Real-time Live Imaging af T-celle signalering Complex Formation
Summary
Vi beskriver en live-cell imaging metode, der giver indsigt i protein dynamik under T-celleaktivering proces. Vi viser den kombinerede anvendelse af T-celle-spredning assay konfokal mikroskopi og billedbehandling analyse at give kvantitative resultater til følge signaleringskomplekser dannelse hele T-celle aktivering.
Abstract
Beskyttelse mod smitsomme sygdomme medieres af immunsystemet 1,2. T-lymfocytter er master koordinatorer af immunsystemet, regulere aktiveringen og reaktioner af multiple immunceller 3,4. T-celle-aktivering er afhængig af anerkendelse af specifikke antigener vises af antigenpræsenterende celler (APC'er). T-celle antigen (TCR) er specifik for hver T-celleklon og bestemmer antigenspecificitet 5.. Bindingen af TCR til antigenet inducerer phosphorylering af komponenter af TCR-komplekset. For at fremme T-celleaktivering, skal dette signal transduceret fra membranen til cytoplasmaet og kernen, indlede forskellige afgørende reaktioner såsom rekruttering af signalering proteiner til TCR, APC stedet (immun synapse), deres molekylære aktivering, cytoskelet omlejring, forhøjelse af intracellulær calciumkoncentration, og ændringer i genekspression 6,7. Den korrekte iitiation og opsigelse af aktiverende signaler er afgørende for passende T-celle responser. Aktiviteten af signalanlæg proteiner er afhængig af dannelsen og afslutning af protein-protein interaktioner, posttranslationelle modifikationer, såsom proteinphosphorylering, dannelse af protein-komplekser, protein ubiquitylering og rekruttering af proteiner til forskellige cellulære steder 8. Forståelse af de indre funktioner i T-celle aktivering processen er afgørende for både immunologiske forskning og kliniske anvendelser.
Forskellige assays er blevet udviklet med henblik på at undersøge protein-protein interaktioner, men gør biokemiske assays, såsom udbredte co-immunpræcipitering metoden, ikke tillade protein sted at være skelnes, hvilket udelukker observation af værdifuld indsigt i dynamikken af cellulær mekanismer. Derudover disse bulk-assays sædvanligvis kombinere proteiner fra mange forskellige celler, der kan være på forskellige stadier af than undersøgte cellulære proces. Dette kan have en skadelig virkning på tidsmæssig opløsning. Brugen af real-time scanning af levende celler tillader både den rumlige sporing af proteiner og evnen til timeligt skelne mellem signalanlæg begivenheder, og dermed kaste lys over dynamikken i processen 9,10. Vi præsenterer en fremgangsmåde til tidstro billeddannelse af signalering-kompleks formation under T-celleaktivering. Primære T-celler eller T-cellelinjer, såsom Jurkat, transficeres med plasmider, der koder for proteiner af interesse fusioneret til monomere fluorescerende proteiner, hindrer ikke-fysiologisk oligomerisering 11. Levende T-celler kastet over et dækglas præcoatet med T-celle-aktiverende antistof 8,9, som binder til CD3/TCR-komplekset, inducere T-celle-aktivering, mens overvinde behovet for specifikke aktiverende antigener. Aktiverede celler er konstant afbildet med anvendelse af konfokal mikroskopi. Imaging data analyseres for at give kvantitative resultater, såsom colocalization koefficient for de signalproteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Regulering og funktion af flere cellulære processer afhænger af dannelse og opsigelse af protein-protein interaktioner. Mikroskopisk billedbehandling giver real-time sporing af fluorescens mærkede proteiner i levende celler. Colokalisering af mærkede proteiner kan foreslå en direkte eller indirekte interaktion mellem proteinerne, og kan anvendes til at styrke konstateringer opnået ved biokemiske metoder, såsom immunopræcipitation. I modsætning biokemiske metoder, tillader live-cell imaging disse inter-protein-i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Sophia Fried til teknisk bistand. MBS takker følgende agenturer for deres forskning support: The Israel Science Foundation tilskud no.1659/08, 971/08, 1503-1508 og 491/10, ministerier for Health & Science om tilskud ikke. 3-4114 og 3-6540, Israel Cancer Association gennem Estate af den afdøde Alexander Smidoda og Taubenblatt Family Foundation for biomedicin excellence tilskud.
Materials
| Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygromycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame – Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 |
References
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. . Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
