我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化(CoTrAC)タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。この方法によれば、シーケンシャル、5分の時間枠で、1セル内に産生されるタンパク質分子の数を数えるようになります。それは、生きた細胞内の単一の蛍光タンパク質分子を検出するために十分に敏感である〜0.5から1キロワット/ cm 2のレーザー励起パワー密度を持つ蛍光顕微鏡を必要とします。膜標的化配列、高速熟成、黄色蛍光蛋白質とプロテアーゼ認識配列:このメソッドで使用される蛍光レポーターが3つの部分から成ります。記者が翻訳目的のタンパク質のN末端に融合されています。細胞は、温度制御された顕微鏡ステージ上に成長させられる。 5分おきに、細胞内の蛍光分子(およびそれ以降の共同撮像される蛍光画像を分析することによってunted)、続いて、新しく翻訳されたタンパク質は、次の測定にカウントされるようにphotobleached。
Can be difficult to source; also available from Bioptechs
Cover glass/slide gasket
Bioptechs
FCS2 0.75 mm
Fluorescence Microscope
Various
Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software
Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins
EM-CCD Camera
Various
Example setup: Andor Ixon DU-898
Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background
Hensel, Z., Fang, X., Xiao, J. Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC). J. Vis. Exp. (73), e50042, doi:10.3791/50042 (2013).