Real-time Live Imaging av T-celle signalisering Complex Formation
Summary
Vi beskriver en live-cell imaging metode som gir innsikt i protein dynamikk i T-celle aktivering prosess. Vi viser den kombinerte bruk av T-celle spredning assay konfokal mikroskopi og bildeanalyse for å gi kvantitative resultater å følge signalering kompleksdannelse gjennom T-celle-aktivering.
Abstract
Beskyttelse mot smittsomme sykdommer er mediert av immunsystemet 1,2. T-lymfocytter er master koordinatorene for immunforsvaret, regulere aktivering og svar av flere immunceller 3,4. T-celle aktivering er avhengig av at gjenkjennelse av spesifikke antigener som vises av antigen-presenterende celler (APCer). Den T-celle antigen-reseptor (TCR) er spesifikk for hver T-celle-klon, og bestemmer antigenspesifisitet 5.. Bindingen av TCR til antigenet induserer fosforylering av komponentene i komplekset TCR. For å fremme T-celleaktivering, må dette signalet bli omformet fra membranen til cytoplasma og kjernen, initiere en rekke viktige reaksjoner som rekruttering av signaler proteiner til TCR; APC stedet (immun synapse), deres molekylære aktivering, cytoskeletal omorganisering, heving av intracellulær kalsium konsentrasjon, og endringer i genuttrykk 6,7. Riktig iitiation og opphør av aktivering av signalene er avgjørende for riktig T-celle responser. Aktiviteten av signaler proteiner er avhengig av dannelsen og opphør av protein-protein interaksjoner, poste translasjonelle modifikasjoner som protein-fosforylering, dannelse av proteinkomplekser, protein ubiquitylation og rekruttering av proteiner til forskjellige cellulært 8. Forstå det interne driften av T-celle aktivering prosessen er avgjørende for både immunologisk forskning og kliniske applikasjoner.
Ulike analyser har blitt utviklet for å undersøke protein-protein interaksjoner, men gjør biokjemiske analyser, slik som det mye brukte co-immunoutfelling metode, ikke tillate protein å plassering skjelnes, og dermed utelukker observasjon av verdifull innsikt i dynamikken i cellulære mekanismer. I tillegg er disse bulk analyser vanligvis kombinere proteiner fra mange forskjellige celler som kan være på ulike stadier av than undersøkte cellulær prosess. Dette kan ha en ødeleggende effekt på tidsmessig oppløsning. Bruken av sanntids avbildning av levende celler som tillater både romlig sporing av proteiner og evnen til å skille mellom timelig signaleringshendelser, og dermed belyse dynamikken i prosessen 9,10. Vi beskriver her en fremgangsmåte for sanntids avbildning av signalering-kompleksdannelse under T-celle-aktivering. Primære T-celler eller T-cellelinjer, slik som Jurkat, er transfektert med plasmider som koder for proteiner av interesse fusjonert til monomere fluorescerende proteiner, hindrer ufysiologisk oligomerisering 11.. Levende T-celler blir sluppet over et dekkglass forbelagt med T-celle-aktiverende antistoff 8,9, som binder seg til komplekset CD3/TCR, indusere T-celle-aktivering mens overvinne behovet for spesifikke antigener aktiveringsreagenser. Aktiverte celler er konstant avbildes ved bruk av konfokal mikroskopi. Imaging dataene blir analysert for å gi kvantitative resultater, slik som det colocalization koeffisient av de signaler proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reguleringen og funksjon av flere cellulære prosesser avhenger av dannelsen og opphør av protein-protein interaksjoner. Mikroskopisk bildebehandling gjør at sanntids sporing av fluorescently merket proteiner i levende celler. Colocalization av kodede proteiner kan foreslå en direkte eller indirekte interaksjon mellom proteiner, og kan brukes til å forsterke resultatene oppnådd ved biokjemiske metoder, slik som immunoutfelling. I motsetning biokjemiske metoder, gjør det mulig for levende celle avbildning disse int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Sophia Fried for teknisk assistanse. MBS takker følgende byråer for sin forskning support: The Israel Science Foundation for tilskudd no.1659/08, 971/08, 1503/08 og 491/10, departementene of Health & Science for tilskudd ingen. 3-4114 og 3-6540, Israel Cancer Association gjennom Estate til den avdøde Alexander Smidoda, og Taubenblatt Family Foundation for Bio-medisin excellence stipend.
Materials
| Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygromycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame – Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 |
References
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C. Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity. Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).
- Jager, D., Jager, E., Knuth, A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. The actin cytoskeleton in T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).
- Reicher, B., Barda-Saad, M. Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network. FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).
- Barda-Saad, M., et al. Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton. Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry A. 77, 733-742 (2010).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).
- Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity. J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).
- Wunderlich, L., Faragó, A., Downward, J., Buday, L. Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).
- Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization. Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).
- Barda-Saad, M., et al. Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization. EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).
- Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. . Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).
