Summary
Nous décrivons une méthode microscopie à fluorescence, co-translationnelle activation par clivage (COTRAC), à l'image de la production de molécules de protéines dans des cellules vivantes avec une seule molécule de précision sans perturber la fonctionnalité de la protéine. Cette méthode a été utilisée pour suivre la dynamique d'expression stochastique d'un facteur de transcription, le λ répresseur CI
Abstract
Nous décrivons une méthode microscopie à fluorescence, co-translationnelle activation par clivage (COTRAC) à l'image de la production de molécules de protéines dans des cellules vivantes avec une seule molécule de précision sans perturber la fonctionnalité de la protéine. Cette méthode permet de compter le nombre de molécules de protéines produites dans une cellule pendant séquentielles, des fenêtres de temps de cinq minutes. Il nécessite un microscope à fluorescence avec la densité de puissance laser d'excitation d'environ 0,5 à 1 kW / cm 2, ce qui est suffisamment sensible pour détecter des molécules simples protéine fluorescente dans les cellules vivantes. Le rapporteur fluorescent utilisé dans cette méthode se compose de trois parties: une séquence ciblage membranaire, une maturation rapide, protéine fluorescente jaune et une séquence de reconnaissance de protéase. Le rapporteur est fusionnée de manière traductionnelle à l'extrémité N-terminale d'une protéine d'intérêt. Les cellules sont cultivées sur une platine de microscope à température contrôlée. Toutes les cinq minutes, des molécules fluorescentes dans les cellules sont imagés (et plus tard coopérationUnted en analysant les images de fluorescence), puis photobleached de sorte que seules protéines nouvellement traduits sont comptés dans la mesure suivante.
Images de fluorescence résultant de cette méthode peut être analysée par la détection des taches fluorescentes dans chaque image, en les affectant à des cellules individuelles, puis affecter les cellules de lignées cellulaires. Le nombre de protéines produites à l'intérieur d'une fenêtre temporelle dans une cellule donnée est calculé en divisant l'intensité intégrée de taches de fluorescence par l'intensité moyenne des molécules fluorescentes simples. Nous avons utilisé cette méthode pour mesurer les niveaux d'expression de l'ordre de 0-45 molécules simples 5 fenêtres de temps min. Cette méthode nous a permis de mesurer le bruit dans l'expression de l'IC λ répresseur, et a de nombreuses autres applications potentielles en biologie des systèmes.
Protocol
1. Souche Ingénierie flux de travail
- Insérer séquences codant pour (a) une séquence de localisation membranaire, (b) une protéine de maturation rapide fluorescent et (c) une séquence de reconnaissance de protéase N-terminale à et en phase avec une protéine d'intérêt (par exemple un facteur de transcription). Nous avons utilisé la membrane cible Tsr-Vénus reporter 2 et fusionnée à la séquence de reconnaissance de protéase ubiquitine (Ub) pour compter le nombre de bactériophage λ exprimées répresseur CI molécules de protéines. Détails sur la façon dont nous avons construit la protéine de fusion Tsr-Vénus-Ub-CI, en remplaçant le type sauvage CI région codante et en intégrant la construction dans la E. chromosome coli en utilisant λ Rouge recombinaison 3, sont décrits en détail dans la référence. 1.
- Vérifiez toutes les modifications par séquençage.
- Transformer un plasmide codant pour une protéase spécifique de la séquence de reconnaissance utilisé ci-dessus dans une souche exprimant la protéine rapporteur fluorescent et d'intérêten fusion traductionnelle. Nous avons utilisé la protéase Ubp1, qui clive immédiatement après le résidu C-terminal de l'ubiquitine 4.
2. Les cellules de la Culture et préparer l'échantillon
- Choisissez un E. coli colonie d'intérêt à partir d'une plaque de gélose fraîchement striée en 1 ml médias M9 minimum 5 complété avec des acides aminés et MEM 1X antibiotiques appropriés. Incuber dans un shaker à la température désirée assez long pour atteindre OD 600> 1,0 (densité optique à 600 nm).
- Diluer la culture dans 1 ml de milieu M9 frais avec des antibiotiques appropriés à DO600 = 0,02. Incuber dans un shaker à la température appropriée. Densité cellulaire initiale peut être augmentée si nécessaire à la croissance à basse température.
- Lorsque la DO 600 = 0,2 à 0,3 (à 37 ° C avec une culture cellulaire initiale à DO600 = 0,02, cela prendra 3-4 heures), commencer à préparer le gel d'agarose tampon (étape 3).
- Les cellules sont prêtes pour l'imagerie lorsque OD
- Transférer 1 ml de culture incubé dans un tube de 1,5 ml, centrifuger à 10.000 xg pendant 1 min dans une centrifugeuse de paillasse.
- Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de milieu frais M9 et remettre en suspension le culot doucement.
- Centrifuger à 10000 g pendant 1 min.
- Répétez l'étape 1,6 et 1,7. Jeter le surnageant.
- Resuspendre doucement dans 1 ml de milieu M9. Les cellules peuvent être directement utilisés pour l'imagerie microscope ou 10 diluée - à 100 fois pour garantir de faibles densités cellulaires pour l'imagerie timelapse. Notez que de faibles densités cellulaires sont importantes pour l'imagerie timelapse prolongée. La chambre de formation d'image (étape 4) est rendue étanche lors de l'expérience. En raison de la croissance exponentielle des cellules, les concentrations cellulaires initiales élevées peuvent sensiblement épuiser l'oxygène à l'intérieur de la chambre de croissance après prolongée dans le tampon de gel, ce qui réduit la maturation des protéines fluorescentes et affecter la croissance des cellules.
3. Préparer la solution d'agarose
- Peser 10-20 mgà faible température de fusion d'agarose dans un tube de 1,5 ml.
- Ajouter le volume de milieu minimal M9 sans antibiotiques pour faire une solution à 3% d'agarose.
- Chauffer la solution d'agarose pendant 30 min à 70 ° C pour faire fondre, retournant le tube pour que la solution soit complètement fondu et homogène. Le tampon de gel peut être versé à ce moment (étape 4) ou de la température peut être réduite à 50 ° C et maintenu pendant plusieurs heures pour une utilisation ultérieure.
4. Préparer Pad Gel sur la chambre
- Environ 50 min avant l'imagerie, rincer une diapositive Microaqueduct avec de l'eau.
- Rincé une nettoyés couvercle en verre (en utilisant une méthode de nettoyage strictes telles que celle décrite dans 6) et Microaqueduct diaporama avec de l'eau stérile et sécher par soufflage à l'air comprimé.
- Placer le joint d'étanchéité en caoutchouc sur la lame Microaqueduct de manière à recouvrir les orifices d'entrée et de sortie sur le côté de la lame de verre Microaqueduct (ceci peut être modifié pour des applications dansles supports qui sont perfusés à travers l'échantillon). Appliquer 50 ul de solution d'agarose (étape 3) au centre de la diapositive Microaqueduct.
- Haut de la solution d'agarose avec le nettoyage, couvercle en verre sec.
- Laissez la solution d'agarose reposer à température ambiante pendant 30 min.
- Pendant ce temps, préparer un échantillon de cellules (étape 2).
- Soigneusement détacher la vitre de protection de la partie supérieure du tampon de gel. Ajouter 1,0 ul de culture cellulaire lavée vers le haut de la poche de gel. Attendre ~ 2 min pour la culture d'être absorbée par le tampon de gel. Il est important de ne pas attendre aussi longtemps que les overdries coussin de gel, mais suffisamment longue pour que les cellules sont correctement respectées le coussin de gel. Le temps d'attente Idéal varie selon la température et de l'humidité.
- En attendant, une autre sécher couvercle en verre préalablement nettoyé.
- Couverture de l'échantillon avec la nouvelle vitre de protection en sorte que le verre de protection et Microaqueduct coulisseau sont bien alignés.
- Assemblez la chambre de croissance à température contrôlée suivant les instructions du fabricant.Il peut maintenant être utilisé pour l'imagerie de microscope (étape 5).
5. Imagerie et acquisition de films Timelapse
- Allumez le laser et du microscope en suivant les instructions du fabricant (par exemple, le laser peut être nécessaire de réchauffer pour ~ 0,5 h avant l'expérience).
- Verrouiller la chambre assemblé à l'insert de phase sur le microscope. Régler la température de la chambre de croissance et le chauffe-objectif à 37 ° C ou autre température de croissance souhaitée.
- Si l'imagerie dessus de la température ambiante, la mise au point ou coussin de gel est généralement dériver de façon significative pour ~ 15 min après le changement de température initiale. Dans la pratique, utiliser ce temps pour trouver des régions d'intérêt et modifier des scripts d'imagerie que nécessaire pour une expérience.
- Trouver des cellules sur le microscope et stocker la position de chaque cellule après son centrage à l'intérieur d'une région d'imagerie prédéfinie et alignés. Plus d'une cellule peut être imagé dans chaque fenêtre de temps d'acquisition d'image. Pour plus timelapse imagerie mdes générations, en sorte que les cellules de représentation sont initialement séparés à partir d'autres cellules par au moins quelques centaines de micromètres de telle sorte que les autres colonies n'entrera pas dans la région de formation d'image en cours de croissance.
- Réglez l'intensité d'excitation laser de sorte que la quasi-totalité des molécules fluorescentes photoblanchiment dans les 6 expositions (figure 5).
- Utilisation d'un script automatisé d'imagerie / journal, l'acquisition de données timelapse en utilisant l'algorithme décrit dans le flux de travail expérimental sur la figure 3.
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Representative Results
Des résultats typiques d'une expérience COTRAC le suivi de la production de l'IC λ répresseur sont présentés dans les figures 4 et 5. Dans cette expérience, 12 colonies ont été imagées à intervalles de 5 min. A chaque point dans le temps, la colonie a d'abord été autofocused et centralisé au sein de la zone d'exposition. Ensuite, la position centrée / ciblée a été enregistré et une image de fond clair a été acquise. L'étape est ensuite transporté par ~ 0,5 um long de l'axe z pour déplacer le champ clair de plan focal par rapport au plan bissecteur des cellules (sans contraste de phase ou contraste interférentiel différentiel (DIC) optique, semi-transparents les objets peuvent être visualisés à peu out-of-focus avions 8). Enfin, six images ont été acquises à des intervalles de 1 s, chacune avec une exposition de 100 ms (figure 5 montre un point ce moment). Cela a été répété pour toutes les cellules à chaque point dans le temps. Parce que presque toutes les molécules sont Vénus photobleached à chaque heure, la fluorescencetaches cent dans les figures 4 et 5 correspondent à des molécules Venus à échéance (devenu fluorescent) dans le passé 5 min. Venus molécules mûrir rapidement in vivo avec une demi-vie d'environ 2-7 min 1, 2, 7 et clivage par Ubp1 est très efficace 4, 9. Par conséquent, le nombre de molécules de protéines produites depuis la dernière mesure peut être déduit de précision le nombre de molécules Venus compter sur la membrane.
Figure 1. Utilisation COTRAC compter l'expression de molécules simples facteurs de transcription. (1) Un journaliste de la TSR, y compris la séquence membrane-localisation, la maturation rapide YFP Vénus, et l'ubiquitine (Ub) est exprimée en fusion traductionnelle avec un facteur de transcription à partir d'une la promotioner régulée par le facteur de transcription. (2) La protéase co-traductionnelle Ubp1 clive le polypeptide naissant après le résidu C-terminal Ub. (3) Le journaliste Tsr-Vénus-Ub se localise dans la membrane où il peut être compté à la seule molécule niveau. (4) Le facteur de transcription peut réguler sa propre expression. Méthode de dessin animé.
Figure 2. Les cellules schématiques de chambre à échantillon utilisés dans des expériences COTRAC. Sont placés entre gel d'agarose pad et couvercle en verre. Microaqueduct coulisseau et l'objectif sont maintenus à une température fixe en utilisant un contrôleur électronique. La préparation des échantillons.
Figure 3. Flux de travail d'une expérience typique COTRAC. Experiflux de travail mental.
Figure 4. Timelapse données typiques d'une expérience COTRAC. Images d'une seule colonie sont présentés à intervalles de 25 min. Dans cette expérience, les données ont été acquises toutes les 5 minutes à partir de 12 colonies différentes. (A) images fond clair. (B) Vénus (YFP) image de fluorescence (fond moyenne soustraite pour tenir compte des changements dans le contexte de Imagerie ensemble au fil du temps). (C ) image Overlay montre la localisation des pôles molécules rapporteurs Tsr-Vénus-Ub et de l'hétérogénéité dans le nombre de molécules produites en 5 min fenêtres de temps dans différentes cellules (image en fond clair est inversé et l'image de Vénus est filtré passe-bande). Cliquez havant pour agrandir la figure.
Figure 5. Les données typiques d'un point seule fois dans une expérience COTRAC. (A) Venus (YFP) des images de fluorescence. Six expositions 100 msec ont été acquis au début de chaque intervalle de 5 min. Chacune des 6 expositions a été séparé par 900 msec pour laisser le temps molécules Venus transitoire sombres qui avait clignotaient au loin pour devenir fluorescente. (B) Pour l'analyse, image 6 est soustraite de l'image 1 pour corriger les molécules écrues et de fond d'autofluorescence. Spots dans cette image sont localisées dans des lignées cellulaires spécifiques et quantifiés par leur intensité de fluorescence intégré. (C) La fluorescence moyenne intégrée de la colonie de A est tracée plus de 6 images (siligne couvercle). Mise en place cette ligne à une décroissance exponentielle en plus un décalage constant (ligne pointillée) donne une décroissance à mi-temps de 1 sec. Dans cette expérience, Vénus molécules photoblanchiment beaucoup plus rapidement que l'autofluorescence cellulaire, alors cela signifie que près de la moitié du nombre total de molécules Vénus sont photobleached dans chaque trame. Photoblanchiment des progrès à un moment unique.
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Discussion
La méthode COTRAC peuvent être généralisés à mesurer la production d'autres protéines où N-ou C-terminaux conventionnels fusions de protéines fluorescentes peuvent perturber l'activité des protéines. La stratégie COTRAC a trois avantages uniques par rapport aux méthodes actuelles. Tout d'abord, co-traductionnelle de fusion assure une molécule de rapporteur fluorescent est le produit pour chaque molécule de la protéine d'intérêt, ce qui permet un comptage précis de la production de protéines en temps réel. Deuxièmement, le journaliste membrane ciblée Tsr-Vénus permet de détecter une seule molécule de rapporteurs fluorescents, permettant la détection des protéines exprimées à des niveaux très faibles. Troisièmement et surtout, le clivage co-traductionnelle de la reporter fluorescent permet à la protéine d'intérêt à conserver son quasi-séquence de type sauvage et de la fonction normalement en utilisant l'ubiquitine protéase comme une séquence de reconnaissance dans E. coli, des protéines cibles ne diffèrent que par leurs séquences peptidiques de type sauvage en ce que la première borne de N-N </ Em>-formyl-méthionine est changé en méthionine.
Lorsque vous utilisez la méthode COTRAC, il est important de garder à l'esprit que la méthode COTRAC mesure le nombre de molécules de protéines produites à chaque fenêtre de temps de 5 minutes, ce qui est distincte de la mesure du nombre de molécules de protéines présentes par cellule (ie la la concentration en protéines). Plus simple expression cellulaire de fluorescence gène dosages mesure la concentration en protéine, ce qui est le résultat de la production de protéines équilibré et à la dégradation. Par conséquent, le taux de dégradation de la protéine d'intérêt doivent être examinés attentivement si la mesure de concentration est utilisé pour en déduire des informations de production de protéines. En outre, la concentration en protéines est sujet à des fluctuations causées par le partitionnement de la protéine entre les deux cellules filles lors de la division cellulaire, ce qui peut être important pour les bas-niveau de l'expression des protéines et interprété à tort comme résultant de la dynamique de production de protéines. La méthode peut être modi COTRACFied pour mesurer la concentration de protéines en ne photoblanchiment molécules rapporteurs nouvellement produites, mais cela doit être fait avec contrôle supplémentaire. Il faut vérifier que les taux de dégradation du rapporteur fluorescent et la protéine d'intérêt sont les mêmes, et qu'ils sont tous deux pareillement divisée en deux cellules filles lors de la division cellulaire, de sorte que la concentration du rapporteur fluorescent reflète celle de la protéine d'intérêt.
Nous notons que l'COTRAC ne modifie pas la séquence protéique, l'ajout du gène rapporteur modifie la séquence d'ARNm. Par conséquent, la transcription et la dynamique de traduction et / ou les taux d'ARNm de la dégradation de transcription peut être perturbé. Si la méthode COTRAC est utilisé pour observer la production de protéines dans le contexte de type sauvage, il est important de comparer les niveaux d'expression de la protéine cible à la fois dans sa séquence sauvage et avec le tag COTRAC fusion fluorescente (par exemple dans la réf. 1, nous avons comparé CI expression dans notre COTRAC constructiont à ce que dans un lysogène de type sauvage). Ci-dessous, nous discutons des considérations nécessaires pour généraliser la méthode COTRAC.
Tout d'abord, nous discutons de la possibilité d'utiliser d'autres séquences de Tsr-Vénus-Ub. Les exigences générales sont les suivantes: (1) le journaliste doit être localisé dans une certaine position au sein de la cellule afin qu'elle ne diffuse pas rapidement (Tsr, les journalistes sont les pôles 1 cellule). Ceci est nécessaire pour une seule molécule de détection d'une molécule de protéine fluorescente en tant que signal à partir d'une molécule de protéine fluorescente rapidement diffusante ne sera généralement pas détectable au-dessus de fond autofluorescente d'une cellule, (2), la protéine fluorescente doit être suffisamment intense pour être détecté sur la une seule molécule niveau et doit mûrir (devenu fluorescent) assez rapidement pour l'application souhaitée (Vénus est la protéine la plus rapide maturation fluorescente à ce jour 7), (3), la protéine fluorescente doit être photobleached après la détection de sorte que les protéines nouvellement fluorescents peuvent être deprotégés à des moments ultérieurs (protéines fluorescentes qui sont trop résistants au photoblanchiment sont indésirables car l'exposition au laser excessive peut causer des artefacts phototoxicité), (4), la séquence de reconnaissance de protéase ne peut pas laisser de résidus acides aminés de la protéine d'intérêt qui perturbent son fonctionnement (Ubp1 s'attache immédiatement après le résidu carboxy-terminal Ub, ne laissant pas de résidus supplémentaires à tous).
Deuxièmement, il faut vérifier que le journaliste est correctement exprimé et clivé. Le clivage protéolytique séparant le rapporteur de la protéine d'intérêt doit être efficace, l'efficacité de clivage peut être mesurée à l'aide Western blot contre le journaliste, la protéine d'intérêt ou les deux (anticorps sont disponibles dans le commerce pour de nombreuses protéines fluorescentes telles que l'anticorps anti-GFP JL- 8 de Clontech, qui lie Vénus en Western blot). Il faut veiller à ce qu'aucune protéine de fusion non clivée est détecté dans des transferts à l'encontre des lysats de cellules exprimant la fusionprotéines à des niveaux supérieurs à ceux prévus dans ces expériences COTRAC. En outre, le journaliste et la protéine d'intérêt doit être produite dans un rapport 1:1 après clivage. Ceci peut être vérifié en mesurant les intensités des bandes fendues dans rapporteur et anti-anti-protéine d'intérêts Western blots sont normalisées par les intensités des bandes non clivés dans des souches dépourvues de protéase. Si rapporteur et les protéines d'intérêt sont présentes dans un rapport de 1:1 après coupure, puis:
Notez que puisque la concentration des taches de protéines Western mesure, le rapport résultant sera légèrement différent de 1:1 si le journaliste et la protéine d'intérêt présentent les taux de dégradation différents après clivage.
Troisièmement, il convient de vérifier que la protéine d'intérêt présente sa fonctionnalité attendue après clivage. La présence du rapporteur grande construire fusion et / ou la localisation de la membrane cellulaire devrait inactiver la plupart des facteurs de transcription (le λ répresseur CI a été completely inactive sans Ubp1 expression dans nos expériences 1). Transformation du plasmide exprimant la protéase doit activer la protéine d'intérêt par la libération de la protéine à partir de la balise de fusion traductionnelle volumineux. Ce phénomène donne lieu à d'autres applications possibles COTRAC. La coupure au niveau de l'extrémité carboxy par Ub Ubp1 a été utilisé pour exposer non canoniques amino-terminales des acides aminés d'élucider l'extrémité N-bactérienne état de dégradation de la protéine 9. Si la fusion à une grande associée à la membrane inactive reporter un facteur de transcription (ou autre protéine telle qu'une enzyme), son activité peut être rapidement récupéré par la protéase induisant l'expression. COTRAC pourrait être utilisé très rapidement à "allumer" un groupe préexistant de facteurs de transcription en enlevant / addition d'un inhibiteur / co-activateur ou initiant l'expression ou l'activité de protéase. Enfin, l'expression du rapporteur fluorescent peut perturber la physiologie cellulaire et il convient de s'assurer que les propriétés telles que la celluletemps de cycle ne sont pas affectés; dans l'expérience décrite dans la réf. 1, nous avons utilisé la protéine Tsr comme une séquence membrane-localisation, car Tsr est déjà une protéine membranaire fortement exprimés et une légère augmentation de l'expression Tsr ne devrait pas influer sur le comportement des cellules.
Quatrièmement, quand une séquence rapporteur autre que l'objet de discussions spécifiques Tsr-Vénus-Ub est utilisé, le protocole d'imagerie correspondant doit également être modifié au besoin. Par exemple, différentes protéines fluorescentes exigent des protocoles d'éclairage différentes pour atteindre un bon équilibre entre efficacité de détecter des molécules de protéines fluorescentes, la phototoxicité de l'exposition au laser et photoblanchiment. Idéalement, une excitation laser devrait être au pic d'absorbance de la protéine fluorescente choisie; hors pic d'excitation nécessite des intensités d'excitation plus élevés (et donc supérieur phototoxicité et de fond d'autofluorescence) pour réaliser l'émission même protéine fluorescente et les caractéristiques de photoblanchiment. En outre, lefréquence d'imagerie peut être modifiée pour être plus lente ou plus rapide que 5 min en fonction de la tolérance des cellules de la phototoxicité d'exposition au laser. Dans nos expériences, 12 séparé E. colonies coli ont été imagées toutes les 5 min et ensuite pendant 7-8 cycles cellulaires avant d'observer les défauts de phototoxicité importantes 1.
Enfin, après time-lapse films de la production de protéines sont acquis une expérience COTRAC (exemples le montrent les figures 4 et 5), l'expression de la protéine fluorescente doit être quantifiée par la détection de taches fluorescentes correspondant à une ou plusieurs molécules, en assignant des molécules aux cellules individuelles et suivi lignées cellulaires. Nous avons décrit une routine personnalisée Matlab pour étudier la production de λ répresseur CI 1. En bref, il faut d'abord identifier les contours des cellules individuelles et des points de temps correspondant à la division cellulaire dans les images en fond clair, tout en suivant des lignées cellulaires à travers le cadre image suivantes. Nous avons constaté qu'un intervalle de 5 min de temps est suffisamment courte qu'une cellule dans une trame correspond généralement à la cellule de la trame précédente avec laquelle elle partage le plus de pixels dans une image segmentée. Dans les cas où l'occasion des changements importants de colonies entre deux trames suivantes ont été observées, assignation manuelle des cellules individuelles à leurs lignées était nécessaire. Ensuite, on a besoin d'identifier et de quantifier les taches fluorescentes leur intensité. Nous avons constaté que des taches fluorescentes peuvent être identifiés par (1) filtrage passe-bande l'image de fluorescence pour éliminer la fluorescence de fond basse fréquence (par exemple autofluorescence) et le bruit haute fréquence, (2) seuillage de l'image en fonction de l'intensité de fluorescence et (3) l'identification des objets plus grand que quelques pixels dans l'image seuillée. Les objets de l'image seuillée étaient aptes à une fonction gaussienne 2-dimensionnelle plus un fond constante, et l'intensité intégrée de la tache a été prise comme étant le produit de l'amplitude et de la variance en forme.Dans nos expériences, plusieurs Tsr-Vénus-Ub journalistes souvent co-localisés aux pôles cellulaires, créant des taches qui étaient plus brillantes que celles de simples Tsr-Venus molécules. Le nombre de molécules Venus sein d'un spot a été quantifiée en divisant l'intensité intégrée de la tache par l'intensité de la fluorescence d'une molécule unique Vénus, qui a été quantifiée en utilisant un faible niveau d'expression souche dans laquelle des taches contiennent rarement plus d'une protéine fluorescente molécule. Cette mesure peut être complétée avec des mesures in vitro de simples molécules de protéines fluorescentes adhérant à une lame de verre. Nous avons constaté que les propriétés des protéines fluorescentes sont largement similaires in vivo et in vitro dans des systèmes avec des conditions de tampon similaires.
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Disclosures
Nous n'avons pas d'autres informations.
Acknowledgments
Le plasmide exprimant pCG001 Ubp1 a été aimablement fourni par Rohan Baker à l'École de gestion John Curtin de la recherche médicale. Ce travail a été financé par Mars des dix sous de subvention de recherche de 1 exercice 2011, Mars of Dimes Basil O'Connor Starter Award de bourses de recherche n ° 5-FY20 et d'attribution de la NSF CAREER 0746796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
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