Se describe un método de microscopía de fluorescencia, co-translacional de activación por escisión (COTRAC), a la imagen de la producción de moléculas de proteína en células vivas con precisión una sola molécula sin perturbar la funcionalidad de la proteína. Este método se ha utilizado para seguir la dinámica de expresión estocásticos de un factor de transcripción, el λ represor CI<sup> 1</sup>.
Se describe un método de microscopía de fluorescencia, co-translacional de activación por escisión (COTRAC) a la imagen de la producción de moléculas de proteína en células vivas con precisión una sola molécula sin perturbar la funcionalidad de la proteína. Este método hace posible contar el número de moléculas de proteína producida en una célula durante las ventanas secuenciales, el tiempo de cinco minutos. Se requiere un microscopio de fluorescencia con una densidad de potencia del láser de excitación de ~ 0,5 a 1 kW / cm 2, que es suficientemente sensible para detectar moléculas individuales de proteínas fluorescentes en células vivas. El reportero fluorescente usada en este método se compone de tres partes: una secuencia de dirección de membrana, una maduración rápida, proteína fluorescente amarilla y una secuencia de reconocimiento de proteasa. El reportero está fusionado traduccionalmente al extremo N-terminal de una proteína de interés. Las células se cultivan en una platina de microscopio de temperatura controlada. Cada cinco minutos, moléculas fluorescentes dentro de las células se crean imágenes (y más tarde coUnted mediante el análisis de imágenes de fluorescencia) y posteriormente photobleached modo que las proteínas recién traducido sólo se cuentan en la siguiente medición.
Imágenes de fluorescencia resultante de este método se puede analizar mediante la detección de manchas fluorescentes en cada imagen, asignándolos a las células individuales y luego asignar células a linajes celulares. El número de proteínas producidas dentro de una ventana de tiempo en una célula dada se calcula dividiendo la intensidad integrada de fluorescencia de las manchas por la intensidad media de las moléculas fluorescentes individuales. Se utilizó este método para medir los niveles de expresión en el intervalo de 0-45 moléculas individuales en 5 min ventanas de tiempo. Este método nos permitió medir el ruido en la expresión del represor CI λ, y tiene otras muchas aplicaciones potenciales en la biología de sistemas.
El método COTRAC puede ser generalizado para medir la producción de otras proteínas en la que N-o C-terminales convencionales fusiones de proteínas fluorescentes pueden perturbar la actividad de proteína. La estrategia COTRAC tiene tres ventajas únicas sobre los métodos actuales. En primer lugar, co-traduccional de fusión asegura que una molécula del indicador fluorescente es producida por cada molécula de la proteína de interés, lo que permite un recuento preciso de la producción de proteínas en tiempo re…
The authors have nothing to disclose.
El plásmido que expresa pCG001 UBP1 fue proporcionado amablemente por Rohan Baker en la Escuela John Curtin de Investigación Médica. Este trabajo fue financiado por March of Dimes Beca de Investigación 1-el año fiscal 2011, March of Dimes Premio Basil O'Connor Starter Académico de Investigación # 5-FY20 y adjudicación NSF CARRERA 0.746.796.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
Milli-Q H2O | |||
5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
20% glucose | |||
MgSO4 | |||
CaCl2 | |||
50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |