Summary
我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）、タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。このメソッドは、転写因子、λリプレッサーCIの確率の発現動態を追跡するために使用されています
Abstract
我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。この方法によれば、シーケンシャル、5分の時間枠で、1セル内に産生されるタンパク質分子の数を数えるようになります。それは、生きた細胞内の単一の蛍光タンパク質分子を検出するために十分に敏感である〜0.5から1キロワット/ cm 2のレーザー励起パワー密度を持つ蛍光顕微鏡を必要とします。膜標的化配列、高速熟成、黄色蛍光蛋白質とプロテアーゼ認識配列：このメソッドで使用される蛍光レポーターが3つの部分から成ります。記者が翻訳目的のタンパク質のN末端に融合されています。細胞は、温度制御された顕微鏡ステージ上に成長させられる。 5分おきに、細胞内の蛍光分子（およびそれ以降の共同撮像される蛍光画像を分析することによってunted）、続いて、新しく翻訳されたタンパク質は、次の測定にカウントされるようにphotobleached。
この方法から得られた蛍光画像は、各画像の蛍光スポットを検出し、個々のセルに割り当てること、その後の細胞系譜への細胞を割り当てることによって分析することができます。与えられたセルにタイムウィンドウ内で産生される蛋白質の数は、単一蛍光分子の平均強度によってスポットの統合された蛍光強度を割ることによって計算されます。我々は、単一の5分の時間ウィンドウで0から45分子の範囲内で発現レベルを測定するために、このメソッドを使用していました。この方法は、私たちがλリプレッサーCIの式で騒音を測定するために有効になっており、システム生物学の他の多くの潜在的なアプリケーションを持っています。
Protocol
1。ひずみエンジニアリングワークフロー
- シーケンスのエンコード（）の膜局在化配列、（b）の高速成熟蛍光タンパク質とすると、目的のタンパク質（ 例えば転写因子）とフレーム内の（c）にプロテアーゼ認識配列のN末端 。を挿入我々は、TSR-金星レポーター2標的膜を使用し、発現バクテリオファージλリプレッサーCIのタンパク質分子の数をカウントするユビキチンプロテアーゼ認識配列（UB）に融合した。我々は、野生型CIはコーディング領域とEにコンストラクトを組み込ん交換、融合タンパク質TSR-金星-UB-CIの構築方法についての詳細λ赤組3を用いて 、 大腸菌の染色体は、refに詳細に記載されている。 1。
- 配列決定することによって、すべての変更を確認します。
- をコードするプラスミドを、目的の蛍光レポーターとタンパク質を発現している株に上記で使用した認識配列に特異的プロテアーゼを変換翻訳融合インチ我々は、C-末端ユビキチン残4の直後に切断するプロテアーゼUbp1を使用していました。
2。培養細胞とサンプルを準備
- 1 Eを選ぶ1X MEMアミノ酸と適切な抗生物質を補充した1ミリリットルM9最少培地5にたて縞寒天プレートからの関心の大腸菌コロニー。十分な長さのOD 600が > 1.0（600nmでの光学密度）に到達するために、所望の温度でシェーカーでインキュベートする。
- OD 600 = 0.02に適切な抗生物質で1ミリリットル新鮮M9培地に培養を希釈します。適切な温度でシェーカーでインキュベートする。低温成長のために必要であれば初期細胞密度を増加させることができる。
- OD 600 = 0.2から0.3（37℃、OD 600での初期培養細胞を使用したC = 0.02、これは3〜4時間かかります）場合には、アガロースゲルパッド（ステップ3）を製造開始。
- 時OD細胞はイメージングのための準備が整いました
- 卓上遠心機で1分間10,000 xgで1.5 mlマイクロチューブ、遠心分離機に1ミリリットルインキュベート文化を転送します。
- 上清を捨て、1 mlの新鮮なM9培地を加え、穏やかにペレットを再懸濁します。
- 1分間、10,000×gで遠心分離します。
- 1.6と1.7を繰り返します。上清を捨てる。
- 穏やかに1ミリリットルM9培地に再懸濁します。タイムラプスイメージングのための低細胞密度を確保するために100倍に - 細胞を直接顕微鏡イメージングまたは希釈10に使用することができます。低細胞密度、拡張タイムラプスイメージングのために重要であることに注意してください。イメージング室（ステップ4）は実験中に封入されている。細胞の指数関数的成長のために、高い初期細胞濃度は有意に蛍光タンパク質の成熟を削減し、細胞増殖に影響を与え、ゲルパッド、長引く成長後にチャンバー内の酸素を使い果たすことができます。
3。アガロース溶液を準備
- 10から20ミリグラムの重量を量る1.5 mlのマイクロチューブに低融点温度アガロース。
- 3％アガロース溶液を作製するために抗生物質を含まない適切な音量M9最少培地を追加します。
- 70℃で30分間アガロース溶液を加熱℃、溶液が完全に溶融し、均一であることを保証するためにチューブを反転を溶解した。ゲルパッドは、この時点で注ぐことができる（ステップ4）、または温度が50℃まで低下し、後で使用するために数時間保持することができる。
4。商工会議所にジェルパッドを作製
- イメージングの前に約50分は、水とMicroaqueductスライドをすすぎます。
- 1は、カバーガラスを掃除（6で説明したような厳しい洗浄方法を使用して）圧縮空気を吹き付けることにより滅菌水と乾いたスライドをMicroaqueductすすいでください。
- それが、これは内のアプリケーション用に変更することができMicroaqueductスライド（のガラス側の入口と出口を覆うようにMicroaqueductスライド上にゴム製のガスケットを配置どのメディア）は、サンプルを通して灌流される。 Microaqueductスライドの中央に50μlをアガロース溶液（ステップ3）を適用します。
- 洗浄、乾燥したカバーガラスとのアガロース溶液を補充して下さい。
- アガロース溶液を30分間室温で放置する。
- 一方、（ステップ2）細胞試料を準備します。
- 慎重にゲルパッドの上部からカバーガラスを剥がす。ゲルパッドの上部に1.0μlの洗浄された細胞培養を追加します。培養のための〜2分をゲルパッドに吸収されるのを待ちます。それはとても長いゲルパッドoverdriesその待たないようにすることが重要であるが、十分な長さのセルが正しくゲルパッドに付着していること。理想の待機時間は、温度や湿度によって異なります。
- 待っている間に、別の予備洗浄したカバーガラスを乾燥させてください。
- カバーガラスとMicroaqueductスライドがよく合っていることを保証する新たなカバーガラスでサンプルをカバーしています。
- メーカーの指示に従って、温度制御された成長チャンバーを組み立てます。現在では、顕微鏡でイメージング（ステップ5）に使用することができます。
5。イメージングとタイムラプスムービーの取得
- メーカーの指示（ 例えばレーザーは実験前〜0.5時間ウォームアップする必要があるかもしれません）以下のレーザーと顕微鏡をオンにします。
- 顕微鏡ステージ上のインサートに組み付け室をロックします。成長室の温度は、37℃又は他の所望の成長温度での客観的なヒーターを設定します。
- イメージング室温以上の場合、フォーカスまたはジェルパッドは、通常約15分初期温度シフト後のために大幅にドリフトします。実際には、関心のある領域を見つけ、実験のために必要に応じてイメージングスクリプトを変更するには、この時間を使用します。
- 顕微鏡で細胞を見つけると、事前に定義され、整列撮像領域内のそれを中心にした後に各セルの位置を格納します。複数のセルは、各画像取得時間ウィンドウに結像させることができる。 m以上のタイムラプスイメージング用任意の世代は、画像化された細胞は最初に他のコロニーが成長中に撮像領域を入力しないように、少なくとも百数μmで、他の細胞から分離されていることを確認してください。
- ので、6エクスポージャー（ 図5）内のほぼ全ての蛍光分子が光退色、レーザー励起強度を調整します。
- 自動イメージングスクリプト/ジャーナルを使用して、 図3の実験的なワークフローで記述されたアルゴリズムを使ってタイムラプスデータを取得する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
λリプレッサーCIの生産を追跡CoTrAC実験から得られた典型的な結果を図4および図5に示されている。この実験では、12個のコロニーは、5分間隔で撮像した。各時点で、コロニーは最初autofocusedたと撮像領域内の中央。次に、フォーカス/中心位置が格納されていたと明視野画像を取得した。ステージはその後細胞（位相差または微分干渉コントラスト（DIC）光学系なし2等分する平面に明焦点面から移動し、z軸に沿って約0.5μmで移行した、半透明のオブジェクトが僅かに結像させることができるアウトフォーカス面8）。最後に、6つの画像は、100ミリ秒露光（ 図5はそのような時点を示している）を用いて1秒間隔、各々で取得した。これは、各時点でのすべてのセルに対して繰り返された。ほぼすべてのヴィーナス分子が各時点でphotobleachedされているため、蛍光図4と図5のセントスポットが過去5分以内（蛍光なった）成熟金星分子に対応しています。金星分子は、9 4非常に効率的であるUbp1による〜2月7日分1、2、7および切断の半減期で、生体内で速やかに成熟する。したがって、最後の測定から産生されたタンパク質分子の数を正確に数え金星膜分子の数から推測することができます。
図1。単一の転写因子分子の発現をカウントするCoTrACを使用して、（1）膜局在化配列のTSR、高速熟成YFP金星、ユビキチン（Ub）を含むレポーターが推進しからの転写因子との翻訳融合で表現されERは、転写因子によって調節。（2）プロテアーゼがUbp1共同翻訳のC末端Ubの残基後の新生ポリペプチドを特異的に切断する。それはシングルでカウントすることができますここで、（3）TSR-金星-Ubをレポーターが膜に局在する分子レベル（4）転写因子は、独自の表現を規制することができます。方法漫画。
図2。 CoTrAC実験で用いた試料室の概略。細胞をアガロースゲルパッドとカバーガラスとの間に配置される。電子制御装置を使用して一定温度に保持されているスライドと目標をMicroaqueduct。サンプル調製。
図3。典型的なCoTrAC実験のワークフロー。実験精神的なワークフロー。
図4。 CoTrAC実験からの典型的なタイムラプスデータ。単一コロニーからの画像は25分間隔で表示されます。この実験では、データは12の異なるコロニーから5分毎に取得した。明視野画像（A）、（B）金星（YFP）蛍光画像（時間が経っても結像フィールド全体の背景の変化を考慮するために減算平均バックグラウンド）（C ）オーバーレイイメージは、別の細胞中で5分の時間ウィンドウ（明視野像が反転し、金星のイメージはバンドパスフィルタ処理されます）で生成分子数のTSR-金星-Ubをレポーター分子と異質性の極局在を示していますクリックしてhは拡大図を表示するには、ERE。
図5。 CoTrAC実験では、単一の時点から、典型的なデータ（A）金星（YFP）蛍光画像。六百ミリ秒のエクスポージャーは、それぞれ5分間の時間間隔の開始時に取得した。 6エクスポージャーの各々は、蛍光灯になってオフにまばたきした一過性に暗い金星分子のための時間を確保するために900ミリ秒で分離した。（B）の分析については、画像6は無漂白の分子と自己蛍光バックグラウンドを補正するために、画像1から減算されます。このイメージのスポットは特定の細胞系譜に局在し、その統合された蛍光強度により定量する。ので、6枚（上にプロットされている中で植民地の（C）の平均的な統合された蛍光リッドライン）。指数関数的な減衰にこのラインをフィットプラス定数は（破線）のオフセットは1秒の減衰ハーフタイムを提供します。この実験では、金星分子が光退色がはるかに速く、携帯自家蛍光よりも、これは金星の分子数の合計の約半分は、各フレームでphotobleachedされることを意味します。単一時点での進捗状況を退色。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CoTrAC方法は、従来のN末端またはC末端蛍光タンパク質融合体がタンパク質活性を妨害する可能性のある他のタンパク質の産生を測定することが一般化することができる。 CoTrAC戦略は、現在の方法に比べて3特有の利点があります。まず、共同翻訳融合は蛍光レポーターの1分子がリアルタイムでタンパク質生産の正確なカウントを可能にする、目的のタンパク質の各分子のために生成されることを保証します。第二に、膜を標的レポーターTSR-金星は非常に低いレベルで発現されたタンパク質の検出を可能にし、蛍光レポーターの単一分子を検出することができます。第三の、そして最も重要なのは、蛍光レポーターの共同翻訳切断が目的のタンパク質は、その近い野生型配列と機能を保持することができ、常用いて大腸菌のプロテアーゼ認識配列としてユビキチン大腸菌は 、標的タンパク質は、その最初のN-末端Nでその野生型のペプチド配列と異なる</ em>は - ホルミル-メチオニンはメチオニンに変更されます。
CoTrAC方法を使用する場合、それはCoTrAC方法（ すなわち 、細胞当たりに存在するタンパク質分子数の測定とは区別され、それぞれ5分間の時間ウィンドウで生成されたタンパク質分子の数を測定することを心に留めておくことは重要であるタンパク質濃度）。タンパク質産生と分解のバランスのとれた結果であるほとんどの単一細胞蛍光遺伝子発現アッセイ対策タンパク質濃度、。濃度測定は、タンパク質の生産情報を推測するために使用されている場合、そのため、目的のタンパク質の分解速度は、慎重に考慮しなければならない。さらに、タンパク質濃度は、低発現レベルのタンパク質に対して有意であると誤ってタンパク質生産動態に起因すると解釈ができる細胞分裂、少なくとも2つの娘細胞の間のタンパク質のパーティショニングによって引き起こさ常に変動します。 CoTrACメソッドは、修飾することができます新たに生産レポーター分子を退色しないことにより、タンパク質濃度を測定するためにfiedが、これは余分な精査して行う必要があります。一つは蛍光レポーター、目的のタンパク質の分解率は類似しており、彼らは同様に蛍光レポーターの濃度は、目的のタンパク質のことを反映するように、細胞分裂時に2つの娘細胞に分割されている両方いることを確認する必要があります。
我々はCoTrACはタンパク質配列を変更することはありませんしながら、レポーター遺伝子の付加がmRNA配列を変更することに注意してください。したがって、転写および翻訳ダイナミクスおよび/またはmRNA転写物の分解速度は、混乱させられるかもしれません。 CoTrAC方法は、野生型のコンテキスト内でのタンパク質生産を観察するために使用されている場合は、その野生型配列とCoTrAC蛍光融合タグ（ref内などで両方の標的タンパク質の発現レベルを比較することが重要である。1私達は比べ私たちのCoTrAC建設のCI表現野生型溶原菌のそれとトン）。以下に、我々はCoTrAC方法を一般化するために必要な考慮事項について説明します。
まず、TSR-金星-Ubを以外の配列を使用しての可能性を議論する。一般的な要件は以下のとおりです：（1）それはすぐに拡散しないように、レポーターが細胞内のどこかの位置にローカライズする必要があります（TSRと、記者は細胞極1にあります）。素早く拡散する蛍光タンパク質分子からの信号は、通常、細胞の自家蛍光バックグラウンドを超えて検出されることはありませんので、これは蛍光タンパク質分子の単一分子検出のために必要があること、（2）、蛍光タンパク質で検出するのに十分明るいなければなりません単一分子レベルと目的のアプリケーション（金星は7までで最速成熟蛍光タンパク質である）のために十分な速さ（蛍光なる）成熟しなければなりません。新たに蛍光タンパク質ができるように、（3）、蛍光タンパク質を検出後photobleachedしなければなりませんデ（光退色に過度に耐性のある蛍光タンパク質が過剰レーザー露光として望ましくない毒性のアーチファクトが発生する可能性があります）その後の時点で保護対象、（4）、プロテアーゼ認識配列は、その機能を乱され、目的のタンパク質上の任意の残留アミノ酸を残すことはできません（すぐカルボキシ末端のUb残基後Ubp1切断する、まったく余分な残留物を残しません）。
第二に、1は、レポーターが適切に発現され、切断されることを確認する必要があります。目的のタンパク質からレポーターが効率的でなければならない分離タンパク質分解的切断、切断効率は、レポーターに対してウエスタンブロット法を用いて測定することができる、興味または両方のタンパク質（抗体は、抗GFP抗体など多くの蛍光タンパク質のため市販されているJL-ウェスタンブロットで金星をバインドクロンテックから8）。一つは全く未開の融合タンパク質は、融合体を発現する細胞の溶解物に対するブロットで検出されないことを確認する必要がありますCoTrAC実験で予想よりも高いレベルでのタンパク質。また、金利のレポーター、タンパク質を切断後1:1の割合で製造されなければならない。これは、抗レポーターおよびプロテアーゼを欠損株における未開バンドの強度で正規化し、抗プロテインの関心ウエスタンブロットにおいて切断されたバンドの強度を測定することにより確認することができます。興味のあるレポーターとタンパク質はその後、切断された後1:1の比で存在する場合：
レポーターと目的のタンパク質が切断した後、異なる分解速度を示す場合ウエスタンブロット対策タンパク質濃度ので、結果として比が1:1から逸脱することに注意してください。
第三に、1は、目的のタンパク質を切断した後に、その期待される機能を発揮することを確認する必要があります。大記者の存在はほとんどの転写因子を不活化することが期待される核融合および/または細胞膜への局在を構築（λリプレッサーCIは共同だった我々の実験1）でUbp1式を持たないmpletely非アクティブ。プロテアーゼ発現プラスミドの形質転換は、かさばる翻訳融合タグから解放タンパク質によって目的のタンパク質を活性化する必要があります。この現象は他の可能CoTrACアプリケーションを生じさせる。 Ubp1によってUbのカルボキシ末端の切断はタンパク質分解細菌の9のN末端 のルールを明らかにするために、非正規のアミノ末端アミノ酸を公開するために使用されています。大、膜関連の記者への融合は、転写因子（または酵素などの他のタンパク質）の不活性化する場合には、その活性は速やかに誘導プロテアーゼ発現によって回復することができます。 CoTrACは非常に急速に除去/抑制/共賦活剤を加えるか、またはそうでなければ、プロテアーゼ発現または活性を開始することにより、転写因子の既存のプールを "オン"にするために使用することができる。最後に、蛍光レポーターの発現は、細胞生理を乱すことがあり、それを確保すべきである、そのような細胞としての性質サイクル時間は影響を受けません。refに記載の実験インチTSRはすでに高度に発現する膜タンパク質や細胞の挙動に影響を与えないことが予想されたTSRの発現の増加が少ないですので、1、我々は、膜局在配列といったTSRタンパク質を使用していました。
必要に応じて、4つ目は、具体的に論じTSR-金星-Ubを以外のレポーター配列が使用されている場合、対応する撮像プロトコルも変更する必要があります。たとえば、異なる蛍光タンパク質は、異なる照明プロトコルが効率的にレーザー露光から蛍光タンパク質分子は、光毒性を検出すると退色との間の良好なバランスを達成するために必要になります。理想的には、レーザー励起は、選択された蛍光タンパク質の吸光度のピーク時でなければなりません。オフピークの励起は、より高い励起強度（従って、より高い光毒性と自家蛍光バックグラウンド）が同じ蛍光タンパク質の発光と光退色特性を達成するために必要です。また、撮像周波数はレーザー露光の光毒性に対する細胞の耐性に応じて5分より遅いまたはより速くなるように修正することができます。我々の実験では、12の別々のE.大腸菌コロニーを 5分毎に撮影し、実質的な毒性の欠陥1を観察する前に 7から8細胞周期続いていた。
タンパク質生産のタイムラプス動画はCoTrAC実験（例では、 図4および図5に示すように）に買収された後、最後に、蛍光タンパク質の発現は、個々の細胞に分子を割り当てて、1つ以上の分子に相当する蛍光スポットを検出することによって定量化する必要があり、細胞系譜を追跡する。我々は、λリプレッサーのCI生産1を勉強するために、カスタムMatlabのルーチンを記述している。次の画像フレームを介して細胞系譜を追跡しながら、簡単に説明すると、1は最初の明視野画像内の細胞分裂に対応する個々の細胞と時間ポイントのアウトラインを識別する必要がありますsである。我々は、5分の時間間隔が1フレーム内のセルは通常、それが分割された画像の中で最も画素をどの共有と前のフレームのセルに相当することが十分に短いことがわかった。 2その後のフレームの間にコロニーの時折大きなシフトが観察された例では、彼らの系統への個々の細胞の手動割り当てが必要でした。次に、一方は蛍光スポットを特定し、それらの強度を定量化する必要があります。我々は、蛍光スポットが（1）バンドは低周波蛍光バックグラウンドを除去するために蛍光画像をフィルタリング（ 例えば自家蛍光）と高周波ノイズ、（2）蛍光強度に基づいて画像をしきい値と（3）のオブジェクトを識別することによって同定することができたことがわかった閾値処理画像にはいくつかのピクセルよりも大きい。バイナリ画像内のオブジェクトは2次元ガウス関数と定数背景にフィットし、スポットの積分強度はフィット振幅と分散の積とした。我々の実験では、複数のTSR-金星-Ubの記者は、多くの場合、単一のTSR-金星分子からのものよりも明るかったスポットを作成、細胞極で共局在した。 1スポット内ヴィーナス分子の数は、スポットは複数の蛍光タンパク質が含まれていることはめったにありませんした低発現レベルの菌株を用いて定量したシングル金星分子の蛍光強度によってスポットの積分強度を割ることによって定量化した分子。この測定は、さらにスライドガラスに付着した単一の蛍光タンパク質分子の in vitro測定においてで補充することができます。我々は、蛍光タンパク質の特性がin vivoおよび同様の緩衝条件付きvitro（試験管内）系で概ね類似していることを発見した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
私たちには開示しません。
Acknowledgments
Ubp1を発現するプラスミドpCG001は、親切に医学研究のジョン·カーティン学校でロハンベイカーによって提供されました。この作品は、ダイム研究助成1〜2011年度の3月ダイムバジルオコナースターター客員研究賞＃5-FY20とNSFキャリアアワード0746796の行進によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
