Summary
Das am häufigsten verwendete Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von autologen dendritischen Zellen (DCs) zur Verwendung bei Tumor-Immuntherapie beschrieben. Das Verfahren nutzt IL-4 und GM-CSF zu DCs aus Monozyten differenzieren. Die unreifen DCs sind, um zu reifen und dann mit Antigenen beladen stimuliert, bevor sie zurück in den Patienten injiziert werden.
Abstract
Obwohl klinische Studien festgestellt haben, dass Antigen-beladenen DC Impfstoffe sicher und viel versprechende Therapie für Tumore 1 sind, bleibt ihre klinische Wirksamkeit festgelegt werden. Das nachfolgend beschriebene Verfahren, hergestellt gemäß Good Manufacturing-Verfahren (GMP)-Richtlinien, ist eine Optimierung der häufigste ex vivo Herstellungsverfahren zur Erzeugung einer großen Anzahl von DCs für klinische Studien 2.
Unsere Methode nutzt die synthetischen TLR-Agonisten Polyinosin 3-Polycytidylsäure-Poly-L-Lysin Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC), um die DCs zu stimulieren. Unsere früheren Studie festgestellt, dass Poly-ICLC die stärkste einzelne Reifung Stimulus für den menschlichen DCs ist, wie durch eine Hochregulation von CD83 und CD86, Induktion von Interleukin-12 (IL-12), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Interferon-gamma-induzierten beurteilt Protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) und Typ-I-Interferonen (IFN) und minimal Interleukin 10 (IL-10) Produktion. DCs sind aus gefrorenem peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von Leukapherese erhalten differenziert. PBMCs durch Ficollgradientenzentrifugation isoliert und in Aliquots eingefroren. Am Tag 1 werden PBMCs aufgetaut und überzogen auf Gewebekulturflaschen für Monozyten, die auf der Kunststoffoberfläche nach 1-2 h Inkubation bei 37 ° C in der Gewebekulturinkubator haften wählen. Nach der Inkubation werden die Lymphozyten durch Waschen entfernt und die anhaftenden Monozyten werden für 5 Tage in Gegenwart von Interleukin-4 (IL-4) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) zu unreifen DC differenzieren kultiviert. Am Tag 6 werden unreife DCs mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH)-Protein, das als eine Kontrolle für die Qualität der Impfstoff dient und die Immunogenität der Impfstoff 3 steigern gepulst. Die DCs stimuliert werden, um zu reifen, beladen mit Peptid-Antigene, und über Nacht inkubiert. Am 7. Tag wurden die Zellen gewaschen und in 1 ml eingefroren Aliquots, welche4 - 20 x 10 6 Zellen mit einer kontrollierten Rate Gefrierschrank. Lot Release-Tests für die Chargen von DCs durchgeführt und müssen Mindestanforderungen erfüllen, bevor sie in die Patienten injiziert werden.
Protocol
1. Isolation und Kryokonservierung von PBMCs 4
- Aseptisch Spike einer der Access-Ports in der Leukapherese Tasche mit einem Plasma-Transfer-Set. Mit einem 60-ml-Spritze, übertragen Sie die Leukapherese von Patienten in eine sterile 500 ml-Flasche erhältlich.
- Stellen Sie die Lautstärke des Leukapherese auf sein ursprüngliches Volumen mit Raumtemperatur RPMI 2x. Gründlich mischen.
- Vorsichtig mischen die Flasche Ficoll-Paque PLUS. In 12 ml Ficoll-Paque PLUS in sterile 50 ml konischen Röhrchen.
- Vorsichtig Schicht 30 ml des verdünnten Leukapherese Produkt zu jedem sterile 50 ml konischen Röhrchen mit Ficoll. Achten Sie darauf, die Schnittstelle zwischen dem Ficoll und Zellsuspension stören.
- Schritte 1.3 und 1.4 bis alle leukapheresis überlagert worden ist.
- Zentrifugieren Sie die 50 ml konischen Röhrchen bei 1.000 × g für 20 min bei Raumtemperatur ohne Bremse.
- Sorgfältig ernten die trübe Schicht von PBMCs aus jedem Röhrchen und transfer neue sterile 50 ml Röhrchen.
- In RPMI in jedes Röhrchen auf ein Endvolumen von 50 ml. Vorsichtig mischen durch Umdrehen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C mit Vollbremsung.
- Entfernen Sie die Überstände aus jeder Röhre. Resuspendieren der Zellpellets aus jedem Röhrchen und fügen RPMI auf ein Gesamtvolumen von 50 ml. Vorsichtig mischen durch Umdrehen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 6 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie die Überstände aus jeder Röhre. Resuspendieren und bündeln die Zellsuspensionen in einem 50 ml konischen Röhrchen.
- Bringen Sie die Lautstärke der gepoolten PBMCs bis zu 50 ml mit RPMI. Vorsichtig mischen durch Umdrehen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 6 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie den Überstand. Zellpellet in 50 ml RPMI. Vorsichtig mischen, um eine gleichmäßige Zellsuspension gewährleisten.
- Zählen Sie die Anzahl von Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Berechnen der Gesamtzahl lebensfähiger Zellen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300× g für 6 min bei 4 ° C. Bereiten Sie die gefrierenden Medien. Freezing Medien besteht aus 10% Dimethylsulfoxid (DMSO; Miltenyi Biotec) in humanem AB-Serum (Tal Biomedical).
- Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren der Zellen in einer Endkonzentration von 2 × 10 8 Zellen / ml in kaltem Einfriermedien.
- Als 1 ml Aliquots in 1,8 ml Kryoröhrchen.
- Übertragen Sie die Kryoröhrchen in den kontrollierten Rate Gefrierfach und beginnen das Einfrieren run, Programm 1. Am Ende des Laufs, übertragen Sie die eingefrorenen Kryoröhrchen sofort in die Gasphase des flüssigen Stickstoffs Gefrierschrank.
2. Tag 0: Differenzierung von dendritischen Zellen aus Monozyten
- 30 ml RPMI / 1% autologem Plasma in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen.
- Tau-Aliquots von gefrorenen PBMCs durch vorsichtiges Schütteln in 37 ° C warmes Wasserbad. Wenn vollständig aufgetaut und der Inhalt der Fläschchen in den sterilen 50 ml konischen Röhrchen. Gründlich mischen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen für 6 minbei 500 × g bei Raumtemperatur. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der pelletierten Zellen in einem kleinen Volumen RPMI / 1% autologes Plasma. Dann fügen Sie mehr RPMI / 1% autologem Plasma auf ein Gesamtvolumen von 50 ml. Gründlich mischen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen wieder für 6 min bei 500 × g bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand und das Pellet in 50 ml RPMI / 1% autologem Plasma. Gründlich mischen.
- Zählen Sie die Anzahl von Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Berechnen der Gesamtzahl lebensfähiger Zellen.
- Platte 1,40 x 10 8 Zellen in 40 ml RPMI / 1% autologem Plasma auf 225 cm 2 EasYFlask. Wiederholen, bis alle Zellen überzogen worden.
- Inkubieren der EasyFlasks flach auf die Seite für 1 - 2 Stunden bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO 2, um die Monozyten zu dem Kolben zu halten.
- Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die EasYFlask aus dem Inkubator und waschen zweimal zur Entfernung des nicht-haftenden Zellen using 30 ml vorgewärmtem RPMI.
- Nach dem zweiten Waschen, 40 ml RPMI / 1% autologem Plasma mit 400-1.000 IU / ml IL-4 und 100-1000 IU / ml GM-CSF 5-8. Aus diesem Protokoll werden wir mit 400 IU / ml IL-4 und 100 IU / ml GM-CSF.
- Inkubieren der EasyFlasks für 2 Tage bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO 2.
3. Tag 2: Fütterung von dendritischen Zellen mit IL-4 und GM-CSF
- 4 ml RPMI / 1% autologem Plasma mit 400-1.000 IU / ml IL-4 und 100-1000 IU / ml GM-CSF zu jedem EasYFlask. Mix durch Verwirbelung und rockt auf seiner Seite.
- Inkubieren Sie die EasyFlasks für 3 weitere Tage (bis Tag 5) bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO 2.
4. Tag 5: Ernten von unreifen dendritischen Zellen
- Ernten Sie die Kulturen durch kräftiges Schwenken der Kolben und durch Auf-und Abpipettieren nicht-haftend und lose anhaftenden Zellen resuspendieren. Übertragen Sie diegeernteten Zellen auf neue 50 ml konischen Röhrchen.
- Zentrifugieren bei 500 × g für 6 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Überstände und Zellpellet in 50 ml RPMI / 1% autologem Plasma. Gründlich mischen.
- Zählen Sie die Anzahl von Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Berechnen der Gesamtzahl lebensfähiger Zellen.
- Zentrifugieren bei 500 × g für 6 min bei Raumtemperatur. Platte 1-2 x 10 6 Zellen pro Vertiefung in 3 ml RPMI / 1% autologem Plasma mit 400 IU / ml IL-4 und 100 IU / ml GM-CSF in 6-Well-Gewebekulturplatten.
- Die Inkubation bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO 2 über Nacht.
5. Tag 6: Reifung und Antigen Laden von dendritischen Zellen
- In 10 ug / ml KLH bis 1/3 der Vertiefungen in den 6-well Kulturplatten. Swirl die Platten zu mischen. KLH wird nur 1/3 in die Vertiefungen gegeben, weil KLH ist nur für den ersten DC-Impfstoff verwendet. Nachfolgende DC Impfstoffe conTain nur die Tumor-Antigen-Peptide.
- DCs stimuliert, um zu reifen mit verschiedenen Stimuli werden. Die häufigsten Reifung Reize, die in klinischen Studien verwendet wurde, ist ein Cocktail von Zytokinen (IL-1 β, TNF und IL-6) und Prostaglandin E2 (PGE 2) 9,10. In jüngerer Zeit haben die Verwendung von Toll-like Rezeptor (TLR)-Agonisten Beliebtheit 11,12 gewonnen. In diesem Protokoll, fügen 2 mg / ml Polyinosin-Polycytidylsäure-Poly-L-Lysin Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) in die Vertiefungen und gut mischen. Poly-ICLC ist klinischem Formulierung von Poly-IC, die mit Poly-L-Lysin *-und Carboxymethylcellulose (hergestellt von Oncovir, Inc.) stabilisiert wird.
- In 100 ug / ml lange Peptid-Antigene (NY-ESO-1 und / oder Melan-A/MART-1) bezeichnet, um ihre Brunnen, jede Vertiefung, die nur eine einzelne Peptid an Cross-Wettbewerb 13 zu vermeiden.
- Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO <sub> 2 O / N.
6. Tag 7: Kryokonservierung von dendritischen Zellen
- Bereiten DC Freezing Lösung mit autologen Plasma und 10% DMSO. Zentrifugieren Sie die DC Freezing Lösung bei 2.000 × g für 20 min bei 4 ° C, um Partikel zu entfernen. Überstand in ein neues 15 ml beschriftet konischen Rohr. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Wenn die Inkubation über Nacht beendet ist, Ernte und Pool alle Brunnen, die DCs mit den Peptiden in 50 ml konische Röhrchen gepulst.
- Zentrifugieren bei 500 × g für 6 min. Entfernen Sie die Überstände. Zellpellet in 5 ml RPMI / 1% autologem Plasma. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 50 ml mit RPMI / 1% autologem Plasma. Gründlich mischen.
- Zählen Sie die Anzahl von Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Berechnen Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen.
- Zentrifugieren bei 500 × g für 6 min bei Raumtemp. Entfernen Sie die Überstände und resuspendieren jedes Pellet in 5 ml Sterile 0,9% NaCl, USP und Transfer zum neuen 15 ml konischen Röhrchen. Bringen Sie jede Zellsuspension auf 14 ml mit steriler 0,9% NaCl, USP. Cap und durch Umdrehen mischen.
- Wiederholen Sie den vorhergehenden Schritt zweimal. Nach der letzten Zentrifugation entfernen Überstände, so nahe wie möglich an den Zellpellets, ohne die Pellets.
- Resuspendieren der Zellpellets in DC Freezing-Lösung bei 4 - 20 x 10 6 Zellen / ml und 1 ml Aliquot jeder 1,8 ml CryoTube Fläschchen.
- Verwenden Sie den kontrollierten Rate Gefrierschrank, Programm 1, zu frieren unten die Portionen von DC Impfstoffe und übertragen sofort in der Gasphase von flüssigem Stickstoff einen Gefrierschrank für die langfristige Lagerung.
7. Lot Veröffentlichung Testing
- Jede Charge von DC Impfstoff muss ausgewertet werden und erfüllen spezifische Menge Release Kriterien (Tabelle 1), bevor es für die Injektion in Patienten in der Studie, in der Regel 5 bis 6 Wochen nach der Herstellung von Impfstoffen veröffentlicht.
- Lebensfähigkeit:Bewerten Lebensfähigkeit des DC-Impfstoff unter Verwendung einer automatisierten Zelle Zähler. Die minimale akzeptable Rentabilität Spezifikation ist> 70%.
- Identität: Bewerten Sie die Identität des reifen DCs (CD11c + CD14-CD83 +) mittels Durchflusszytometrie. Der Anteil der CD11c + Zellen sollte> 50% sein. Der Anteil der CD11c + und CD14 +-Zellen sollte <30% und der Anteil der CD11c +, CD14-, und CD83 +-Zellen, sollte> 50%.
- Sterilität: Testen der DC-Impfstoff für das Vorhandensein von aeroben und anaeroben Bakterien und Pilze durch direkte Kultur und Gramfärbungen. Bewerten auf die Anwesenheit von Mycoplasma über eine direkte Kultur und DNA Fluorochrom Färbungsanalyse mit Indikator-Zelllinie. Für diese Untersuchungen ist die minimale Spezifikation festgelegt, dass kein Wachstum von allen Kulturen beobachtet.
- Endotoxin: Beurteilen Sie die Endotoxingehalts mit dem kinetischen QCL-kinetischen chromogenen LAL-Test und es muss <50 EU / ml sein, um die minimalen Kriterien erfüllen.
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Representative Results
Zwischen 10 - 20% Ausgangsmaterial PBMCs differenzieren in DCs am Ende der Kulturperiode. Reife DCs sind CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 + und CCR7 + (Abbildung 1). Sie exprimieren hohe Mengen von MHC-Klasse-I und-II-Molekülen und den kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. Poly-ICLC auch unteren Ebenen der PDL-1 induziert zu anderen TLR-Agonisten 14 verglichen. Darüber hinaus führen diese Poly-IC-gereiften DCs sezernieren große Mengen an IL-12 (Abbildung 2 und 15,16) und die Proliferation von allogenen T-Zellen (Abbildung 3).
Abbildung 1. Repräsentative Phänotyp ausdifferenzierten DCs mit Poly-IC gereift. Alle DCs waren gated auf der vorderen und seitlichen Streudiagramm. DCs wurden identifiziert alss CD11c + und CD14-. Reifung von DCs in Reaktion auf Poly-ICLC (fette Linie) wurde basierend auf der Expression von CD83, CD40 und CCR7 ausgewertet und im Vergleich zu unstimulierten DCs (Grauton). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. DCs gereift mit Poly-IC hohe Mengen von Zytokinen. Überstände von DCs von 3 gesunden Spendern unterschieden nach nächtlichem Reifung von DCs mit Poly-IC wurden gesammelt. Zytokine produziert wurden durch Cytokine Bead Array (CBA) gemessen Menschliche inflammatorischen Zytokinen Kit (BD Biosciences), die IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1β und IL-8 misst.
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Abbildung 3. DCs gereift mit Poly-ICLC induzieren die Proliferation von allogenen T-Zellen. Poly-ICLC gereiften DCs von gesunden Spendern inkubiert wurden im Verhältnis 1:10 mit Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE)-markierten allogenen T-Zellen. Nach 6 Tagen wurde die Proliferation (A) durch Durchflusszytometrie von Gating auf CD3 + T-Zell-Population beurteilt. X-Achse zeigt die Verdünnung CFSE, als Maß für die Proliferation, die in den verschiedenen Co-Kultur-Bedingungen: T-Zellen allein, stimulierten DC, Poly-ICLC stimulierten DC und Phytohämagglutinin (PHA)-stimulierten T-Zellen. Zytokin-Sekretion (B) während der Proliferation wurde aus den Überständen der Kulturen mit der BD CBA Menschliche Cytokine Th1/Th2 Kit II (BD Biosciences), die IFN misst, TNF, IL-10, IL-6, IL-4 beurteilt, und IL-2. Nur IFNy wird gezeigt, wie die anderen Zytokine wurden nicht messbare Werte im Test festgestellt./ / Www.jove.com/files/ftp_upload/50085/50085fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
| Test | Verfahren | Kriterien |
| Lebensfähigkeit | Guava Persönliche Zellanalyse mit ViaCount Reagenz | > 70% |
| Identität | Durchflusszytometrie -% CD11c + Zellen | > 50% |
| Durchflusszytometrie -% CD11c + CD14 +-Zellen | <30% | |
| Durchflusszytometrie -% CD11c + CD14-CD83 +-Zellen | > 50% | |
| Sterilität | Bakterielle und Pilzkulturen | Negative |
| Mycoplasma: Direkte Zellkultur | Negative | |
| Endotoxin | Kinetic Chromogenic LAL Assay | <50 EU / ml |
| Aufgabe | Mixed Lymphozytenreaktion | Bericht Ergebnisse |
Tabelle 1. Lot Veröffentlichung Kriterien.
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Discussion
Phase-I-und-II-Studien von Monozyten-abgeleiteten DCs haben gezeigt, dass sie Immunreaktionen induzieren in Patienten jedoch klinische Erfolg wurde 1 beschränkt. Dies kann zum Teil auf den Mangel an Konsens darüber, wie die optimalen DCs für die Tumor-Immuntherapie Verwendung erzeugen. Obwohl es zahlreiche Möglichkeiten, um klinische Studien zu DCs zu erzeugen, unterscheiden sich diese Verfahren im Hinblick auf die Verwendung von Zytokinen, die Monozyten, Stimuli, um die Reifung zu induzieren, und die Methoden der Antigenbeladung unterscheiden. Die Formel für die Erzeugung der optimalen DCs noch zu 2 definiert werden.
Jüngste in vitro-Studien haben gezeigt, dass die DCs mit einem Cocktail von entzündungsfördernden Zytokinen 10, die in den meisten klinischen Studien verwendet wurde, gereift, insbesondere die Anwesenheit von PGE2, kann die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen und Th2-Antworten 17, express IDO induzieren 18, und in IL-12p70 defizientenProduktion 19. Diese Effekte erheblich beeinträchtigt der Impfstoff die Fähigkeit, Immunantworten zu induzieren und unterstützen daher die Notwendigkeit, alternative Methoden der Reifung DCs auszuwerten, um ihre Wirkung in vivo zu optimieren.
Der Einsatz von TLR-Agonisten, insbesondere der TLR-Agonisten 3 Poly-IC, um zu reifen die DCs kann die klinische Wirksamkeit von DCs zu verbessern. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass Poly-IC-gereiften DCs stabil hohe Expression von MHC-Molekülen und CD83 erhalten und kostimulatorischen Moleküle CD40, CD80, CD86 und 14,15,20. Zusätzlich Poly-IC-gereifte DC erzeugt hohe IL-12 14,16,20, ein wichtiges Cytokin für die Erzeugung von Anti-Tumor-Antwort 21 sowie anderen proinflammatorischen Zytokinen wie TNF-α, IL-6, IL-1β, IP-10 und Typ I IFN 14. Noch wichtiger ist, als in murinen Tumor-Modellen wurde gezeigt, DCs mit Human Papilloma Virus (HPV) Antigenen gepulst und gereift wit Poly-IC-grundiert zytotoxische T-Zell-Antworten waren in der Lage die Beseitigung der etablierten HPV16-positive Tumoren 22. Da die Reifung von DCs Status und das Vorhandensein von IL-12 scheinen mit Wirksamkeit in klinischen Studien 23,24 korrelieren, kann der Einsatz von Poly-IC zu reifen DCs ein wichtiger Schritt zur Erreichung des Ziels der klinischen Erfolg.
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Disclosures
Die Autoren haben die finanzielle Unterstützung aus der folgenden erhalten: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 und K08 AI084578 (Miller)), die Bill and Melinda Gates Foundation, Doris Duke Charitable Foundation, Cancer Research Institute, Alliance for Lupus Research und der Smaragd Foundation. Nina Bhardwaj ist ein Miterfinder von Patenten im Zusammenhang mit der Herstellung und Verwendung von dendritischen Zellen, die Immunität zu manipulieren. Die Autoren haben keine anderen relevanten Zugehörigkeiten oder finanzielle Beteiligung mit keiner Organisation oder Einrichtung mit einer finanziellen Beteiligung an oder finanzielle Konflikt mit dem Gegenstand oder Materialien im Manuskript abgesehen von denen offenbart diskutiert.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Andres Salazar (Oncovir, Inc.) für das Geschenk des Poly-ICLC danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
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