Summary
Vi beskriver en fluorescensmikroskopi metod, Co-translationell aktivering genom klyvning (CoTrAC), att avbilda produktionen av proteinmolekyler i levande celler med en enda molekyl precision utan att störa proteinets funktionalitet. Denna metod har använts för att följa de stokastiska expressions dynamiken i en transkriptionsfaktor, den λ repressorn CI
Abstract
Vi beskriver en fluorescensmikroskopi metod, Co-translationell aktivering genom klyvning (CoTrAC) att avbilda produktionen av proteinmolekyler i levande celler med en enda molekyl precision utan att störa proteinets funktionalitet. Denna metod gör det möjligt att räkna antalet proteinmolekyler som produceras i en cell under sekventiella, fem minuters tidsfönster. Det kräver ett fluorescensmikroskop med laserexcitation effekttäthet ~ 0,5 till 1 kW / cm 2, vilket är tillräckligt känslig för att detektera enstaka fluorescerande proteinmolekyler i levande celler. Den fluorescerande reporter användes i denna metod består av tre delar: ett membran målsekvens, en snabbt mognande, gult fluorescerande protein och ett proteas-igenkänningssekvens. Reportern är translationellt fuserad till N-terminalen av ett protein av intresse. Celler odlas på en temperaturstyrd mikroskop scenen. Var femte minut, är fluorescerande molekyler i celler avbildas (och senare counted genom att analysera fluorescens bilder) och därefter photobleached så att endast nya översatta proteiner räknas i nästa mätning.
Fluorescensbilder följd av denna metod kan analyseras genom att detektera fluorescerande fläckar i varje bild, tilldela dem till enskilda celler och därefter tilldela celler till cellinjer. Antalet proteiner producerade inom ett tidsfönster i en given cell beräknas genom att dividera den integrerade fluorescensintensiteten av fläckar med den genomsnittliga intensiteten av enstaka fluorescerande molekyler. Vi använde denna metod för att mäta uttrycksnivåer i intervallet 0-45 molekyler i enstaka 5 fönster min tid. Denna metod gjorde det möjligt att mäta buller i uttryck av λ repressorn CI, och har många andra potentiella tillämpningar i systembiologi.
Protocol
1. Stam Engineering arbetsflöde
- Infoga sekvenser som kodar (a) en membran-lokaliseringssekvens, (b) en snabbt mognande fluorescerande protein och (c) ett proteas igenkänningssekvens N-terminalt till och i ram med ett protein av intresse (t.ex. en transkriptionsfaktor). Vi använde membranet riktade TSR-Venus reporter 2 och fuserades den till proteas igenkänningssekvensen Ubiquitin (Ub) för att räkna antalet uttryckta bakteriofag λ repressormolekyler CI proteinmolekyler. Detaljer om hur vi konstruerade fusionsproteinet TSR-Venus-Ub-CI, som ersätter vildtyp CI kodande regionen och införliva konstruktionen i E. coli-kromosomen med λ röd rekombination 3, beskrivs i detalj i ref. 1.
- Kontrollera att alla ändringar genom sekvensering.
- Transformera en plasmid som kodar ett proteas som är specifik för igenkänningssekvensen används ovan till en stam som uttrycker det fluorescerande reporter och proteinet av intressei translationell fusion. Vi använde proteaset Ubp1, som klyver omedelbart efter den C-terminala resten Ubiquitin 4.
2. Kultur Celler och förbereda prov
- Välj en E. E. coli koloni av intresse från en nyligen strimmiga agarplatta i 1 ml M9 minimalt medium 5 kompletterat med 1x MEM aminosyror och lämpliga antibiotika. Inkubera i en skakapparat vid önskad temperatur tillräckligt länge för att nå OD 600> 1,0 (optisk densitet vid 600 nm).
- Späd kulturen i 1 ml färskt M9-medium med lämpliga antibiotika till OD 600 = 0,02. Inkubera i en skakapparat vid lämplig temperatur. Initial cellulär densitet kan ökas vid behov för låg temperatur tillväxt.
- När OD 600 = 0,2 till 0,3 (vid 37 ° C med en initial cellkultur vid OD 600 = 0,02, kommer detta att ta 3-4 timmar), börja förbereda agarosgelen pad (steg 3).
- Cellerna är redo för avbildning när OD
- Överför 1 ml inkuberad kultur till en 1,5 ml mikrocentrifugrör, centrifugera vid 10.000 xg i 1 min i en bänk mikrocentrifug.
- Kasta bort supernatanten och tillsätt 1 ml färskt M9-medium och återsuspendera pelleten försiktigt.
- Centrifugera vid 10.000 x g under 1 min.
- Upprepa steg 1,6 och 1,7. Kasta bort supernatanten.
- Försiktigt återsuspendera i 1 ml M9-media. Celler kan användas direkt för mikroskop avbildning eller utspätt 10 - till 100-faldigt för att säkerställa låga celldensiteter för timelapse avbildning. Observera att låga celldensiteter är viktiga för utökad timelapse avbildning. Det bildgivande kammaren (steg 4) är tätad under experimentet. På grund av exponentiell tillväxt av celler, kan höga initiala cellkoncentrationer bryter avsevärt syre i kammaren efter långvarig tillväxt i gelplattan, minskar fluorescerande protein mognad och påverkar celltillväxt.
3. Förbered agaroslösningen
- Väg 10-20 mglågsmältande-temperatur agaros i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Lägg lämplig volym M9 minimalmedium utan antibiotika för att göra en 3%-ig lösning.
- Värm agaroslösningen under 30 min vid 70 ° C för att smälta, invertering av röret för att säkerställa att lösningen är fullständigt smält och homogen. Den gelplattan kan hällas vid denna punkt (steg 4) eller temperaturen kan minskas till 50 ° C och hölls under flera timmar för senare användning.
4. Förbered Gel Pad på kammaren
- Cirka 50 minuter före avbildning, skölj en Microaqueduct bild med vatten.
- Skölj en rengjorda täckglas (med användning av en sträng rengöring metod såsom den som beskrivs i 6) och Microaqueduct objektglaset med sterilt vatten och torka genom att blåsa med komprimerad luft.
- Placera gummipackningen på Microaqueduct bilden så att den täcker inlopp och utlopp på glaset sida Microaqueduct bilden (detta kan ändras för tillämpningar inomsom media perfusion genom provet). Applicera 50 | il agaroslösning (steg 3) till mitten av den Microaqueduct sliden.
- Toppa agaroslösningen med rengjorda, torra täckglas.
- Låt agaroslösningen stå vid rumstemperatur under 30 minuter.
- Samtidigt förbereder ett cellprov (steg 2).
- Dra försiktigt bort täckglaset från toppen av gelplattan. Tillsätt 1,0 pl tvättade cellkultur till toppen av gelén dynan. Vänta på ~ 2 min för kulturen skall absorberas av gelplattan. Det är viktigt att inte vänta så länge att gelplattan overdries, men tillräckligt länge att celler ordentligt följs gel pad. Den perfekta väntetiden varierar med temperatur och luftfuktighet.
- Medan du väntar, torka annan förrenade täckglas.
- Täck provet med nya täckglaset säkerställer att locket glas och Microaqueduct glider väl i linje.
- Montera temperatur kontrollerad tillväxt kammare enligt tillverkarens instruktioner.Man kan nu användas för avbildning på mikroskop (steg 5).
5. Imaging och Förvärv av Timelapse filmer
- Slå på lasern och mikroskop enligt tillverkarens instruktioner (t.ex. lasern kan behöva värmas upp för ~ 0,5 timmar före experimentet).
- Lås den monterade kammaren till scenen insatsen på mikroskopet. Ställ in temperaturen på tillväxten kammaren och målet värmaren vid 37 ° C eller annan önskad tillväxt temperatur.
- Om avbildning över rumstemperatur, kommer fokus eller gel pad driver vanligtvis avsevärt för ~ 15 min efter den initiala temperaturen skift. I praktiken använda denna tid för att hitta områden av intresse och ändra avbildning skript som behövs för ett experiment.
- Hitta celler på mikroskopet och lagra positionen för varje cell efter centrera den inom en fördefinierad och inriktade avbildning regionen. Mer än en cell kan avbildas i varje bild förvärv tidsfönster. För timelapse avbildning över malla generationer, att avbildade cellerna initialt separeras från andra celler med minst ett par hundra um så att andra kolonier inte kommer in bildenheten regionen under tillväxt.
- Justera intensitet laser excitation så att nästan alla fluorescerande molekyler photobleach inom 6 exponeringar (Figur 5).
- Använda en automatiserad bildbehandling manus / tidskrift, skaffa timelapse data med algoritmen som beskrivs i den experimentella arbetsflödet i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiska resultat från en CoTrAC försök spåra produktionen av λ repressorn Cl visas i figurerna 4 och 5. I detta experiment, var 12 kolonier avbildas vid 5 min intervaller. Vid varje tidpunkt, var kolonin 1:e autofocused och centraliseras inom bildbehandling regionen. Därefter var centrerade / fokuserad läge lagras och en brightfield bild förvärvades. Scenen därefter translokeras genom ~ 0,5 um längs z-axeln för att röra sig från brightfield fokalplanet till planet skär cellerna (utan fas-kontrast eller differentiell interferens kontrast (DIC) optik, kan halvtransparenta objekt skall avbildas med något utanför fokus plan 8). Slutligen sex bilder förvärvades 1 sek intervall, var och en med en 100 ms exponering (Figur 5 visar en sådan tidpunkt). Detta upprepades för alla celler vid varje tidpunkt. Eftersom nästan alla Venus molekyler photobleached vid varje tidpunkt, de fluorescerandecent fläckar i figurerna 4 och 5 motsvarar Venus molekyler som mognade (blev fluorescerande) inom de senaste 5 min. Venus molekyler mogna snabbt in vivo med en halveringstid av ~ 2-7 min 1, 2, 7 och klyvning av Ubp1 är mycket effektiv 4, 9. Därför kan antalet proteinmolekyler producerade sedan den senaste mätningen noggrant härledas från antalet Venus molekyler räknade på membranet.
Figur 1. Använda CoTrAC att räkna uttrycket av enstaka molekyler transkriptionsfaktor. (1) En reporter innefattande membran-lokaliseringssekvens TSR, den snabbt mognande YFP Venus, och Ubiquitin (Ub) uttrycks i translationell fusion med en transkriptionsfaktor från en främER regleras av transkriptionsfaktor. (2) Den proteas Ubp1 co-translationellt klyver den begynnande polypeptiden efter den C-terminala Ub resten. (3) I TSR-Venus-Ub reporter lokaliserar till membranet där det kan räknas på den enda -molekyl nivå. (4) Den transkriptionsfaktorn kan reglera sitt eget uttryck. Metod tecknad.
Figur 2. Schematiska av provkammare som används i CoTrAC experiment. Celler placeras mellan agarosgel dyna och täckglas. Microaqueduct objektglaset och mål hålls vid en fast temperatur med hjälp av en elektronisk styrenhet. Provberedning.
Figur 3. Arbetsflöde på en typisk CoTrAC experiment. Experimentala arbetsflöde.
Figur 4. Typiska Timelapse data från en CoTrAC experiment. Från en enda koloni Bilder visas vid 25 minuters intervall. I detta experiment data som erhållits var 5 min från 12 olika kolonier. (A) brightfield bilder. (B) Venus (YFP) fluorescens bild (genomsnittlig bakgrund subtraheras ta hänsyn till förändringar i bakgrunden av hela bildfältet över tid). (C ) Overlay bild visar pol lokalisering av TSR-Venus-UB reportermolekyler och ojämnhet i antalet molekyler som produceras i 5 fönster min tid i olika celler (brightfield bild är inverterad och Venus bilden är bandpassfiltreras). Klicka here för större bild.
Figur 5. Typiska data från en enda tidpunkt i ett CoTrAC experiment. (A) Venus (YFP) fluorescens bilder. Sex 100 msek exponeringar förvärvades i början av varje 5 minuter tidsintervall. Var och en av de 6 exponeringarna separerades med 900 msek för att ge tid för tillfälligt mörka Venus molekyler som hade blinkade bort för att bli fluorescerande. (B) för analys, är bild 6 subtraheras från bild 1 för att korrigera för oblekta molekyler och autofluorescens bakgrund. Fläckar i bilden är lokaliserade till specifika cellinjer och kvantifieras av deras integrerade fluorescensintensiteten. (C) Den genomsnittliga integrerade fluorescens av kolonin i A ritas över 6 bilder (sålock linje). Montering denna linje till en exponentiell avklingning plus en konstant offset (streckad linje) ger en avklingning halvtid av 1 sek. I detta experiment, Venus molekyler photobleach mycket snabbare än cellulär autofluorescens, så innebär detta att ungefär hälften av det totala antalet Venus molekyler photobleached i varje ram. Fotoblekning framsteg på en enda tidpunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den CoTrAC metoden kan generaliseras för att mäta produktionen av andra proteiner där konventionella N-eller C-terminala fusioner fluorescerande protein kan störa proteinaktivitet. Den CoTrAC Strategin har tre unika fördelar jämfört med dagens metoder. Först säkerställer sam-translationella fusion som en molekyl av den fluorescerande reporter framställs för varje molekyl av proteinet av intresse, vilket möjliggör noggrann räkning av proteinproduktion i realtid. För det andra membran-riktade reportern TSR-Venus möjliggör enda molekyl upptäckt av fluorescerande reportrar, möjliggör detektion av proteiner som uttrycks på mycket låga nivåer. Tredje och viktigast, tillåter samtidig translationella klyvning av fluorescerande reporter proteinet av intresse att behålla sin nära-vildtypssekvens och fungera normalt som använder Ubiquitin som en proteas-igenkänningssekvens i E. E. coli, målproteiner skiljer sig endast från sina vild-typ peptidsekvenser av att den första N-terminala N </ Em>-formyl-metionin ändras till metionin.
Vid användning av CoTrAC metoden är det viktigt att hålla i minnet att CoTrAC metoden mäter antalet protein producerade molekyler vid varje 5-min tidsfönster, som är skild från mätningen av antalet proteinmolekyler närvarande per cell (dvs. proteinkoncentration). Mest encelliga fluorescens genexpression analyser mäter proteinkoncentrationen, som är balanserat resultat av protein produktion och nedbrytning. Därför måste nedbrytningshastigheten av proteinet av intresse övervägas noga om koncentrationen mätningen används för att dra slutsatser om informationen proteinproduktion. Dessutom är proteinkoncentration föremål för fluktuationer orsakade av uppdelning av proteinet mellan två dotterceller vid celldelning, vilket kan ha betydelse för låg-uttryck nivå proteiner och felaktigt tolkas som härrör från dynamik protein produktion. Den CoTrAC metoden kan vara modifieradeerad för att mäta proteinkoncentration genom att inte fotoblekning nyproducerade reportermolekyler, men detta måste göras med extra kontroll. Man måste kontrollera att nedbrytningshastigheten för den fluorescerande reporter och proteinet av intresse är liknande, och att de båda liknande uppdelad i två dotterceller vid celldelning, så att koncentrationen av den fluorescerande reporter reflekterar den hos proteinet av intresse.
Vi noterar att medan CoTrAC inte ändrar proteinsekvensen, förändrar tillsatsen av reportergenen mRNA-sekvensen. Därför transkription och dynamik översättning och / eller mRNA-transkript priser nedbrytningsprodukter kan störas. Om CoTrAC metoden används för att observera proteinproduktionen i vildtyp sammanhang är det viktigt att jämföra uttryck nivåer av målproteinet såväl i sin vildtypssekvens och med CoTrAC fluorescerande fusion tag (t.ex. i ref. 1 jämförde vi CI uttryck i vår CoTrAC byggt till att i en vild-typ-lysogen). Nedan diskuterar vi hänsyn som krävs för att generalisera den CoTrAC metoden.
Först diskuterar vi möjligheten att använda andra sekvenser än TSR-Venus-Ub. De allmänna kraven är: (1) reportern måste vara lokaliserad till en viss position inom cellen så att den inte diffus snabbt (med TSR, reportrar är på cellen polerna 1). Detta är nödvändigt för enda molekyl detektering av ett fluorescerande protein molekyl som signalen från ett snabbt diffundera fluorescerande proteinmolekyl vanligtvis inte kommer att vara detekterbar över en cells autofluorescerande bakgrund, (2), måste det fluorescerande proteinet vara tillräckligt ljusstark för att detekteras på enda molekyl nivå och mogna (bli fluorescerande) tillräckligt snabbt för önskat program (Venus är den snabbast mognar fluorescerande protein hittills 7), (3), måste fluorescerande proteinet photobleached efter detektering, så att nya fluorescerande proteiner kan vara dekänt av vid efterföljande tidpunkter (fluorescerande proteiner som är alltför motståndskraftiga mot fotoblekning är oönskade eftersom överdriven laserexponering kan orsaka fototoxicitet artefakter), (4), kan proteaset igenkänningssekvensen inte lämna några rester aminosyror på proteinet av intresse som kommer att störa dess funktionalitet (Ubp1 klyver omedelbart efter den karboxiterminala Ub rest, lämnar inga extra rester alls).
Det andra, måste man kontrollera att reportern ordentligt uttrycks och klyvs. Proteolytisk klyvning skiljer reporter från proteinet av intresse måste vara effektiv, klyvning effektivitet kan mätas med Western blotting mot reportern, proteinet av intresse eller båda (antikroppar är kommersiellt tillgängliga för många fluorescerande proteiner såsom anti-GFP-antikropp JL- 8 från Clontech, som binder Venus i Western blot). Man bör se till att inga ospaltade fusionsproteinet detekteras i blottar mot lysat av celler som uttrycker fusionenprotein vid högre nivåer än de som förväntas i CoTrAC experiment. Dessutom måste reportern och proteinet av intresse produceras i förhållandet 1:1 efter klyvning. Detta kan kontrolleras genom att mäta intensiteterna hos de kluvna banden i anti-reporter och anti-protein av intresse Western blottar normaliserade av intensiteterna hos de ej kluvna banden i stammar som saknar proteas. Om reporter och proteinet av intresse är närvarande i förhållandet 1:1 efter klyvning, sedan:
Observera att eftersom Western blöts åtgärd proteinkoncentration, kommer den resulterande kvoten avviker från 1:1 om reportern och proteinet av intresse uppvisar olika nedbrytningshastigheter efter klyvning.
Det tredje bör man kontrollera att proteinet av intresse uppvisar sin förväntade funktionalitet efter klyvning. Närvaron av den stora reporterkonstruktion fusion och / eller lokalisering till cellmembranet förväntas inaktivera flesta transkriptionsfaktorer (den λ repressorn CI var completely inaktiva utan Ubp1 uttryck i våra experiment 1). Transformation av proteas-uttryckande plasmiden bör aktivera proteinet av intresse genom att frigöra proteinet från den skrymmande translationell fusion tag. Detta fenomen ger upphov till andra möjliga CoTrAC applikationer. Klyvning vid Ub karboxiterminalen av Ubp1 har använts för att exponera icke-kanoniska aminoterminala aminosyrorna att belysa den bakteriella N-ändregeln av proteinnedbrytning 9. Om fusion till en stor, membran-associerad reporter inaktiverar en transkriptionsfaktor (eller annat protein, såsom ett enzym), kan dess aktivitet snabbt återvinnas genom att inducera uttryck proteas. CoTrAC kan användas för att snabbt "slå på" en redan existerande grupp av transkriptionsfaktorer genom att ta bort / lägga till en hämmare / co-aktivator eller på annat sätt initiera proteas uttryck eller aktivitet. Slutligen kan uttrycket av den fluorescerande reporter störa cellfysiologi och det bör säkerställas att egenskaper såsom cellcykeltid är opåverkade, i försöket som beskrivs i ref. 1, använde vi TSR protein som en membran-lokalisering sekvens eftersom TSR är redan en mycket uttryckta membranprotein och en liten ökning i TSR uttryck inte förväntas påverka cellens beteende.
Det fjärde, när en reporter sekvens annan än den specifikt diskuterade TSR-Venus-Ub används, bör den motsvarande bildprotokoll också modifieras efter behov. Till exempel, kommer olika fluorescerande proteiner kräver olika belysning protokoll för att uppnå en bra balans mellan effektivt detektera fluorescerande proteinmolekyler, fototoxicitet från laserexponering och fotoblekning. Helst bör laserexcitation vara på absorbans topp den valda fluorescerande proteinet, lågtrafik excitation kräver högre excitations intensiteter (och därmed högre fototoxicitet och autofluorescens bakgrund) för att uppnå samma fluorescerande proteinet utsläpp och fotoblekning egenskaper. Dessutom, denavbildning frekvens kan modifieras att vara långsammare eller snabbare än 5 min beroende på toleransen hos cellerna till fototoxicitet av laserexponering. I våra experiment, 12 separata E. coli kolonier avbildas var 5 min och följdes under 7-8 cellcykler innan observera betydande fototoxicitet fel 1.
Slutligen efter time-lapse filmer av proteinproduktion förvärvats i ett CoTrAC experiment (exempel visas i figurerna 4 och 5), behöver fluorescerande protein uttryck som ska kvantifieras genom att detektera fluorescerande fläckarna motsvarande en eller flera molekyler, tilldela molekyler till individuella celler och spårning cellinjer. Vi har beskrivit en anpassad Matlab rutin att studera λ repressor CI produktion 1. Kortfattat måste en först identifiera konturerna av enskilda celler och pekar tid som motsvarar celldelning i ljusfält bilder samtidigt spåra cellinjer genom efterföljande bildrams.. Vi fann att en 5 min tidsintervall var tillräckligt kort att en cell i en ram vanligtvis motsvarade cellen i den tidigare ramen som det delade mest pixlar i en segmenterad bild. I de fall där enstaka stora förskjutningar av kolonier mellan två efterföljande ramar observerades, var manuell tilldelning av enskilda celler till sina härstamningar krävs. Därefter måste man identifiera fluorescerande fläckar och kvantifiera deras intensitet. Vi fann att fluorescerande fläckar kunde identifieras genom (1) bandpassfiltrering av fluorescens bilden för att avlägsna lågfrekvent fluorescens bakgrund (t.ex. autofluorescens) och högfrekvent brus, (2) tröskling av bilden baserat på fluorescensintensitet och (3) identifiera föremål större än några pixlar i tröskeljämförd bilden. Objekten i bilden tröskeljämförd anpassades till en 2-dimensionell Gaussisk funktion plus en konstant bakgrund och den integrerade intensiteten av fläcken togs som produkten av passformen amplitud och varians.I våra experiment, ofta flera TSR-Venus-UB reportrar samlokaliserade i cell poler, skapa fläckar som var ljusare än de från enskilda TSR-Venus-molekyler. Antalet Venus molekyler inom en fläck kvantifierades genom att dividera den integrerade intensiteten för fläcken av fluorescensintensiteten hos en enda Venus molekyl, som kvantifierades med användning av en låg-uttryck-nivå stam i vilken fläckar sällan innehåller mer än en fluorescerande protein molekyl. Denna mätning kan ytterligare kompletteras med in vitro mätningar av enstaka fluorescerande proteinmolekyler vidhäftade till en glasskiva. Vi har funnit att fluorescerande protein egenskaper är i stort sett lika i in vivo-och in vitro-system med liknande buffertbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inga upplysningar.
Acknowledgments
Plasmiden pCG001 uttrycker Ubp1 tillhandahölls vänligen av Rohan Baker på John Curtin School of Medical Research. Detta arbete har finansierats av March of Dimes forskningsbidrag 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 och NSF KARRIÄR utmärkelse 0.746.796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
