Мы описываем метод флуоресцентной микроскопии, Co-трансляционной активации путем расщепления (CoTrAC), чтобы изображение производстве белковых молекул в живых клетках с одной молекулой точности без возмущающей функции белка. Этот метод был использован следовать стохастической динамики экспрессии фактора транскрипции, λ-репрессор CI<sup> 1</sup>.
Мы описываем метод флуоресцентной микроскопии, Co-трансляционной активации путем расщепления (CoTrAC), чтобы изображение производстве белковых молекул в живых клетках с одной молекулой точности без возмущающей функции белка. Этот метод позволяет подсчитать количество молекул белка производится в одной ячейке в течение последовательного, пять минут времени Windows. Это требует флуоресцентного микроскопа с лазерным возбуждением плотности мощности ~ 0,5 до 1 кВт / см 2, что является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить одну флуоресцентных молекул белков в живых клетках. Флуоресцентные репортера, используемые в этом методе состоит из трех частей: мембранной ориентации последовательности, быстро созревания, желтый флуоресцентный белок и последовательность протеазы признание. Репортер трансляционно слитый с N-конца белка. Клетки, выращенные на контролируемой температурой столик микроскопа. Каждые пять минут, флуоресцентных молекул внутри клеток загружаются (а затем и сотрудничествоunted путем анализа флуоресцентных изображений), а затем photobleached так, что только недавно переведенных белков учитываются в следующее измерение.
Флуоресценция изображения в результате этого метода могут быть проанализированы путем обнаружения флуоресцентных мест в каждом изображении, назначая их на отдельные клетки, а затем присвоение клетки к клетке линий. Количество белков, продуцируемых в течение временного окна в данной ячейке рассчитывается путем деления интегрированной интенсивности флуоресценции пятен на среднюю интенсивность одного флуоресцентных молекул. Мы использовали этот метод для измерения уровня экспрессии в диапазоне 0-45 молекул в одном 5 окон мин времени. Этот метод позволил нам измерить шум в выражении λ-репрессор CI, и имеет много других потенциальных приложений в системной биологии.
Метод CoTrAC может быть обобщен для измерения производства других белков, где обычные N-или С-концевых флуоресцентного белка слияния могут привести к нарушению активности белка. Стратегия CoTrAC имеет три уникальных преимуществ по сравнению с существующими методами. Во-первых, со-поступате?…
The authors have nothing to disclose.
Плазмиды pCG001 выражения Ubp1 была любезно предоставлена Rohan Baker на Джон Кертин Школа медицинских исследований. Эта работа финансировалась по март Dimes грант 1-2011 финансового года, марте Dimes Василия О'Коннор Автор научный сотрудник Award # 5-FY20 и NSF КАРЬЕРА награду 0746796.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
Milli-Q H2O | |||
5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
20% glucose | |||
MgSO4 | |||
CaCl2 | |||
50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |