 의해 장소의 통합 형광 강도를 나누어 계산됩니다. 우리는 하나의 5 분 시간 창에서 0-45 분자의 범위에서 표현 수준을 측정 할 수이 방법을 사용했습니다. 이 방법은 우리가 λ 억제 CI의 표현에 소음을 측정 할 수있게하고, 시스템 생물학에 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다.
Protocol
1. 스트레인 엔지니어링 워크 플로우
- 시퀀스 인코딩 (A) 막 현지화 순서, (b)는 빠른 속도로 성장하고 형광 단백질과와 관심 단백질 (예를 들어 전사 인자)와 프레임 (C) 단백 분해 효소 인식 서열 N-터미널.를 삽입 우리는 TSR-비너스 기자 대상 멤브레인을 사용하고 표현 박테리오파지 λ 억제 CI 단백질 분자의 수를 계산하기 위해 Ubiquitin 단백 분해 효소 인식 서열 (UB)에 융합. 우리가 지역을 코딩 CI 야생 형을 대체하고 E.에 구조를 통합, 융합 단백질 TSR-비너스-UB-CI를 구축 방법에 대한 자세한 내용은 λ 레드 재조합 3을 사용 대장균의 염색체가, 심판에 자세히 설명되어 있습니다. 1.
- 시퀀싱하여 모든 수정 사항을 확인합니다.
- 플라스미드 인코딩 할 관심의 형광 기자와 단백질을 표현 변종에 위의 사용 된 인식 순서에 맞는 프로테아제를 변환병진 융합 인치 우리는 C-터미널 Ubiquitin 잔류 네 직후 cleaves 단백 분해 효소 Ubp1을 사용 하였다.
2. 문화 셀 및 샘플 준비
- 한 E. 선택 갓 줄무늬 한천 플레이트에서 관심 대장균 식민지 하나 ML M9 최소한의 미디어 5로는 1X 가상 아미노산과 적절한 항생제로 보충. 원하는 온도로 흔드는에 품다는 충분히 달성 할 수 OD 600> 1.0 (600 nm의에서 광학 밀도).에게
- OD 600 = 0.02에 해당 항생제로 1 ML 신선한 M9 매체에 문화를 희석. 적절한 온도에서 흔드는에 품다. 저온 성장에 필요한 경우 초기 세포 밀도 증가 될 수있다.
- OD 600 = 0.2-0.3 (37에서 OD 600에서 초기 세포 배양과 ° C = 0.02, 이건 3-4 시간을 소요됩니다), 아가로 오스 겔 패드를 (3 단계) 준비를 시작합니다.
- 때 OD 셀 이미징을위한 준비
- 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브, benchtop microcentrifuge에서 1 분 10,000 XG에서 원심 분리기로 한 ML incubated 문화를 전송합니다.
- 표면에 뜨는을 취소하고 1 ML 신선한 M9 매체를 추가하고 펠렛을 부드럽게 resuspend.
- 1 분에 10,000 XG에 원심 분리기.
- 1.6 1.7 단계를 반복합니다. 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 부드럽게 한 ML M9 미디어에 resuspend. timelapse 영상에 대한 낮은 세포 밀도를 보장하기 위해 100 배에 - 세포를 직접 현미경 이미징 또는 희석 10 사용할 수 있습니다. 낮은 세포 밀도가 확장 timelapse 영상을 위해 중요합니다. 이미징 챔버 (4 단계)은 실험이 진행되는 동안 봉인되어 있습니다. 세포의 기하 급수적 인 성장으로 인해, 높은 초기 세포 농도는 크게 형광 단백질 성숙을 줄이고 세포의 성장에 영향을 미치는, 젤 패드의 장기 성장 후 챔버 내에 산소를 고갈 할 수 있습니다.
3. 아가로 오스 솔루션을 준비
- 10-20 MG를 달다1.5 ML의 microcentrifuge 관에 낮은 녹는 온도 아가로 오스.
- 3 % 아가로 오스 솔루션을 만들기 위해 항생제없이 적절한 볼륨 M9 최소한의 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 70시 30 분의 아가로 오스 솔루션을 가열 ° C, 솔루션은 완전히 녹아 균일 성을 확보하기 위해 반전 튜브를 용해 할 수 있습니다. 젤 패드는이 점 (4 단계)에서 부어 할 수 있습니다 또는 온도는 ° C 50 감소하고 나중에 사용하기 위해 몇 시간 동안 실시 할 수 있습니다.
4. 상공 회의소에 젤 패드를 준비합니다
- 이미징 전에 약 50 분, 물과 Microaqueduct 슬라이드를 씻어.
- 하나는 커버 유리를 청소 (6에 설명 등 여러 엄격한 청소 방법을 사용하여)와 압축 공기로 불어하여 멸균 물과 건조로 슬라이드를 Microaqueduct 씻어.
- 이렇게이의 응용 프로그램을 수정할 수 있습니다 Microaqueduct 슬라이드 (의 유리면에 유입구 및 유출구를 포함하도록 Microaqueduct 슬라이드에 고무 개스킷을 삽입합니다어떤 미디어)은 샘플을 통해 perfused 있습니다. Microaqueduct 슬라이드의 중심 50 μl 아가로 오스 솔루션 (3 단계)을 적용합니다.
- 청소, 드라이 커버 유리와 아가로 오스 솔루션을 맨.
- 아가로 오스 솔루션은 30 분 동안 실온에서 서 보자.
- 한편, (제 2 단계) 세포 샘플을 준비합니다.
- 조심스럽게 젤 패드의 상단에서 덮개 유리에서 껍질. 젤 패드의 상단에 1.0 μl 한물 세포 배양을 추가합니다. 젤 패드에 의해 흡수 될 수있는 문화 ~ 2 분 기다리십시오. 그건 너무 오래 기다리지 않고 중요하다 젤 패드 overdries하지만, 충분히 전지가 올바르게 젤 패드을 준수되었는지 확인합니다.주세요 이상적인 대기 시간은 온도와 습도에 따라 달라질 수 있습니다.
- 기다리는 동안 다른 precleaned 커버 유리를 건조.
- 커버 유리와 Microaqueduct 슬라이드가 잘 정렬되어 있도록 새로운 커버 유리로 샘플을 커버.
- 제조업체의 지침에 따라 온도 제어 성장 챔버를 조립.그것은 지금 현미경 (단계 5)에서 영상을 위해 사용될 수 있습니다.
5. 이미징 및 Timelapse 영화의 취득
- 제조업체의 지시 사항 (예 : 레이저 실험 전에 ~ 0.5 시간에 예열해야 할 수도 있습니다) 다음과 같은 레이저와 현미경을 사용합니다.
- 현미경의 무대 삽입에 조립 챔버를 잠급니다. 성장 챔버의 온도와 37 ° C 나 기타 원하는 성장 온도에서 목표 히터를 설정합니다.
- 실온 위 이미징 경우, 초점이나 젤 패드는 일반적으로 초기 온도 변화 후 ~ 15 분 동안 크게 표류합니다. 실제로, 관심 지역을 찾아 실험을 위해 필요에 따라 이미징 스크립트를 수정할 시간을 사용합니다.
- 현미경에서 세포를 찾아 미리 정의와 정렬 이미징 지역 내에서 중심 한 후 각 셀의 위치를 저장합니다. 하나 이상의 셀은 각 이미지 획득 시간 창에서 이미징 할 수 있습니다. m 이상 timelapse 영상에 대한모든 세대가 다른 식민지 성장하는 동안 이미징 지역을 입력하지 않도록 이미징 세포가 처음 백 회에 몇 μm하여 다른 세포로부터 분리되어 있는지 확인하십시오.
- 그래서 레이저 여기 강도를 조정은 6 노출 내의 거의 모든 형광 분자의 photobleach (그림 5).
- 자동 이미지 스크립트 / 잡지, 그림 3의 실험 워크 플로우에 설명 된 알고리즘을 사용하여 timelapse 데이터를 가져올을 사용합니다.
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Representative Results
λ 억제 CI의 생산을 추적 CoTrAC 실험에서 전형적인 결과는 그림 4와 5에 표시됩니다. 이 실험에서, 12 콜로니는 5 분 간격으로 이미징했다. 때마다 시점에서, 식민지 먼저 autofocused되었고 이미징 영역 내에 중앙. 다음으로 중심 / 중심의 위치가 저장되었고 brightfield 이미지가 인수되었습니다. 무대는 다음 세포를 (위상 대비 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 광학없이 bisecting 비행기에 brightfield 초점 평면에서 이동하려면 Z-축을 따라 ~ 0.5 μm에 의해 translocated되었습니다 반투명 개체는 약간의 이미징 할 수 있습니다 밖에서 초점 비행기 8). 마지막으로, 여섯, 이미지는 100 밀리 초 노출 (그림 5는 하나의 시점을 보여줍니다)을 1 초 간격, 각에 인수되었다. 이것은 각각의 시점에서 모든 셀에 대해 반복되었다. 거의 모든 비너스 분자는 각 timepoint, fluores에서 photobleached되기 때문에도 4 및 5 %의 명소는 지난 5 분 이내에 (형광되었습니다) 성숙 비너스 분자에 해당합니다. 비너스 분자는 9 4 매우 효율적이다 Ubp1로 ~ 2-7 분 1, 2, 7, 절단의 반감기와 생체에 빠르게 성숙. 따라서, 마지막 측정 이후 생산 단백질 분자의 수는 정확하게 막에서 계산 비너스 분자의 수에서 유추 할 수 있습니다.
1 그림. 하나의 전사 인자 분자의 표현을 계산하기 위해 CoTrAC을 사용합니다. (1) 막 현지화 순서 TSR, 빠른 속도로 성장하고 YFP 비너스, 그리고 Ubiquitin (UB) 등의 기자가 promot에서 전사 인자와 병진 융합으로 표현된다응급실은 전사 인자에 의해 조절. (2) 단백 분해 효소는 Ubp1 공동 translationally C-터미널 UB 잔여 물 후 초기 폴리펩티드를 cleaves.가 하나에 집계 될 수있는 (3) TSR-비너스 - UB 기자가 막에 localizes - 분자 수준입니다. (4) 전사 인자는 자신의 표현을 조절 할 수 있습니다. 방법 만화.
그림 2. CoTrAC 실험에 사용 된 샘플 챔버의 개략도. 세포는 아가로 오스 겔 패드 및 커버 유리 사이에 위치합니다. Microaqueduct 슬라이드와 목적은 전자 컨트롤러를 사용하여 고정 온도에서 개최됩니다. 샘플 준비.
그림 3. 전형적인 CoTrAC의 실험 워크 플로우. Experi정신 워크 플로우.
4 그림. CoTrAC 실험에서 일반적인 timelapse 데이터입니다. 이미지는 하나의 식민지에서 25 분 간격으로 표시됩니다. 이 실험에서, 데이터는 12 개 식민지에서 매 5 분을 취득했다. (A) Brightfield 이미지. (B) 비너스 (YFP) 형광 이미지 (평균 배경이 시간이 지남에 따라 전체 이미지 필드의 배경에 변경 계정에 차감). (C는 ) 오버레이 이미지가 다른 셀의 5 분 시간 창 (brightfield 이미지가 반전과 금성 이미지가 대역 통과 필터링입니다)에서 생산되는 분자의 수가 TSR-비너스 - UB의 기자 분자와 이질성의 극 현지화를 보여줍니다. 를 클릭 H는더 큰 그림을 볼 수 있습니다 한단.
그림 5. CoTrAC 실험에서 하나의 시점에서 일반적인 데이터입니다. (A) 비너스 (YFP) 형광 이미지. 여섯 100 밀리 초 노출은 각 5 분 시간 간격의 시작 부분에 인수되었다. 6 노출 각 형광가되기 위해 오프 깜빡 한 transiently 어두운 비너스 분자 시간을 허용하도록 900 밀리 초로 구분되었다. (B) 분석을 위해, 이미지 6 표백하지 않은 분자와 autofluorescence 배경에 해결하기 위해 이미지 1에서 차감됩니다. 이 이미지의 명소가 특정 세포 lineages에 지역화 및 통합 형광 강도에 의해 평가합니다. (C)에서 식민지의 평균 통합 형광은은 6 이상 이미지를 (그래서 도시된다뚜껑 라인). 지수 붕괴에이 행을 맞는 플러스 상수는 (점선) 오프셋은 1 초에 부패 반 시간을 제공합니다. 이 실험에서, 금성 분자의 photobleach이 훨씬 더 빨리 세포 autofluorescence보다,이 금성 분자의 총 수의 약 절반 각 프레임에 photobleached을 의미합니다. 하나의 시점에서 진행 상황을 Photobleaching.
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Discussion
CoTrAC 방법은 기존 N 또는 C-터미널 형광 단백질 fusions 단백질의 활동을 방해하는 다른 단백질의 생산을 측정하는 일반화 할 수 있습니다. CoTrAC 전략은 현재의 방법으로 세 독특한 장점이 있습니다. 첫째, 공동 병진 융합 형광 기자 분자가 실시간으로 단백질 생산의 정확한 계산을 허용, 관심있는 단백질의 각 분자에 대한 생산 될 수 있도록합니다. 둘째, 막 타겟 기자는 TSR-금성은 매우 낮은 수준에서 표현 단백질의 검출을 사용, 형광 기자의 단일 분자 검출 할 수 있습니다. 가장 중요한 세 번째와 네, 형광 기자의 공동 병진 절단 관심의 단백질은 E.의 단백 분해 효소 인식 순서로 Ubiquitin 일반적으로 - 사용하여 가까운 야생 형 시퀀스와 기능을 유지 할 수 있습니다 대장균은 대상 단백질은 그 첫 번째 N-터미널 N에서 자신의 야생 형 펩타이드 시퀀스 다를 </ EM> - 포르 밀 메티오닌 - 메티오닌은으로 변경됩니다.
CoTrAC 방법을 사용하는 경우, 그것은 CoTrAC 방법은 (즉, 세포 당 현재 단백질 분자의 수의 측정 구별입니다, 각 5 분 시간 창에서 생산 단백질 분자의 수를 측정 점에 유의하는 것이 중요합니다 단백질 농도). 단백질 생산 및 저하의 균형 결과 대부분의 단일 셀 형광 유전자 발현의 assays 측정 단백질 농도. 농도 측정은 단백질 생산 정보를 추론하는 데 사용됩니다 따라서 관심의 단백질의 저하 속도는 신중하게 고려되어야합니다. 또한, 단백질 농도는 낮은 표현 수준의 단백질에 대한 중요한이어야하며 실수로 단백질 생산 역학에서 발생하는 것으로 해석 할 수 있습니다 세포 분열에서 두 딸 세포 사이의 단백질 파티션으로 인한 변동에 따라 달라질 수 있습니다. CoTrAC 방법은 modi 수 있습니다새로 제작 기자 분자를 photobleaching하지 않음으로써 단백질 농도를 측정 할 수 fied하지만,이 방법은 추가 조사를 수행해야합니다. 하나는 형광 기자와 관심의 단백질의 저하 속도가 비슷합니다, 그리고 그들이 유사 형광 기자의 농도 관심의 단백질 것을 반영 있도록 세포 분열시 두 딸 세포로 분할 아르 모두 있는지 확인해야합니다.
우리는 CoTrAC는 단백질 순서를 변경하지 않지만, 리포터 유전자의 추가는 mRNA 순서를 변경된다는 점에 유의하십시오. 따라서, 전사 및 번역 역학 및 / 또는 mRNA 대본 저하 속도는 어리둥절 할 수 있습니다. CoTrAC 방법은 야생 형 맥락에서 단백질 생산을 관찰하는 데 사용되는 경우는 야생 형 시퀀스와 CoTrAC 형광 퓨전 태그를 모두 대상 단백질의 표현 수준 (예를 들면 심판에 비교하는 것이 중요합니다. 한 우리는 비교 우리 CoTrAC construc 표현 CI야생 형 lysogen에 해당에 t). 다음은 CoTrAC 방법을 일반화에 필요한 고려 사항에 대해 설명합니다.
첫째, 우리는 TSR-비너스 - UB 이외의 시퀀스를 사용하는 가능성을 논의합니다. 일반적인 요구 사항은 다음과 같습니다가 빠르게 확산하지 않도록 (1) 기자는 (TSR과 기자는 셀 극 1시입니다) 세포 내에서 어떤 위치에 지역화해야합니다. 이 빠르게 diffusing 형광 단백질 분자의 신호로 형광 단백질 분자의 단일 분자 검출을위한 보통 셀의 autofluorescent 배경 위에 감지되지 않습니다 필요합니다, (2), 형광 단백질이에서 발견 할 충분히 밝은해야합니다 단일 분자 수준 (금성은 날짜 7 가장 빠르게 성장 형광 단백질)을 원하는 응용 프로그램에 신속하게 (형광등가) 성숙해야하며, 그 새로 형광 단백질이 될 수 있도록 (3) 형광 단백질이 검출 후 photobleached해야합니다 드이후의 시간 포인트 (photobleaching에 너무 강합니다 형광 단백질 과도한 레이저에 노출과 같은 바람직하지 않은 아르 광독성 유물이 발생할 수 있습니다)에서 tected (4), 단백 분해 효소 인식 순서는 기능을 교란 할 관심의 단백질에 잔여 아미노산을 떠날 수 없어 (즉시 카르복시 - 터미널 UB 잔여 물 후 Ubp1 cleaves, 전혀 추가 잔류 물을 떠나지 않습니다.)
둘째, 하나는 기자가 제대로 표현 흘리고되어 있는지 확인해야합니다. 관심 단백질에서 기자 분리 Proteolytic 절단은 효율적이어야합니다, 절단 효율이 기자에 대한 관심이 단백질 또는 둘 다 (항체 이러한 반 GFP 항체 등 많은 형광 단백질을 위해 상업적으로 사용할 수 있습니다 JL하는 것은 -를 서양 blots를 사용하여 측정 할 수 있습니다 서양 얼룩에 금성을 바인딩 Clontech에서 8). 하나는 uncleaved 융합 단백질이 융합을 표현 세포의 lysates에 대한 blots에 감지되지 않도록해야합니다CoTrAC 실험에 예상보다 높은 수준의 단백질. 또한, 관심의 기자와 단백질이 절단 후 1:1 비율로 생산해야합니다. 이것은 안티 기자와 단백 분해 효소가 부족한 종자의 uncleaved 밴드의 농도에 의해 표준화 방지 단백질의이자 서양 blots에 흘리고 밴드의 농도를 측정하여 확인하실 수 있습니다. 관심 기자와 단백질은 다음 절단 후 1:1 비율로 존재하는 경우 :
기자와 관심의 단백질이 절단 한 후 다른 열화 속도를 나타내는 경우 서양 blots를 측정 단백질 농도 때문에 발생 비율이 1시 1분 이탈됩니다.
셋째, 하나는 관심의 단백질이 절단 한 후에 예상 기능을 전시 있는지 확인해야합니다. 대형 기자의 존재가 가장 전사 요소를 비활성화 할 예정이다 융합 및 / 또는 세포막에 현지화를 구축 (λ 억제 CI는 공동했습니다우리의 실험 1) Ubp1 표현이없는 mpletely 운영 중지되었습니다. 단백 분해 효소 - 표현 플라스미드의 변화는 부피가 병진 퓨전 태그에서 해방 단백질에 의해 관심의 단백질을 활성화해야합니다. 이 현상은 다른 가능한 CoTrAC 응용 프로그램에 상승을 제공합니다. Ubp1하여 UB 카르복시 말단의 절단은 단백질 저하 9 박테리아 N 엔드 규칙을 명료하게하다하는 비표준 아미노 터미널 아미노산을 노출하는 데 사용되었습니다. 대형 막 관련 기자로 융합 전사 인자 (또는 같은 효소 등의 단백질) inactivates 경우, 그 활동은 신속하게 유도 단백 분해 효소 발현에 의해 복구 될 수 있습니다. CoTrAC는 매우 빠르게 제거 / 억제제 / 공동 활성화를 추가하거나 단백 분해 효소 표현이나 활동을 시작하여 전사 인자의 전부터 풀 "켜"을 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 형광 기자의 표현은 셀 생리를 교란 할 수 있으며이 보장되어야한다 이러한 세포와 같은 특성사이클 시간은 영향을받지 않습니다, 심판에 설명 된 실험 인치 TSR이 이미 높은 표현 막 단백질과 세포의 행동에 영향을 미칠 것으로 예상되지 TSR 표현의 작은 증가하기 때문에 1, 우리는 막 현지화 순서로 TSR 단백질을 사용했습니다.
필요에 따라 넷째는, 특별히 논의 TSR-비너스 - UB 이외의 기자 순서가 사용될 때, 해당 이미지 프로토콜도 수정해야합니다. 예를 들어, 서로 다른 형광 단백질은 다른 조명 프로토콜을 효율적으로 레이저 노출 형광 단백질 분자, 광독성을 감지하고 photobleaching 사이 좋은 균형을 달성하기 위해 필요합니다. 이상적으로, 레이저 여기가 선택한 형광 단백질의 흡수 피크에 있어야합니다, 오프 피크 여기 같은 형광 단백질 방출과 photobleaching 특성을 달성하기위한 높은 여기 농도 (및 따라서 높은 광독성 및 autofluorescence 배경)이 필요합니다. 또한,영상 주파수는 레이저 노출 광독성에 세포의 내성에 따라 5 분보다 느리게 또는 빠르게 할 수정할 수 있습니다. 우리의 실험에서, 12 별도의 E. 대장균의 콜로니마다 5 분 이미징과 상당한 광독성 결함 1을을 관찰하기 전에 7-8 세포주기에 따라되었습니다.
마지막으로, 단백질 생산의 시간 경과 영화를 한 후 CoTrAC 실험 (예제 그림 4와 5에 도시)에 인수되어 형광 단백질 표현식이 하나 이상의 분자에 해당하는 형광 부분을 감지 개별 셀에 분자를 지정하고하여 계량해야 세포 lineages을 추적. 우리는 λ 억제 CI 제작 한 공부를 사용자 정의 MATLAB 루틴을 설명합니다. 다음 이미지 프레임을 통해 세포 lineages을 추적하면서 간단히 한 먼저 brightfield 이미지에서 세포 분열에 해당하는 개별 셀과 시간 포인트의 개요를 파악해야합니다s입니다. 우리는 5 분 시간 간격은 한 프레임에서 셀은 일반적으로는 분할 이미지에서 가장 픽셀을 공유되는 이전 프레임의 셀에 대응하는 충분히 짧은 것으로 나타났습니다. 이 이후의 프레임 사이의 식민지 가끔 큰 변화가 관찰되었다의 경우, 자신의 lineages에 개별 셀의 수동 할당이 필요했습니다. 다음으로, 하나는 형광 부분을 파악하고 자신의 강도를 정량화해야합니다. 우리는 형광 반점이 (1) 대역 통과 낮은 주파수 형광 배경을 제거하는 형광 이미지를 필터링 (예 : autofluorescence)와 고주파 노이즈, (2) 형광 강도에 따라 이미지를 임계 값 (3) 물체를 식별하여 식별 할 수있는 발견 thresholded 이미지에 몇 픽셀보다 큰. thresholded 이미지의 개체는 2 차원 가우스 함수 플러스 일정한 배경에 맞게되었고, 그 자리의 통합 강도가 적합한 진폭 및 분산의 제품으로 촬영되었습니다.우리의 실험에서 여러 TSR-비너스 - UB 기자는 종종 하나의 TSR-비너스 분자에서보다 똘똘하지 못한 부분을 생성, 세포 극에서 공동 번역. 한 지점에서 비너스 분자의 수는 장소는 거의 하나 이상의 형광 단백질을 포함하지하는 낮은 표현 수준의 변형을 사용하여 정량화 된 하나의 비너스 분자의 형광 강도에 의해 그 자리의 통합 강도를 나누어 정량화 된 분자. 이 측정은 더욱 유리 슬라이드에 부착 한 형광 단백질 분자의 체외 측정에로 보충 할 수 있습니다. 우리는 형광 단백질 속성이 생체와 유사한 버퍼 조건에 체외 시스템에서의 대부분 유사한 것을 발견했습니다.
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Disclosures
우리는 공개가 없습니다.
Acknowledgments
Ubp1을 표현 플라스미드 pCG001께서는 의학 연구의 존 커틴 대학에서 로한은 베이커에 의해 제공되었다. 이 작품은 천 연구 기금 1 FY2011 년 3 월, 천 바질 오코너 초보자 학술 연구 상 # 5 - FY20 및 NSF 경력 상 0,746,796 3 월에 자금을 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
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