2 광자 현미경 높은 해상도 intavital을 활용하는 기술을 직접 시각화 및 표면 사구체에서 gloemrular 여과를 정량화한다. 이 방법은 정상과 질병 상태 모두에서 거대 분자의 투과 특성을 직접 측정 할 수 있습니다.
Abstract
같은 혈청 알부민, 긴 침투성 족으로 구성된 장벽, 혈관 내피 세포, 그리고 한마음으로 작업 기저막의 변화에 의한 것으로 생각되어 같은 대형 필수 고분자의 소변 손실을 포함하는 신장 질환. intravital 2 광자 현미경을 사용하여 우리 연구소의 데이터는 근위 세뇨관 세포 (PTC)는 1,2 불리는 세포의 초기 집합에서 발생하는 필터링 알부민 검색과 이전에 생리 학적 조건에서 생각했던 것보다 더 투과성 사구체 여과 장벽 (GFB)를, 밝혀 3.
이전 기술은 신장 여과를 연구하는 데 사용 유체 콘텐츠 및 분석 4 샘플링이 초기 관 세그먼트의 루멘의 micropuncture을 포함 여과 장벽의 특성을 설정. 해당 밀접하게, 이러한 연구는 거의 존재하지 않는 것으로 내강 액에 알부민 농도를 결정일반적으로 소변에서 검출되는 것과. 그러나,이 기술에 의해 정의 된 크기의 덱스 트란 폴리머의 특성은 혈청 알부민과 비슷한 크기의 사람들을 밝혀 관 루멘과 소변에서 높은 수준을했다; 증가 투자율 5 제안.
여기에 직접 시각화하고 생체 내에서 사구체 형광 알부민 투과성을 계량하는 데 사용되는 기술에 대한 자세한 개요입니다. 이 방법은 보먼의 공간 (소변 여과의 초기 챔버)로 여과 장벽을 통해 여과 된 알부민을 검출 할 수 있고, 또한 근위 세뇨관과 이후 알부민 transcytosis 6 시각화하여 알부민 재 흡수의 정량화 할 수 있습니다. 방광 도중에 이상 관 세그먼트에 따라 형광 알부민의 부재는 이전 근위 세뇨관 세그먼트에있는 검색 경로의 효율성을 강조 표시합니다. 또한,이 기술을 적용 할 때 투자율을 결정하기의 알부민 거의 동일 투자율 값으로 유사한 크기를 갖는 덱스 트란은 2보고되었다. 이러한 관찰은 직접 근위 세뇨관 세포 재생에 포함 된 변경에 많은 단백뇨 신장 질환의 초점을 확장 할 필요성을 지원합니다.
Protocol
1. 설포-로다 민 101 포닐 염화물 (텍사스 레드) 알부민 쥐 혈청의 활용 최종 농도 50 ML 원뿔 관에 15 밀리그램 / ML, 100 mM의 중조 산도 9.0의 쥐에서 (RSA) 혈청 알부민 6.667 ML 100 MG를 녹인다. 장소 얼음 / 물 비커의 용액으로 0에서 11 ° C. 사이에 멋진 15 초 동안 중간에 소용돌이, 텍사스 레드 포닐 염화물 (TRSC)의 10 mg을 유리 병에 고품질의 무수 디메틸 포름 아미드 (DMF) 200 μl를 추가…
Representative Results
그림 3은 뮌헨의 Wistar Frömter 쥐와 형광 알부민 투과성을 결정하기 위해 수행하는 단계의 표면 사구체에서 촬영 한 이미지의 예를 보여줍니다. 0.0111의 알부민 GSC 값은 뮌헨의 Wistar 쥐 때 공급 조건 3이 변형에서 볼 수있는 범위 내에서이 개별 사구체 가을을위한 것. 이 이미지에서 볼 수있는 안정성은 신중한 계획과 그림 1과 2에 묘사 된 명령어의 실행 때문이다. ?…
Discussion
여기에서 강조하는 단계는 우리가들은 다음과 같은 함정을 피할 수 있기 때문에 일관되고 정확한 투자율 값을 생성 할 것 느끼는 것을 나타냅니다 :
산란 : 긴 파장의 광자가 산란 적은 경향이 있기 때문에 적색 발광 형광체의 사용은 빛을보다 효율적으로 수집을 할 수 있습니다. 하나 녹색 또는 청색 발광 형광체를 사용하기 때문에 모세관 루프와 보먼의 공간 3에서 강도 값의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 정맥 액세스 라인의 위치를 포함하는 수술 절차를 완료 Drs에 실비아 B 캄포스 – Bilderback 조지 J 로즈에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한 시몬과 Frömter 균주 모두로 구성된 뮌헨의 Wistar 식민지를 유지하기 위해 사라 E 유아에게 감사의 말씀을 전합니다.
Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. J. Vis. Exp. (74), e50052, doi:10.3791/50052 (2013).