Summary
हम एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधि, विखंडन द्वारा सक्रियकरण सह translational (CoTrAC), छवि के लिए है प्रोटीन कार्यक्षमता perturbing बिना अणु परिशुद्धता के साथ जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन अणुओं के उत्पादन का वर्णन करता है. इस विधि के लिए एक प्रतिलेखन कारक, λ repressor सीआई के stochastic अभिव्यक्ति गतिशीलता का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है
Abstract
हम एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधि, विखंडन द्वारा सक्रियकरण सह translational (CoTrAC) छवि है प्रोटीन कार्यक्षमता perturbing बिना अणु परिशुद्धता के साथ जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन अणुओं के उत्पादन का वर्णन करता है. इस विधि प्रोटीन अनुक्रमिक, पांच मिनट का समय खिड़कियां के दौरान एक कक्ष में उत्पादित अणु की संख्या की गिनती करने के लिए यह संभव बनाता है. यह ~ 0.5 से 1 किलोवाट / 2 सेमी है, जो पर्याप्त रूप से जीवित कोशिकाओं में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन अणु का पता लगाने के लिए संवेदनशील है लेजर उत्तेजना शक्ति घनत्व के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की आवश्यकता है. अनुक्रम लक्ष्यीकरण झिल्ली, एक तेजी से परिपक्व, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एक protease मान्यता अनुक्रम: फ्लोरोसेंट इस विधि में इस्तेमाल संवाददाता तीन हिस्से होते हैं. संवाददाता translationally ब्याज की एक प्रोटीन के एन टर्मिनस से जुड़े हुए है. कोशिकाओं एक खुर्दबीन तापमान नियंत्रित चरण पर हो रहे हैं. हर पांच मिनट के भीतर कोशिकाओं फ्लोरोसेंट अणु (और बाद में सह हैं imagedप्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण) द्वारा Unted और बाद में photobleached इतना है कि केवल नव अनुवादित प्रोटीन अगले माप में गिने जाते हैं.
प्रतिदीप्ति इस विधि से उत्पन्न छवियों प्रत्येक छवि में फ्लोरोसेंट स्थानों का पता लगाने, उन्हें व्यक्तिगत कोशिकाओं को बताए और फिर सेल प्रजातियों के लिए कोशिकाओं को बताए द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. एक दिया सेल में एक समय खिड़की के भीतर उत्पादित प्रोटीन की संख्या एक फ्लोरोसेंट अणु के औसत तीव्रता से स्पॉट की एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता विभाजित करके गणना की है. हम भी 5 मिनट समय खिड़कियों में 0-45 अणुओं की सीमा में अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के लिए इस विधि का इस्तेमाल. इस विधि हमें λ repressor सीआई की अभिव्यक्ति में शोर को मापने के लिए सक्षम होना चाहिए, और सिस्टम जीव विज्ञान में कई अन्य संभावित आवेदन किया है.
Protocol
1. तनाव इंजीनियरिंग कार्यप्रवाह
- दृश्यों (एक) एन्कोडिंग एक झिल्ली स्थानीयकरण अनुक्रम, (ख) एक तेजी से परिपक्व फ्लोरोसेंट प्रोटीन और (ग) एक protease मान्यता अनुक्रम और ब्याज की एक प्रोटीन (जैसे एक प्रतिलेखन कारक) के साथ फ्रेम में एन टर्मिनल. डालें हम टीएसआर वीनस 2 संवाददाता लक्षित झिल्ली का इस्तेमाल किया और यह protease मान्यता Ubiquitin अनुक्रम (यूबी) के लिए जुड़े हुए व्यक्त जीवाणुभोजी λ repressor सीआई प्रोटीन अणुओं की संख्या गिनती. कैसे हम संलयन प्रोटीन TSR वीनस UB-CI का निर्माण, क्षेत्र कोडिंग सीआई जंगली प्रकार की जगह और ई. में का निर्माण शामिल विवरण कोलाई गुणसूत्र, λ लाल पुनर्संयोजन 3 का उपयोग करने के लिए विस्तार में रेफरी में वर्णित हैं. 1.
- सभी संशोधनों अनुक्रमण द्वारा जांचें.
- एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग मान्यता एक फ्लोरोसेंट और ब्याज की रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त तनाव में ऊपर प्रयोग किया जाता अनुक्रम करने के लिए विशेष protease रूपांतरणtranslational संलयन में. हम Ubp1 protease, है है जो सी टर्मिनल Ubiquitin 4 अवशेषों के बाद तुरंत cleaves इस्तेमाल किया.
2. कल्चर कोशिकाओं और नमूना तैयार
- एक ई. उठाओ एक ताजा रेखादार अगर थाली से ब्याज की कॉलोनी 1 मिलीलीटर M9 न्यूनतम 5 मीडिया में कोलाई 1X सदस्य अमीनो एसिड और उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक. वांछित तापमान में एक प्रकार के बरतन में सेते हैं लंबे समय के लिए पर्याप्त 600 आयुध डिपो 1.0 (600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व) तक पहुँचने के लिए
- 1 मिलीलीटर ताजा M9 मध्यम में 600 आयुध डिपो 0.02 = उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ संस्कृति पतला. एक प्रकार के बरतन में उचित तापमान पर सेते हैं. अगर कम तापमान की वृद्धि के लिए आवश्यक प्रारंभिक सेलुलर घनत्व बढ़ सकता है.
- जब आयुध डिपो 600 0.2-0.3 = (37 ° सी 600 आयुध डिपो में एक प्रारंभिक सेल संस्कृति के साथ = 0.02, यह 3-4 घंटा ले जाएगा), agarose जेल पैड (3 कदम) की तैयारी शुरू.
- कोशिकाओं इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं आयुध डिपो जब
- एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, एक benchtop microcentrifuge में 1 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र में 1 मिलीलीटर incubated संस्कृति स्थानांतरण.
- तैरनेवाला त्यागें और 1 मिलीलीटर ताजा M9 मध्यम जोड़ने और गोली धीरे resuspend.
- 1 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
- 1.6 और 1.7 कदम दोहराएँ. तैरनेवाला त्यागें.
- धीरे 1 मिलीलीटर M9 मीडिया में resuspend. 100 गुना timelapse इमेजिंग के लिए कम सेल घनत्व को सुनिश्चित करने के लिए - कोशिकाओं को सीधे किया जा सकता है खुर्दबीन इमेजिंग या 10 पतला के लिए इस्तेमाल किया. ध्यान रखें कि कम सेल घनत्व बढ़ाया timelapse इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं. इमेजिंग चैम्बर (4 कदम) प्रयोग के दौरान बंद है. कारण कोशिकाओं के घातीय वृद्धि के लिए, उच्च प्रारंभिक सेल सांद्रता काफी कक्ष के भीतर ऑक्सीजन खलाना कर सकते हैं जेल पैड में लंबे समय तक विकास के बाद, फ्लोरोसेंट प्रोटीन परिपक्वता को कम करने और कोशिकाओं के विकास को प्रभावित.
3. Agarose समाधान तैयार
- 10-20 मिलीग्राम वजनएक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में कम पिघलने तापमान agarose.
- एंटीबायोटिक दवाओं के बिना एक 3% agarose समाधान करने के लिए उचित मात्रा M9 न्यूनतम मध्यम जोड़ें.
- 70 पर 30 मिनट के लिए agarose समाधान गर्मी ° C पिघल, inverting ट्यूब करने के लिए सुनिश्चित करें कि समाधान पूरी तरह से पिघल और समरूप है. जेल पैड इस बिंदु (4 कदम) पर डाला जा सकता है या तापमान 50 डिग्री सेल्सियस तक कम किया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए कई घंटे के लिए आयोजित किया.
4. चैंबर पर जेल पैड तैयार
- इमेजिंग पहले के बारे में 50 मिनट, पानी के साथ एक Microaqueduct स्लाइड कुल्ला.
- कुल्ला एक गिलास को कवर साफ (जैसे कि 6 में वर्णित एक कड़े सफाई विधि का उपयोग करते हुए) और संपीड़ित हवा के साथ बह द्वारा बाँझ पानी और सूखे के साथ स्लाइड Microaqueduct.
- Microaqueduct स्लाइड पर रबर गैसकेट प्लेस इतना है कि यह Microaqueduct (स्लाइड के गिलास पक्ष पर और inlets के आउटलेट को शामिल किया गया है इस लिए आवेदन पत्र में संशोधित किया जा सकता हैजो मीडिया नमूने के माध्यम से perfused है). 50 μl agarose Microaqueduct स्लाइड के केंद्र के लिए समाधान (3 कदम) लागू.
- साफ, सूखी कवर कांच के साथ agarose समाधान शीर्ष.
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए खड़े agarose समाधान.
- इस बीच, एक सेल का नमूना तैयार (2 कदम).
- ध्यान से जेल पैड के ऊपर से कवर कांच से दूर छील. जेल पैड के ऊपर 1.0 μl धोया सेल संस्कृति जोड़ें. ~ जेल पैड द्वारा अवशोषित हो संस्कृति के लिए 2 मिनट के लिए रुको. यह महत्वपूर्ण है कि इतने लंबे समय के लिए इंतजार नहीं है कि जेल पैड overdries, लेकिन लंबे समय पर्याप्त है कि कोशिकाओं को ठीक से जेल पैड का पालन कर रहे हैं. आदर्श इंतज़ार कर समय तापमान और आर्द्रता के साथ अलग अलग होंगे.
- जबकि इंतज़ार कर रही है, एक और precleaned कवर कांच सूखी.
- कवर नया कवर गिलास के साथ यह सुनिश्चित करना है कि कवर कांच और Microaqueduct स्लाइड अच्छी तरह से गठबंधन कर रहे हैं नमूना.
- तापमान नियंत्रित विकास चैम्बर निर्माता के निर्देशों का पालन इकट्ठा.यह अब खुर्दबीन पर इमेजिंग (5 कदम) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. इमेजिंग और Timelapse सिनेमा का अधिग्रहण
- लेजर और निर्माता के निर्देशों (जैसे लेजर ~ 0.5 घंटे के लिए प्रयोग से पहले गरम की आवश्यकता हो सकती है) के बाद खुर्दबीन पर मुड़ें.
- खुर्दबीन मंच पर डालने के लिए इकट्ठे कक्ष लॉक. विकास चैम्बर के तापमान और 37 डिग्री सेल्सियस या अन्य वांछित वृद्धि तापमान उद्देश्य हीटर सेट.
- यदि कमरे के तापमान से ऊपर इमेजिंग, ध्यान या जेल पैड आमतौर पर ~ 15 मिनट के लिए काफी प्रारंभिक तापमान में बदलाव के बाद बहाव जाएगा. अभ्यास में, इस समय का उपयोग करने के लिए हित के क्षेत्रों को खोजने के लिए और एक प्रयोग के लिए आवश्यक के रूप में इमेजिंग लिपियों को संशोधित.
- माइक्रोस्कोप कोशिकाओं और यह एक पूर्वनिर्धारित और गठबंधन इमेजिंग क्षेत्र के भीतर केंद्रित के बाद प्रत्येक कोशिका की स्थिति की दुकान. एक से अधिक सेल प्रत्येक छवि अधिग्रहण के समय विंडो में imaged किया जा सकता है. मीटर से अधिक timelapse इमेजिंग के लिएकिसी भी पीढ़ियों को सुनिश्चित करने के लिए, है कि imaged कोशिकाओं शुरू में कम से कम एक सौ कुछ सुक्ष्ममापी द्वारा अन्य कोशिकाओं से अलग इतना है कि अन्य कालोनियों के विकास के दौरान इमेजिंग क्षेत्र में प्रवेश नहीं करेगा.
- लेजर उत्तेजना की तीव्रता समायोजित करें ताकि लगभग 6 जोखिम के भीतर सभी फ्लोरोसेंट अणु photobleach (5 चित्रा).
- एक स्वचालित इमेजिंग स्क्रिप्ट / पत्रिका, timelapse चित्रा 3 में प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह में वर्णित एल्गोरिथ्म का उपयोग डेटा के अधिग्रहण का उपयोग.
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Representative Results
ठेठ एक CoTrAC λ repressor सीआई के उत्पादन पर नज़र रखने के प्रयोग से परिणाम आंकड़े 4 और 5 में दिखाए जाते हैं. इस प्रयोग में, 12 कालोनियों के 5 मिनट के अंतराल पर imaged थे. प्रत्येक समय बिंदु पर, कॉलोनी और 1 autofocused इमेजिंग के क्षेत्र के भीतर केंद्रीकृत. अगले स्थिति / केन्द्रित केंद्रित संग्रहीत किया गया था और एक brightfield छवि अधिग्रहण कर लिया था. मंच तो z-अक्ष साथ ~ 0.5 सुक्ष्ममापी द्वारा translocated brightfield फोकल हवाई जहाज़ से विमान चाल कोशिकाओं (चरण विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी के बिना bisecting, अर्द्ध पारदर्शी वस्तुओं थोड़ा imaged किया जा सकता है बाहर का ध्यान केंद्रित 8 विमानों). अंत में, छह छवियों 1 सेकंड अंतराल, प्रत्येक में एक 100 मिसे (चित्रा 5 एक ऐसे समय बिंदु से पता चलता है) जोखिम के साथ हासिल किया गया. यह हर समय बिंदु पर सभी कोशिकाओं के लिए दोहराया गया था. क्योंकि लगभग सभी वीनस अणुओं प्रत्येक Timepoint, fluores में photobleachedआंकड़े 4 और 5 में प्रतिशत स्थानों वीनस अणुओं है कि पिछले 5 मिनट के भीतर परिपक्व (फ्लोरोसेंट बन गया) के अनुरूप हैं. वीनस अणुओं vivo में जल्दी से एक Ubp1 द्वारा ~ जनवरी 2-7 मिनट, 2, 7 और दरार की एक आधा जीवन के साथ बहुत ही कुशल है 4, 9 परिपक्व. इसलिए, पिछले माप के बाद से उत्पादित प्रोटीन अणुओं की संख्या को सही वीनस झिल्ली पर गिना अणुओं की संख्या से inferred किया जा सकता है.
चित्रा 1. CoTrAC का उपयोग करने के लिए एक प्रतिलेखन कारक अणुओं की अभिव्यक्ति गिनती (1) झिल्ली स्थानीयकरण अनुक्रम TSR, तेजी से परिपक्व YFP वीनस, और Ubiquitin (यूबी) सहित एक पत्रकार एक promot से एक प्रतिलेखन कारक के साथ translational संलयन में व्यक्त किया है.एर प्रतिलेखन कारक द्वारा विनियमित (2) protease Ubp1 सह translationally सी टर्मिनल यूबी अवशेषों के बाद नवजात पॉलीपेप्टाइड cleaves (3) TSR वीनस यूबी संवाददाता झिल्ली को localizes जहां यह एक में गिना जा सकता है.. स्तर अणु (4) प्रतिलेखन कारक अपनी खुद की अभिव्यक्ति को नियंत्रित कर सकते हैं. विधि कार्टून.
चित्रा 2. नमूना CoTrAC प्रयोगों में इस्तेमाल चैम्बर के योजनाबद्ध कोशिकाओं agarose जेल पैड और गिलास को कवर के बीच रखा जाता है. Microaqueduct स्लाइड और उद्देश्य एक इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रक का उपयोग कर एक निश्चित तापमान पर आयोजित की जाती हैं. नमूना तैयारी.
चित्रा 3. कार्यप्रवाह एक ठेठ CoTrAC प्रयोग के अनुभव.मानसिक कार्यप्रवाह.
चित्रा 4. ठेठ एक CoTrAC प्रयोग से timelapse एक ही कॉलोनी से डेटा छवियाँ 25 मिनट के अंतराल पर दिखाए जाते हैं. इस प्रयोग में, डेटा को 12 विभिन्न कालोनियों से हर 5 मिनट हासिल किया गया (ए) Brightfield छवियों (बी) वीनस (YFP) प्रतिदीप्ति छवि (औसत पृष्ठभूमि बदलने के लिए समय पर पूरे इमेजिंग क्षेत्र की पृष्ठभूमि में खाते करने के लिए घटाया) (सी. ओवरले छवि TSR - वीनस यूबी संवाददाता विभिन्न कक्षों में 5 मिनट का समय खिड़कियां (brightfield छवि उलटा है और वीनस छवि bandpass फ़िल्टर्ड) में उत्पादित अणुओं की संख्या में अणुओं और विविधता के पोल स्थानीयकरण से पता चलता है) क्लिक करें घंटेअरे बड़ा आंकड़ा देखने.
चित्रा 5. एक CoTrAC प्रयोग में एक ही समय में बिंदु से विशिष्ट डेटा (ए) वीनस (YFP) प्रतिदीप्ति छवियों. छह 100 मिसे जोखिम प्रत्येक 5 मिनट समय अंतराल की शुरुआत में हासिल किया गया. 6 जोखिम के प्रत्येक 900 मिसे द्वारा अलग किया गया था transiently अंधेरे वीनस अणुओं है कि बंद blinked था फ्लोरोसेंट बनने के लिए समय की अनुमति (बी) के विश्लेषण के लिए, 6 छवि 1 छवि से घटाया जाता है सख़्त अणुओं और autofluorescence पृष्ठभूमि के लिए सही है. इस छवि में स्पॉट विशेष सेल प्रजातियों लिए स्थानीयकृत रहे हैं और उनके एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा मात्रा (सी) में औसत कॉलोनी के एकीकृत प्रतिदीप्ति 6 छवियों (ताकि साजिश रचीढक्कन लाइन). एक घातीय क्षय के लिए इस लाइन फिटिंग प्लस एक निरंतर ऑफसेट (धराशायी लाइन) 1 सेकंड के एक क्षय आधे समय देता है. इस प्रयोग में, वीनस अणुओं photobleach और अधिक सेलुलर autofluorescence की तुलना में जल्दी है, तो इस का मतलब है कि हर फ्रेम में वीनस अणुओं की कुल संख्या का लगभग आधा photobleached हैं. एक ही समय बिंदु पर प्रगति photobleaching.
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Discussion
CoTrAC विधि जहां पारंपरिक या एन सी टर्मिनल फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions प्रोटीन गतिविधि को बाधित कर सकते हैं अन्य प्रोटीन के उत्पादन को मापने के सामान्यीकरण नहीं किया जा सकता है. CoTrAC रणनीति मौजूदा तरीकों पर तीन अद्वितीय फायदे हैं. पहले, सह translational संलयन सुनिश्चित करता है कि ब्याज की प्रोटीन के प्रत्येक अणु के लिए फ्लोरोसेंट संवाददाता के एक अणु का उत्पादन किया है, वास्तविक समय में प्रोटीन के उत्पादन की सटीक गिनती की अनुमति. दूसरा, रिपोर्टर झिल्ली लक्षित TSR वीनस फ्लोरोसेंट पत्रकारों के एक अणु का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है, बहुत कम स्तर पर व्यक्त प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम करने से. तीसरा और सबसे महत्वपूर्ण बात, फ्लोरोसेंट संवाददाता दरार सह translational ब्याज की प्रोटीन अनुक्रम पास जंगली प्रकार और समारोह को बनाए रखने के लिए ई. में एक दृश्य के रूप में protease मान्यता ubiquitin सामान्य रूप से का उपयोग कर देता है कोलाई, लक्ष्य प्रोटीन केवल कि 1 एन एन टर्मिनल में उनके जंगली प्रकार पेप्टाइड दृश्यों से अलग </ Em> formyl-methionine methionine में बदल जाता है.
जब CoTrAC विधि का उपयोग कर, यह महत्वपूर्ण है को ध्यान में रखना होगा कि हर बार 5 मिनट खिड़की पर CoTrAC विधि प्रोटीन अणुओं की संख्या के उपाय, जो सेल प्रति मौजूद प्रोटीन के अणुओं की संख्या की माप से अलग है (यानी एकाग्रता प्रोटीन). अधिकांश एकल कोशिका प्रतिदीप्ति जीन अभिव्यक्ति assays उपाय प्रोटीन एकाग्रता, जो प्रोटीन के उत्पादन और गिरावट के संतुलित परिणाम है. इसलिए, ब्याज की प्रोटीन की गिरावट की दर को ध्यान से विचार किया जाना चाहिए अगर एकाग्रता माप प्रोटीन के उत्पादन की जानकारी अनुमान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, प्रोटीन एकाग्रता कोशिका विभाजन में दो बेटी कोशिकाओं है, जो कम अभिव्यक्ति के स्तर प्रोटीन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और गलती से प्रोटीन के उत्पादन की गतिशीलता से उत्पन्न होने वाली के रूप में व्याख्या की जा सकती है के बीच प्रोटीन के विभाजन की वजह से उतार - चढ़ाव के अधीन है. CoTrAC विधि मोदी हो सकता हैphotobleaching नव निर्मित संवाददाता अणुओं नहीं प्रोटीन एकाग्रता को मापने fied, लेकिन यह अतिरिक्त जांच के साथ किया जाना चाहिए. एक सत्यापित करना होगा कि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और ब्याज की प्रोटीन की गिरावट की दर समान हैं, और वे दोनों इसी तरह से कोशिका विभाजन पर दो बेटी कोशिकाओं में विभाजित है, इसलिए कि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की एकाग्रता है कि ब्याज की प्रोटीन की दर्शाता है कि.
हम ध्यान दें कि जबकि CoTrAC प्रोटीन अनुक्रम में परिवर्तन नहीं करता है, रिपोर्टर जीन के अलावा mRNA अनुक्रम में परिवर्तन. इसलिए, प्रतिलेखन और अनुवाद की गतिशीलता और / या mRNA प्रतिलेख गिरावट दरों परेशान किया जा सकता है. है यदि CoTrAC विधि जंगली प्रकार के संदर्भ में प्रोटीन के उत्पादन का पालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, यह महत्वपूर्ण है दोनों अपने जंगली प्रकार के अनुक्रम में और CoTrAC फ्लोरोसेंट संलयन टैग के साथ लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर (जैसे रेफरी में की तुलना में 1. हम तुलना हमारे CoTrAC निर्माण में अभिव्यक्ति सीआईजंगली प्रकार lysogen में कि टी). नीचे हम CoTrAC विधि सामान्यीकरण के लिए आवश्यक विचार पर चर्चा की.
सबसे पहले, हम TSR - वीनस - यूबी के अलावा अन्य दृश्यों का उपयोग करने की संभावना पर चर्चा की. सामान्य आवश्यकताओं हैं: (1) संवाददाता सेल के भीतर कुछ स्थिति के लिए स्थानीयकृत किया जाना चाहिए ताकि यह जल्दी फैलाना नहीं है (TSR के साथ संवाददाताओं से सेल 1 डंडे पर हैं). यह आवश्यक है एक जल्दी diffusing फ्लोरोसेंट प्रोटीन अणु से संकेत के रूप में एकल अणु एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन अणु का पता लगाने के लिए आम तौर पर एक सेल autofluorescent पृष्ठभूमि ऊपर detectable नहीं होगा, (2), फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर्याप्त पर पता लगाया जा उज्ज्वल होना चाहिए एकल अणु के स्तर और (फ्लोरोसेंट बनने के लिए) जल्दी इच्छित आवेदन के लिए पर्याप्त परिपक्व चाहिए (वीनस सबसे तेजी से परिपक्व 7 तारीख फ्लोरोसेंट प्रोटीन है), (3), फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने के बाद photobleached किया जाना चाहिए तो कि नए फ्लोरोसेंट प्रोटीन हो सकता है डेtected बाद समय अंक (फ्लोरोसेंट प्रोटीन कि पीढ़ी photobleaching के लिए प्रतिरोधी हैं लेजर अत्यधिक जोखिम के रूप में अवांछनीय हैं phototoxicity कलाकृतियों को पैदा कर सकता है) पर, (4), protease मान्यता अनुक्रम किसी भी अवशिष्ट अमीनो एसिड ब्याज की प्रोटीन पर नहीं छोड़ के कि अपनी कार्यक्षमता उपद्रव जाएगा कर सकते हैं (carboxy टर्मिनल यूबी अवशेषों के बाद तुरंत Ubp1 cleaves, सब पर कोई अतिरिक्त अवशेषों को छोड़कर).
दूसरा, एक की पुष्टि करनी होगी कि रिपोर्टर ठीक से व्यक्त किया जाता है और cleaved. Proteolytic दरार ब्याज की प्रोटीन से अलग संवाददाता कुशल होना चाहिए, दरार दक्षता रिपोर्टर के खिलाफ पश्चिमी blots का उपयोग कर, ब्याज की प्रोटीन या दोनों जीएल (एंटीबॉडी वाणिज्यिक विरोधी GFP एंटीबॉडी के रूप में कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए उपलब्ध हैं मापा जा सकता है ) 8 Clontech, जो पश्चिमी धब्बा में वीनस बांधता से. एक सुनिश्चित करना चाहिए कि कोई uncleaved संलयन प्रोटीन blots में कोशिकाओं की lysates संलयन व्यक्त के खिलाफ पाया हैप्रोटीन प्रत्याशित CoTrAC प्रयोगों में उन लोगों की तुलना में उच्च स्तर पर. इसके अलावा, रिपोर्टर और ब्याज की प्रोटीन दरार के बाद एक 1:1 के अनुपात में उत्पादन किया जाना चाहिए. यह विरोधी पत्रकार और विरोधी प्रोटीन के ब्याज पश्चिमी protease कमी उपभेदों में uncleaved बैंड की तीव्रता से normalized blots में cleaved बैंड की तीव्रता को मापने के द्वारा जाँच की जा सकती है. यदि रिपोर्टर और ब्याज की प्रोटीन दरार के बाद एक 1:1 अनुपात में मौजूद हैं, तो:
ध्यान दें कि पश्चिमी blots उपाय प्रोटीन एकाग्रता के बाद से, जिसके परिणामस्वरूप अनुपात 1:1 से विचलित अगर रिपोर्टर और ब्याज की प्रोटीन दरार गिरावट के बाद अलग दरों का प्रदर्शन होगा.
तीसरा, एक की पुष्टि करनी चाहिए कि ब्याज की प्रोटीन दरार के बाद इसकी उम्मीद कार्यक्षमता को दर्शाती है. बड़े रिपोर्टर की उपस्थिति और संलयन या कोशिका झिल्ली को स्थानीयकरण का निर्माण / सबसे प्रतिलेखन कारकों निष्क्रिय की उम्मीद है (λ repressor सीआई सह थाहमारे 1 प्रयोगों) में Ubp1 अभिव्यक्ति के बिना mpletely निष्क्रिय है. Protease व्यक्त प्लाज्मिड के परिवर्तन भारी translational संलयन टैग से मुक्ति प्रोटीन द्वारा ब्याज की प्रोटीन को सक्रिय करना चाहिए. इस घटना अन्य संभावित CoTrAC अनुप्रयोगों को जन्म देता है. Ubp1 द्वारा यूबी carboxy टर्मिनस पर दरार गैर विहित एमिनो टर्मिनल अमीनो एसिड का पर्दाफाश करने के लिए प्रोटीन 9 गिरावट के बैक्टीरिया नियम एन अंत को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यदि एक बड़े, संवाददाता झिल्ली जुड़े संलयन एक प्रतिलेखन कारक (या एक एंजाइम के रूप में अन्य प्रोटीन) inactivates, अपनी गतिविधि जल्दी से उत्प्रेरण protease अभिव्यक्ति द्वारा बरामद किया जा सकता है. बहुत तेजी से हटाने / एक अवरोध / सह उत्प्रेरक जोड़ने या अन्यथा protease अभिव्यक्ति या गतिविधि की शुरुआत प्रतिलेखन कारकों में से एक preexisting पूल "पर बारी" CoTrAC इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्त में, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति सेल फिजियोलॉजी उपद्रव और यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए है कि हो सकता है कि सेल के रूप में इस तरह के गुणरेफरी में वर्णित प्रयोग में, समय चक्र अप्रभावित रहे हैं. 1, हम एक झिल्ली स्थानीयकरण अनुक्रम TSR प्रोटीन के रूप में इस्तेमाल किया है क्योंकि TSR पहले से ही एक अत्यधिक व्यक्त झिल्ली प्रोटीन और TSR अभिव्यक्ति में एक छोटे से वृद्धि सेल व्यवहार को प्रभावित करने की उम्मीद नहीं है.
चौथा, जब एक पत्रकार विशेष रूप से चर्चा की TSR वीनस - यूबी के अलावा अन्य अनुक्रम में प्रयोग किया जाता है, इसी इमेजिंग प्रोटोकॉल के रूप में भी जरूरत संशोधित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन अलग रोशनी प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक लेजर जोखिम से फ्लोरोसेंट प्रोटीन अणु, phototoxicity का पता लगाने और photobleaching के बीच अच्छा संतुलन हासिल करने की आवश्यकता होगी. आदर्श रूप में, लेजर उत्तेजना चुना फ्लोरोसेंट प्रोटीन के absorbance चरम पर होना चाहिए, ऑफ पीक उत्तेजना उच्च उत्तेजना तीव्रता (और इस प्रकार उच्च phototoxicity और autofluorescence पृष्ठभूमि) ही फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्सर्जन और photobleaching विशेषताओं को प्राप्त करने की आवश्यकता है. इसके अलावा,इमेजिंग आवृत्ति धीमी या कोशिकाओं के जोखिम के लेजर phototoxicity सहिष्णुता के आधार पर 5 मिनट की तुलना में तेजी से हो करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. हमारे प्रयोगों में, 12 अलग ई. कोली कालोनियों हर 5 मिनट imaged थे और पर्याप्त phototoxicity दोष 1 देख से पहले 7-8 सेल चक्र के लिए पीछा किया.
अंत में, प्रोटीन के उत्पादन के समय चूक फिल्मों के बाद एक CoTrAC प्रयोग (उदाहरण आंकड़े 4 और 5 में दिखाया गया है) में अधिग्रहण कर रहे हैं, फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट एक या अधिक अणुओं को इसी स्पॉट का पता लगाने, व्यक्तिगत कोशिकाओं के अणुओं बताए और मात्रा निर्धारित किया जा चाहिए सेल प्रजातियों ट्रैकिंग. हम λ repressor सीआई 1 उत्पादन का अध्ययन करने के लिए एक कस्टम Matlab दिनचर्या का वर्णन किया है. संक्षेप में, एक 1 व्यक्ति की कोशिकाओं और समय अंक brightfield छवियों में कोशिका विभाजन के लिए इसी की रूपरेखा की पहचान जबकि बाद में छवि को फ्रेम के माध्यम से सेल प्रजातियों ट्रैकिंगहै. हमने पाया है कि एक 5 मिनट का समय अंतराल पर्याप्त कम है कि एक फ्रेम में एक सेल आमतौर पर पिछले फ्रेम के साथ जो यह एक खंडों छवि में सबसे पिक्सल साझा में सेल करने के लिए corresponded था. ऐसे मामलों में जहां कालोनियों के बाद दो तख्तों के बीच कभी कभी बड़ी परिवर्तन मनाया गया, उनकी प्रजातियों के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं के मैनुअल काम के लिए आवश्यक था. अगले, एक फ्लोरोसेंट स्थानों की पहचान करने और उनकी तीव्रता यों की जरूरत है. हमने पाया है कि फ्लोरोसेंट धब्बे (1) bandpass प्रतिदीप्ति छवि को छानने के लिए कम आवृत्ति प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि निकाल (जैसे autofluorescence) और उच्च आवृत्ति शोर, (2) प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर छवि थ्रेशोल्डिंग और (3) वस्तुओं की पहचान करके पहचाना जा सकता है thresholded छवि में कुछ पिक्सल से भी बड़ा है. thresholded छवि में वस्तुओं एक 2 आयामी गाऊसी समारोह प्लस एक निरंतर पृष्ठभूमि फिट किया गया है, और इस स्थान का एकीकृत तीव्रता फिट आयाम और विचरण के उत्पाद के रूप में लिया गया था.हमारे प्रयोगों में, कई TSR - वीनस - यूबी संवाददाताओं अक्सर सेल ध्रुवों पर सह स्थानीय स्पॉट है कि एकल TSR वीनस अणुओं से उन लोगों की तुलना में उज्जवल थे बनाने. एक जगह के भीतर वीनस अणुओं की संख्या एक एकल वीनस अणु प्रतिदीप्ति तीव्रता, जो एक कम अभिव्यक्ति के स्तर तनाव जो स्थानों में शायद ही कभी एक से अधिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते हैं का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया गया था द्वारा इस स्थान का एकीकृत तीव्रता विभाजित करके मात्रा निर्धारित किया गया था अणु. यह माप एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन अणुओं की एक गिलास स्लाइड पालन इन विट्रो माप में आगे साथ पूरक हो सकता है. हमने पाया है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन के गुणों में vivo में और समान बफर शर्तों के साथ इन विट्रो प्रणालियों में काफी हद तक ऐसा ही कर रहे हैं.
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Disclosures
हम कोई खुलासे है.
Acknowledgments
प्लाज्मिड Ubp1 pCG001 व्यक्त कृपया मेडिकल रिसर्च के जॉन कर्टिन स्कूल में रोहन बेकर द्वारा प्रदान किया गया था. यह काम मार्च ऑफ डाइम्स अनुसंधान एक FY2011 अनुदान के, ऑफ डाइम्स तुलसी O'Connor स्टार्टर विद्वान अनुसंधान पुरस्कार # 5 - FY20 और NSF कैरियर +०७४६७९६ पुरस्कार के मार्च के द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
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- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
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- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
