Summary
Bu görüntü ile yarılması ile bir floresan mikroskobu yöntem, CO-translasyonel Aktivasyon (CoTrAC), proteinin işlevi dalgalanmayla olmaksızın tek molekül hassas canlı hücrelerde protein moleküllerinin üretimini açıklar. Bu yöntem, bir transkripsiyon faktörü, λ repressör CI stokastik ifade dinamik takip etmek için kullanılmıştır
Abstract
Bu görüntü ile yarılması ile bir floresan mikroskobu yöntem, CO-translasyonel Aktivasyon (CoTrAC) proteinin işlevi dalgalanmayla olmaksızın tek molekül hassas canlı hücrelerde protein moleküllerinin üretimini açıklar. Bu yöntem, bu mümkün ardışık beş dakikalık bir zaman pencereleri sırasında bir hücre tarafından üretilen protein moleküllerinin sayısını saymak mümkün kılar. Bu canlı hücrelerde tek floresan protein molekülleri tespit etmek için yeterince hassas olan ~ 0,5 1 kW / cm 2, lazer uyarma güç yoğunluğuna sahip bir floresan mikroskop gerektirir. Bir zar hedefleme sırası, bir hızlı-olgunlaşma, sarı floresan protein ve bir proteaz tanıma sekansı: bu yöntemde kullanılan flüoresan raportör üç parçadan oluşur. Raportör Çevrimsel ilgi çeken bir proteinin N-terminusunda için eritilerek birleştirilir. Hücreler bir sıcaklık kontrollü mikroskop sahnede yetiştirilir. Her beş dakikada, hücrelerin içindeki floresan molekülü (ve daha sonra eş görüntülü) floresans görüntüleri analiz ederek unted ve sadece yeni tercüme proteinler sonraki ölçüm sayılan böylece sonradan photobleached.
Bu yöntem sonucunda floresans görüntüler, her bir görüntü floresan noktalar tespit tek hücreleri atayarak ve ardından hücre soylarının hücreleri atayarak analiz edilebilir. Belirli bir hücreye bir zaman penceresi içinde üretilen proteinlerin sayısı tek flüoresan moleküllerinin ortalama yoğunluk tarafından lekelerin entegre floresan yoğunluğu bölünmesiyle hesaplanır. Bu tek bir 5 dakikalık bir zaman pencereleri içinde 0-45 molekül aralığında ifade seviyelerini ölçmek için bu yöntem kullanılır. Bu yöntem bize λ repressör CI ifadesi gürültü ölçmek için etkin ve sistem biyolojisi diğer birçok potansiyel uygulamalar vardır.
Protocol
1. Gerinim Mühendislik İş Akışı
- Dizileri kodlama (a) bir zar-yerelleştirme dizisi, (b) bir hızla olgunlaşan floresan protein ve bir ilgi ve protein (örneğin, bir transkripsiyon faktörü) ile çerçeve (c) bir proteaz tanıma sekansı, N-terminalinde. Ekleme Biz Tsr-Venüs muhabiri 2 hedef membran kullanılan ve ifade bakteriyofaj λ repressör CI protein moleküllerinin sayısını saymak için Ubikitin proteaz tanıma dizisi (Ub) için erimiş. Biz bölgenin kodlama CI yabani tip değiştirilmesi ve E. içine yapı birleştiren, füzyon proteini Tsr-Venus-UB-CI inşa nasıl Detayları λ Red 3 rekombinasyon kullanılarak coli kromozomu, ref ayrıntılı olarak tarif edilmektedir. 1.
- Sıralanmasıyla tüm değişiklikler doğrulayın.
- Bir plazmid kodlama ilgi flüoresan raportör proteini eksprese eden ve bir yük içine yukarıda kullanılan tanıma dizisi için spesifik bir proteaz Dönüşümütranslasyonel füzyon. Bu C-terminal artığı ubikitin 4 hemen sonra parçalayarak proteaz Ubp1 kullanılmıştır.
2. Kültür Hücreler ve örnek hazırlayın
- Biri E. seçin taze streaked agar plağından ilgi coli kolonisi 1 ml M9 minimal medya içine 5 1X MEM amino asitler ve uygun antibiyotik ile desteklenmiş. İstenen sıcaklıkta bir çalkalayıcı içinde inkübe yeterince uzun ulaşmak için OD 600> 1.0 (600 nm de optik yoğunluk).
- OD 600 = 0.02 için uygun antibiyotik ile 1 ml taze M9 ortama kültürü seyreltin. Uygun bir sıcaklıkta bir çalkalayıcı içinde inkübe edin. Düşük sıcaklık büyümesi için gerekli olmadığını Ilk hücre yoğunluğunda artış olabilir.
- OD 600 = 0.2-0.3 (37 OD 600 bir başlangıç hücre kültürü ile ° C = 0.02, bu 3-4 saat sürer), agaroz jel pedi (adım 3) hazırlarken başladığınızda.
- Zaman OD hücreleri görüntüleme için hazır
- 1,5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir benchtop mikrosantrifüj 1 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj içine 1 ml İnkübe kültürü aktarın.
- Süpernatantı atın ve 1 ml taze M9 orta ekleyin ve pelet hafifçe tekrar süspansiyon haline getirin.
- 1 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin.
- 1.6 ve 1.7 adımları tekrarlayın. Süpernatantı atın.
- Yavaşça 1 ml M9 medyada tekrar süspansiyon haline getirin. Timelapse görüntüleme için düşük hücre yoğunlukları sağlamak üzere 100-kat için - hücreler direkt olarak mikroskop görüntüleme ya da seyreltilmiş 10 için de kullanılabilir. Düşük hücre yoğunlukları uzatılmış timelapse görüntüleme için önemli olduğunu unutmayın. Görüntüleme odası (adım 4) deneme sırasında mühürlenir. Hücrelerin üstel büyüme nedeniyle, yüksek başlangıç hücre konsantrasyonları anlamlı floresan protein olgunlaşması azaltılması ve hücre büyümesini etkileyen, jel pedi uzun süreli büyüme sonra odasının içindeki oksijeni tüketebilir.
3. Agaroz Çözüm hazırlayın
- 10-20 mg tartılır1,5 ml mikrosantrifüj tüpe düşük erime sıcaklığına agaroz.
- % 3 agaroz çözüm yapmak antibiyotik vermeden uygun miktarda M9 minimal orta ekleyin.
- 70, 30 dakika için agaroz çözelti ısıtılır ° C, çözelti tamamen eritilmiş ve homojen olmasını sağlamak için ters tüp eritir. Jel pedi bu noktada (adım 4) dökülecek veya sıcaklık 50 ° C'ye düşmüş ve daha sonra kullanmak için birkaç saat tutulabilir.
4. Odası Jel Tampon hazırlayın
- Görüntüleme öncesinde yaklaşık 50 dakika su ile bir Microaqueduct slayt durulayın.
- Bir kapak cam temizliği (6 açıklandığı gibi zaten sıkı bir temizleme yöntemi ile) ve basınçlı hava ile üfleme steril su ve kuru ile slayt Microaqueduct tutunuz.
- Bu uygulamalar için modifiye edilebilir Microaqueduct sürgüyle (arasında cam tarafında giriş ve çıkışları kapsayan, böylece Microaqueduct slayt üzerinde lastik bir contahangi medya) numune içinden perfüze edilmiştir. Microaqueduct slaydın merkezine 50 ul agaroz çözeltisi (adım 3) uygulanır.
- Temiz, kuru cam kapak ile agaroz çözüm ekleyin.
- Agaroz çözelti 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir.
- Bu arada, (adım 2), bir hücre örneği hazırlamak.
- Dikkatle jel ped üst cam kapak soyulabilir. Jel yastığı başına 1.0 ul yıkanmış hücre kültürü ekleyin. Jel pedi tarafından absorbe edilecek kültür için ~ 2 dakika bekleyin. O kadar uzun beklemek değil önemli olduğunu jel pedi overdries, ama yeterince uzun hücrelerinin düzgün jel pedi uyduğunu. İdeal bekleme süresi sıcaklık ve nem ile değişir.
- Beklerken, başka precleaned cam kapak kurulayın.
- Cam kapak ve Microaqueduct slayt iyi hizalanmış olduğunu kontrol ettikten yeni cam kapak ile örnek örtün.
- Üreticinin yönergelerini izleyerek sıcaklık kontrollü iklim odasında birleştirin.Şimdi mikroskobu (adım 5) görüntüleme için kullanılabilir.
5. Görüntüleme ve Timelapse Filmler kazanılması
- Üreticinin talimatlarına (örneğin lazer deney öncesi ~ 0.5 saat süreyle ısınmış gerekebilir) takiben lazer ve mikroskop açın.
- Mikroskop sahne yazısına monte odasına kilitleyin. Büyüme oda sıcaklığı ve 37 ° C ya da istenen diğer büyüme sıcaklıkta amaç ısıtıcı ayarlayın.
- Oda sıcaklığının üzerinde görüntüleme, odak ya da jel pedi genellikle ilk sıcaklık kayması sonra ~ 15 dakika için önemli ölçüde sürüklenir. Uygulamada, ilgi alanları bulmak ve bir deney için gerekli görüntüleme komut dosyalarını değiştirmek için bu kez kullanın.
- Mikroskop hücreleri bulun ve önceden tanımlanmış ve hizalanmış görüntüleme bölgede bu merkezleme sonra her hücrenin konumunu kaydetmek. Birden fazla hücre Her görüntü alımından zaman penceresinde görüntülenebilir. M üzerinde timelapse görüntüleme içinherhangi kuşaklar, diğer koloniler büyüme sırasında görüntüleme bölge girmeyecek şekilde görüntülü hücreleri başlangıçta yüz, en az birkaç mikron ile diğer hücrelerinden ayrılan olduğundan emin olun.
- Böylece lazer uyarma yoğunluğunu ayarlayın ki 6 poz içindeki hemen hemen tüm floresan molekülü photobleach (Şekil 5).
- , Otomatik bir görüntü dosyası / günlük, Şekil 3 'de açıklanan deneysel akışı algoritması kullanılarak veri timelapse elde kullanılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Λ repressör CI üretim takip bir CoTrAC deneyden elde Tipik sonuçlar Şekiller 4 ve 5 'de gösterilmiştir. Bu deneyde, 12 koloniler 5 dakika aralıklarla görüntülenmiştir. Her zaman noktasında, koloni birinci autofocused edildi ve görüntüleme bölge içinde merkezi. Sonraki odaklı / merkezli pozisyonu saklanan ve aydınlık görüntü elde edildi. Evresi hücrelerin (faz-kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik olmadan bisecting düzlemine aydınlık odak düzlemi taşımak için z ekseni boyunca ~ 0,5 mikron ile transloke edildi, yarı saydam nesneler biraz az imaged olabilir out-of-odak düzlemleri 8). Nihayet, altı görüntüleri 100 milisaniye pozlama (Şekil 5 böyle bir zaman noktasını gösterir) ile 1 sn aralıklarla, her biri elde edildi. Bu, her bir zaman noktasındaki bütün hücreler için de tekrarlandı. Neredeyse tüm Venus molekülleri her timepoint, floresan de photobleached ÇünküŞekiller 4 ve 5 içinde yüzde lekelerin son 5 dakika içinde (floresan olmuştur) olgunlaşmış Venüs moleküllerine karşılık gelir. Venüs moleküller, 9 4 çok verimli Ubp1 tarafından ~ 2-7 dak 1, 2, 7 ve bölünme bir yarılanma ömrü ile in vivo olarak hızla olgunlaşır. Bu nedenle, son ölçüm itibaren üretilen protein moleküllerinin sayısı doğru bir zar üzerinde sayılır Venüs moleküllerinin sayısı da anlaşılacağı.
Şekil 1. Tek bir transkripsiyon faktörü moleküllerinin ekspresyonu saymak için CoTrAC kullanılması. (1) zar-yerelleştirme dizisi TSR, hızla olgunlaşan YFP Venüs ve ubikitin (Ub) içeren bir haberci bir promot bir transkripsiyon faktörü ile translasyonel füzyon ifade edilirer transkripsiyon faktörü ile düzenlenen. (2) proteaz Ubp1 eş-Çevrimsel C-terminal artığı Ub sonra olgunlaşmamış bir polipeptid ayırır. o tek de sayılabilir burada (3) TSR-Venüs-Ub raportör zar ile lokalize -molekül düzeyinde. (4) transkripsiyon faktörü kendi ifadesini düzenler. Yöntem karikatür.
Şekil 2. CoTrAC Deneylerde kullanılan örnek odası şematik. Hücreler agaroz jel pedi ve kapak cam arasına yerleştirilir. Microaqueduct slayt ve objektif bir elektronik kontrolör kullanılarak sabit bir sıcaklıkta tutulur. Numune hazırlama.
Şekil 3,. Tipik bir deney CoTrAC Akışı. Experizihinsel iş akışı.
Şekil 4. Bir CoTrAC denemeden Tipik timelapse verileri. Görüntüler tek bir koloni 25 dk aralıklarla gösterilir. Bu deneyde, veriler 12 farklı koloniler, her 5 dk satın alındı. (A) aydınlık görüntü. (B) Venüs (YFP) floresans görüntüsü (ortalama arka plan zamanla tüm görüntüleme alanının arka planında değişiklik hesabı çıkartılır). (C ) Kaplama görüntü farklı hücrelerinde 5 dakika süre pencereler (aydınlık ters görüntü ve görüntü Venüs bant geçirici filtre edilmiş olur) üretilen moleküllerinin sayısı olarak TSR-Venüs-Ub raportör moleküller ve heterojenlik kutup yerleşimi görülmektedir. tıklayın sbüyük bir rakam görmek için ere.
Şekil 5,. Bir CoTrAC deneyde tek bir zaman noktasında elde edilen tipik veri. (A) Venüs (YFP) floresans görüntüler. Altı 100 milisaniye maruz her bir 5 dakikalık bir zaman aralığının başlangıcında elde edildi. 6 poz Her floresan haline kapalı kısılmıştı geçici karanlık Venüs moleküller için zaman tanımak için 900 msn ile ayrılmış oldu. (B) analizi için, görüntü 6 ağartılmamış moleküller ve otofloresans arka düzeltmek için görüntü 1 çıkarılır. Bu görüntüdeki Spotlar belirli hücre soylarının lokalize ve entegre floresan yoğunluğu ile ölçülür. (C) koloni ortalama entegre floresans A 6 üzerinde görüntüleri (böylece çizilenkapağı hattı). Bir üstel bozulma için bu satırı takılması artı bir sabit (kesikli çizgi) ofset 1 sn bir çürüme yarı zamanlı verir. Bu deneyde, Venüs moleküller photobleach çok daha hızlı bir şekilde hücresel otofloresansı daha, bu yüzden bu Venüs moleküllerinin toplam sayısının yaklaşık olarak yarısı her bir çerçeve içinde photobleached anlamına gelir. Tek bir zaman noktasında ilerleme photobleaching.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CoTrAC yöntemi geleneksel N-veya C-terminali floresan proteini füzyon proteini etkinliği bozabilir diğer proteinlerin üretimini ölçmek için yaygın olabilir. CoTrAC stratejisi mevcut yöntemler üzerinde üç benzersiz avantajlara sahiptir. İlk olarak, eş-translasyonel füzyon flüoresan raportör molekülü, gerçek zamanlı olarak protein üretim doğru sayımı izin veren, ilgilenilen proteinin her bir molekül için üretilmiş olmasını sağlar. İkincisi, membran hedefli muhabiri Tsr-Venüs çok düşük seviyelerde ifade proteinlerin tespiti sağlayan floresan gazetecilere tek-molekül algılama sağlar. Üçüncü ve en önemlisi, flüoresan raportör ortak-translasyonel bölünme ilgili proteini E. Bir proteaz-tanıma sekansı olarak ubikitin normal olarak kullanan kendi yakın yabani tipteki sekansı ve tutma fonksiyonu sağlar coli, hedef proteinler, sadece ilk N-terminal N yabani-tip peptid dizileri farklı </ Em>-formil-metionin metionin değiştirilir.
CoTrAC yöntemini kullanırken, CoTrAC yöntem (yani, hücre başına mevcut protein moleküllerinin sayısı ölçümü farklı olan, her biri 5 dakika bir zaman aralığı ile üretilen protein moleküllerinin sayısını ölçen akılda tutmak için önemlidir protein konsantrasyonu). Protein üretimi ve yıkımı arasındaki dengeli sonucu çoğu tek hücreli floresans gen ekspresyon analizleri ölçü protein konsantrasyonu. Konsantrasyon ölçüm protein üretimi bilgi çıkarmak için kullanılabilir, bu nedenle, ilgilenilen proteinin degradasyon oranı dikkatle göz önüne alınmalıdır. Ayrıca, protein konsantrasyonu düşük ifade düzeyi proteinler için önemli olabilir ve yanlış bir protein üretim dinamik kaynaklanan olarak yorumlanabilir olabilir hücre bölünmesi az iki yavru hücreleri arasında protein bölme ile dalgalanmalara neden bağlıdır. CoTrAC yöntem modifiye olabilir,yeni üretilen raportör moleküller photobleaching olmayan protein konsantrasyonu ölçmek için ğı, ancak bu ekstra inceleme ile yapılmalıdır. Bir flüoresan raportör ve ilgilenilen protein bozunma oranları benzerdir ve aynı şekilde flüoresan raportör konsantrasyonu ilgilenilen protein yansıtır, böylece, hücre bölünmesi üzerine kız iki hücre içine bölümlenmiş her ikisinin de teyit etmelidir.
Bu CoTrAC protein dizisi değiştirmez iken, raportör gen ilavesi mRNA sekansının değiştirir olduğuna dikkat edin. Bu nedenle, transkripsiyon ve translasyon dinamikleri ve / veya mRNA transkript bozunma oranları tedirgin olabilir. CoTrAC yöntem yabani-tip protein üretim bağlamında gözlemlemek için kullanılır, bu da vahşi tip sıra olarak ve CoTrAC floresan füzyon tag ile her ikisi de hedef proteinin ifade seviyeleri (örneğin, ref karşılaştırmak için önemlidir. 1 karşılaştırdık Bizim CoTrAC inşaat ifade CIbir yabani-tip lysogen boyunca olduğu gibi, t). Aşağıda CoTrAC yöntemi genelleme için gerekli hususlar tartışacağız.
Öncelikle, biz Tsr-Venüs-Ub dışındaki dizileri kullanarak olasılığını tartışıyor. Genel şartlar: bu da çabuk yaygın etmeyecek şekilde (1) raportör (TSR, gazetecilere hücre kutup 1 de) hücre içindeki bazı pozisyonlar için lokalize edilmelidir. Bu, hızlı bir şekilde difüzyon floresan protein molekülünün sinyali olarak bir floresan protein molekülünün tek molekül tespiti için genellikle bir hücrenin autofluorescent arka plan üzerinde tespit olmayacak gerekli olduğu, (2), floresan protein tespit edilmesi için yeterli derecede parlak olması gerekir tek-molekül düzeyinde ve (Venüs tarihinden 7 hızlı olgunlaşan floresan protein) istenen uygulama için yeterince hızlı (floresan haline) olgunlaşması gerekir; ki yeni floresan proteinleri olabilir ki (3), floresan protein tespiti sonrasında photobleached gerekir dedaha sonraki zaman noktalarında (photobleaching karşı aşırı derecede dirençli olan floresan protein aşırı lazer maruz kalma gibi istenmeyen fototoksisite eserler neden olabilir) de korunan, (4), proteaz tanıma sekansı, işlevselliği karıştırmayı edecektir ki, ilgili proteini üzerindeki herhangi bir kalıntı amino asit terk edemez (hemen karboksi-terminal Ub kalıntı sonra Ubp1 keser, hiç bir ilave artıkları bırakarak).
İkincisi, bir muhabir düzgün ifade ve parçalanabilen olduğunu doğrulamanız gerekir. İlgili proteini ikinci haberci ayıran proteolitik bölünme etkili olması gerekir; bölünme etkinliğini, raportör karşı ilgi protein ya da her ikisi de (örneğin antikorlar, anti-GFP olarak çok floresan antikor proteinleri için ticari olarak temin edilebilir JL-Western blot ile ölçülebilir Western blot Venüs bağlar Clontech, 8). Bir hayır uncleaved füzyon proteini füzyon salgılayan hücrelerin lizatları karşı lekeleri tespit emin olmalıdırCoTrAC deneylerde beklenenden daha yüksek seviyelerde proteini. Ayrıca, ilgilenilen protein ve raportör bölünme sonra bir 1:1 oranında üretilmiş olması gerekir. Bu anti-muhabir ve proteaz eksik suşlarında uncleaved bantların yoğunlukları ile normalize anti-protein-faiz Western blot içinde yarılan bantların yoğunlukları ölçülerek kontrol edilebilir. Ilgi muhabiri ve protein, sonra bölünme sonra 1:1 oranında mevcut ise:
Muhabir ve ilgilenilen protein bölünme sonrasında farklı bozunma oranları sergiliyorsa, Western blot ölçü protein konsantrasyonu, çünkü elde edilen oran 1:1 ila sapma dikkat ediniz.
Üçüncüsü, bir ilgi protein dilinim sonra beklenen işlevselliğini sergiler olduğunu doğrulamanız gerekir. Büyük muhabir varlığı en transkripsiyon faktörleri inaktive etmek için beklenen füzyon ve / veya hücre zarının yerelleştirme inşa (λ repressör CI eş olduğuBizim deneyler 1) Ubp1 ifadesi olmadan mpletely inaktif. Proteaz ifade plazmidi dönüşümü büyük translasyonel füzyon tag kurtarılması protein ile ilgili proteini aktif hale getirin. Bu fenomen diğer olası CoTrAC uygulamalara yol açmaktadır. Ubp1 ile Ub karboksi terminus Yarılma protein yıkımı 9 bakteri N-uç kural aydınlatmak için standart olmayan amino-terminal amino asitleri göstermek için kullanılmıştır. Büyük, membran ilişkili muhabiri füzyon bir transkripsiyon faktörü (veya böyle bir enzim gibi diğer protein) inaktive olursa, faaliyet hızlı indükleyici proteaz ifade tarafından kurtarıldı olabilir. CoTrAC çok hızlı kaldırma / inhibitörü / ko-aktivatör ekleyerek veya başka bir proteaz ekspresyonu ya da aktivitesi başlatarak transkripsiyon faktörleri önceden var olan bir havuz "açmak" için kullanılan olabilir. Son olarak, flüoresan raportör ifadesi hücre fizyolojisi karıştırmayı ve bu, sağlanmalıdır ki, hücre gibi özelliklerinçevrim süresi etkilenmez; ref açıklanan deneyde. Tsr zaten bir derece ifade membran proteini ve hücre davranışlarını etkilemesi bekleniyor değildi Tsr ifadesi küçük bir artış olduğu için 1, bir membran-yerelleştirme dizisi olarak Tsr protein kullanılan.
Gerektiğinde Dördüncü olarak, özellikle ele TSR-Venüs-Ub başka bir raportör dizisi kullanılır iken, karşılık gelen görüntü protokol da modifiye edilmelidir. Örneğin, farklı floresan proteinleri farklı aydınlatma protokolleri verimli lazer pozlama floresan protein molekülleri, fototoksisite tespit ve photobleaching arasında iyi bir denge elde etmek isteyecektir. İdeal olarak, lazer uyarma seçilen floresan protein absorbans zirvesinde olmalıdır; off-peak uyarma aynı floresan proteini emisyon ve photobleaching özellikleri elde etmek için daha yüksek uyarma yoğunlukları (ve böylece daha yüksek fototoksisite ve otofloresans arka) gerektirir. Ayrıca,görüntüleme frekans lazer maruz fototoksisite için hücrelerin toleransına bağlı olarak 5 dakikadan daha yavaş veya hızlı olması için modifiye edilebilir. Deneylerde, 12 ayrı E. coli kolonilerinin her 5 dk görüntülü ve önemli fototoksisite defektleri 1 gözlemleyerek önce 7-8 hücre siklusu boyunca takip edildi.
Son olarak, protein üretimi, hızlandırılmış filmler sonra, bir deney CoTrAC (örnek olarak Şekil 4 ve 5'te gösterildiği gibi) olarak elde edilen, floresan protein ekspresyonu, bir tane ya da daha fazla molekül ile karşılık gelen noktalar flüoresan tespit tek tek hücreler ile molekülleri atanması ve tarafından sayılabilir gereken hücre soylarının izleme. Biz λ repressör CI üretimi 1 okumak için özel bir Matlab rutin nitelendirdiler. Sonraki resim çerçevesi yoluyla hücre soylarının izlerken Kısaca, bir ilk aydınlık görüntüler hücre bölünmesi karşılık bireysel hücrelerin ve zaman noktalarının anahatlarını belirlemek gerekirs. Biz bir 5 dk zaman aralığı tek bir kare bir hücre genellikle bir bölümlenmiş görüntü en piksel paylaştı hangi ile önceki çerçeve içinde hücreye karşılık geldiğini yeterince kısa olduğu bulunmuştur. İki kareler arasındaki kolonilerin arada büyük kaymalar gözlendi durumlarda, onların soyları bireysel hücrelerin kılavuzu ataması gerekiyordu. Daha sonra, bir floresan noktalar belirlemek ve yoğunluğunu ölçmek için gerekmektedir. Biz floresan noktalar (1) band düşük frekanslı floresan arka planı kaldırmak için floresans görüntü filtreleme (örneğin otofloresans) ve yüksek frekanslı gürültü, (2) floresan yoğunluğu dayalı görüntü eşikleme ve (3) nesneleri tanımlayarak tespit edilebileceği bulundu eşiklenir görüntü birkaç pikselden daha büyük. Eşiklenir görüntüdeki nesnelerin 2 boyutlu bir Gauss fonksiyonu artı sabit bir arka plan için uygun bulundular ve spot entegre yoğunluğu uygun genlik ve varyans ürünü olarak alınmıştır.Deneylerde, birden Tsr-Venüs-Ub muhabirler genellikle tek Tsr-Venüs moleküllerden daha parlak olduğu noktalar oluşturarak, hücre kutuplarda eş lokalize. Bir nokta içinde Venüs molekül sayısı noktalar nadiren birden fazla floresan protein ihtiva eden bir düşük-seviyeli ifade suşu kullanılarak ölçüldü bir tek Venüs molekülün floresans şiddeti, tarafından nokta entegre yoğunluk bölünmesi ile ölçüldü molekülü. Bu ölçüm daha bir cam slayt yapıştırılır tek floresan protein moleküllerinin in vitro ölçümleri ile takviye edilebilir. Biz, floresan protein özellikleri, in vivo ve benzer koşullar tampon ile in vitro sistemlerinde büyük ölçüde benzer olduğunu bulduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz hiçbir açıklama yok.
Acknowledgments
Ubp1 ifade plazmid pCG001 nazik Tıbbi Araştırma John Curtin Okulu'nda Rohan Baker tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma Dimes Araştırma Bursu 1-FY2011 Mart Dimes, Basil O'Connor Başlangıç Akademik Araştırma Ödülü # 5-FY20 ve NSF KARİYER Ödülü 0.746.796 Mart tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
