Summary
השיטה הנפוצה ביותר להפקת כמויות גדולות של תאים דנדריטים אוטולוגי (DCS) לשימוש באימונותרפיה גידול מתוארת. השיטה משתמשת IL-4 ו-GM-CSF להבדיל מDCs מונוציטים. את DCs הבוסר הוא גירוי לבוגרת ולאחר מכן נטען עם אנטיגנים לפני שהם מוזרקים חזרה לחולה.
Abstract
בעוד שמחקרים קליניים הוכיחו שהחיסונים DC אנטיגן טעונים בטוחים ומבטיחים לטיפול בגידולים 1, היעילות הקלינית שלהם עדיין לא הוקמה. השיטה המתוארת להלן, ערוכה בהתאם לתהליך ייצור טוב (GMP) הנחיות, היא אופטימיזציה של שיטת הכנת vivo לשעבר הנפוצה ביותר ליצירת מספר רב של מחקרים קליניים לDCs 2.
השיטה שלנו מנצלת את TLR הסינטטי 3 אגוניסט carboxymethylcellulose חומצה פולי-L-ליזין Polyinosinic-Polycytidylic (פולי-ICLC) כדי לעורר את DCS. המחקר הקודם שלנו הוקם שפולי-ICLC הוא גירוי התבגרות הפרט החזק ביותר לDCs אדם כפי שהוערך על ידי גברת ביטוי של CD83 וCD86, אינדוקציה של interleukin-12 (IL-12), גורם נמק גידול (TNF), אינטרפרון גאמא-Induced חלבון 10 (IP-10), 1 interleukmin (IL-1), וסוג שהאינטרפרונים (IFN), והמינימאלי אינטרלוקין 10 (IL-10) ייצור. DCs הם מובחנים מתאי קפואים דם היקפי (mononuclear PBMCs) המתקבלים על ידי leukapheresis. PBMCs מבודד על ידי צנטריפוגה שיפוע Ficoll וקפוא בaliquots. ביום 1, PBMCs הם הפשירו ומצופה על צלוחיות תרבית רקמה כדי לבחור למונוציטים שנצמדים למשטחי הפלסטיק לאחר דגירה 1-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת החממה. לאחר דגירה, הלימפוציטים הם לשטוף ומונוציטים חסיד בתרבית במשך 5 ימים בנוכחות של interleukin-4 (IL-4) וגורם מגרה מקרופאג'ים מושבה granulocyte (GM-CSF) כדי לבדל לDCs בשלה. ביום 6, DCS בשלה הם פעמו עם חלבון hemocyanin עלוקת חור המנעול (KLH) המשמש כבקרה לאיכות של החיסון ועלולים להגביר את התגובה החיסונית של החיסון 3. את DCs מומרצים להבשיל, עמוס אנטיגנים פפטיד, וטופחו במשך הלילה. ביום 7, התאים נשטפים, וקפוא ב1 aliquots מ"ל המכיל4 - 20 x 10 6 תאים באמצעות מקפיא מבוקר שיעור. בדיקות שחרורו הרבה לקבוצות של DCs מבוצעת וחייבות לעמוד במפרט מינימאליים לפני שהם מוזרקים לחולים.
Protocol
1. בידוד וCryopreservation של PBMCs 4
- הסביבה נקי מחיידקי ספייק אחת מיציאות הגישה בתיק leukapheresis באמצעות מערך העברת פלזמה. באמצעות מזרק 60 מ"ל, להעביר leukapheresis מתקבל מחולים לתוך בקבוק 500 מ"ל סטרילי.
- התאם את עוצמת קול של leukapheresis ל2x נפחו המקורי תוך שימוש בטמפרטורת החדר RPMI. מערבבים היטב.
- לערבב בעדינות את בקבוק Ficoll-Paque PLUS. הוסף PLUS 12 מיליליטר Ficoll-Paque לתוך צינור סטרילי 50 מיליליטר חרוטי.
- בעדינות שכבה 30 מ"ל של מוצר leukapheresis המדולל לכל צינור 50 מיליליטר סטרילי חרוטי המכיל Ficoll. היזהר שלא להפריע לממשק שבין Ficoll והשעית תא.
- חזור על שלבי 1.3 ו -1.4 עד שכל leukapheresis כבר שכבתית.
- צנטריפוגה צינורות חרוטי 50 מ"ל ב 1000 × גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר, ללא בלם.
- לקצור את השכבה העכורה של PBMCs זהירות מצינור אחד וtransfeR לצינורות 50 מ"ל סטרילי החדש.
- הוסף RPMI על צינור אחד לנפח סופי של 50 מ"ל. מערבבים בעדינות על ידי היפוך.
- צנטריפוגה התאים ב 500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C עם בלם מלא.
- הסר את supernatants מצינור אחד. Resuspend את כדורי תא מצינור אחד ולהוסיף RPMI לנפח סופי של 50 מ"ל. מערבבים בעדינות על ידי היפוך.
- צנטריפוגה התאים ב 500 × גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
- הסר את supernatants מצינור אחד. Resuspend ובריכת יחד את השעיות התא לתוך צינור אחד 50 מיליליטר חרוטי.
- תביא את הנפח של PBMCs אספו עד 50 מ"ל עם יותר RPMI. מערבבים בעדינות על ידי היפוך.
- צנטריפוגה התאים ב 300 × גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
- הסר את supernatant. Resuspend התא גלולה ב 50 מ"ל RPMI. מערבבים בעדינות כדי להבטיח השעיה תא אחידה.
- לספור את מספר התאים ולקבוע כדאיות תא. לחשב את המספר הכולל של תאי קיימא.
- צנטריפוגה התאים ב 300× גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C. הכן את התקשורת המקפיא. תקשורת הקפאה מורכבת של 10% sulfoxide דימתיל (DMSO; Miltenyi BIOTEC) באדם א.ב. סרום (העמק ביו רפואית).
- הסר את supernatant. Resuspend התאים בריכוז סופי של 2 x 10 8 תאים / מ"ל בתקשורת קרה וקפואה.
- הפוך 1 aliquots מ"ל ב1.8 cryovials מ"ל.
- העבר את cryovials למקפיא מבוקר השיעור ולהתחיל את ריצת ההקפאה, 1 תכנית. בסוף הריצה, להעביר את cryovials הקפוא מייד לשלב אדים מהמקפיא החנקן הנוזלי.
2. 0 יום: התמיינות של תאי דנדריטים ממונוציטים
- הוסף 30 מ"ל של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית לצינור סטרילי 50 מיליליטר חרוטי.
- aliquots ההפשרה של PBMCs הוקפא על ידי תסיסה עדינה באמבט המים 37 מעלות צלזיוס. כשהפשיר לחלוטין, להעביר את התוכן של הבקבוקונים לצינור סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. מערבבים היטב.
- צנטריפוגה התאים במשך 6 דקותב500 × גרם בטמפרטורת חדר. הסר את supernatant ו resuspend תאי pelleted בנפח קטן של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית. ואז להוסיף עוד RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית לנפח סופי של 50 מ"ל. מערבבים היטב.
- צנטריפוגה התאים שוב במשך 6 דקות ב 500 × גרם בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ו resuspend את הכדור ב 50 מ"ל RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית. מערבבים היטב.
- לספור את מספר התאים ולקבוע כדאיות תא. לחשב את המספר הכולל של תאי קיימא.
- צלחת 1.40 x 10 8 תאים ב40 מ"ל של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית על EasyFlask 225 ס"מ 2. חזור על פעולה עד שמצופים כל התאים.
- דגירה EasyFlasks השטוחות בצד שלה - 1 שעת 2 ב 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה המכילה 5% CO 2 כדי לאפשר את מונוציטים לדבוק בבקבוק.
- כאשר הדגירה תושלם, להסיר EasyFlask מהחממה ולשטוף פעמיים כדי להסיר את התאים שאינם חסיד USIמיליליטר ng 30 מתוך prewarmed RPMI.
- לאחר לשטוף את השני, להוסיף 40 מ"ל של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית עם 400-1,000 IU / מ"ל IL-4 ו100-1,000 IU / מיליליטר GM-CSF 5-8. לפרוטוקול זה, אנו משתמשים 400 IU / מיליליטר IL-4 ו 100 IU / מיליליטר GM-CSF.
- דגירה EasyFlasks עבור 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת החממה המכילה 5% CO 2.
3. יום 2: האכלה של תאים דנדריטים עם IL-4 ו-GM-CSF
- הוסף 4 מ"ל של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית עם 400-1,000 IU / מ"ל IL-4 ו100-1,000 IU / מ"ל GM-CSF לכל EasyFlask. מערבבים על ידי מתערבל ומתנדנד על צידו.
- דגירה EasyFlasks לעוד 3 ימים (עד יום 5) על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת החממה המכילה 5% CO 2.
4. יום 5: קצירה של תאי דנדריטים לא בוגרים
- לקצור את התרבויות על ידי נמרצות מתערבל את צלוחיות ועל ידי pipetting למעלה ולמטה כדי resuspend תאים שאינם חסיד וחסידים רופף. העברתאים שנקטפו לצינורות חדשים 50 מ"ל החרוטים.
- צנטריפוגה הצינורות ב 500 × גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את supernatants ו resuspend התא גלולה ב 50 מ"ל RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית. מערבבים היטב.
- לספור את מספר התאים ולקבוע כדאיות תא. לחשב את המספר הכולל של תאי קיימא.
- צנטריפוגה הצינורות ב 500 × גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר. פלייט 1-2 x 10 6 תאים לכל גם ב3 מ"ל RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית עם 400 IU / מ"ל IL-4 ו 100 IU / מיליליטר GM-CSF בצלחות תרבית רקמת 6 גם.
- דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה המכילה 5% CO 2 למשך הלילה.
5. יום 6: התבגרות וטוען Antigen של תאים דנדריטים
- הוסף 10 מיקרוגרם / מיליליטר KLH עד 1/3 מהבארות בתרבות הצלחות 6 גם. לערבל את הצלחות לתערובת. KLH הוא הוסיף רק עד 1/3 מהבארות בגלל KLH משמש לחיסון DC הראשון בלבד. קון חיסוני DC לאחרTain רק פפטידים אנטיגן הסרטניים.
- יכול להיות מגורה DCs להתבגר באמצעות גירויים שונים. הגירויים ההתבגרות הנפוצים ביותר שבו נעשה שימוש במחקרים קליניים כבר קוקטייל של ציטוקינים (IL-1 β, TNFα, ו-IL-6) וE2 פרוסטגלנדין (PGE 2) 9,10. לאחרונה, השימוש בחיוג כמו קולט (TLR) אגוניסטים צבר פופולריות 11,12. בפרוטוקול זה, להוסיף 2 מ"ג / carboxymethylcellulose חומצה פולי-L-ליזין Polyinosinic-Polycytidylic מ"ל (פולי-ICLC) לבארות ומערבבים היטב. Poly-ICLC הוא הניסוח קליני כיתה של פולי-IC שהוא התייצב עם פולי-L-*-ליזין וcarboxymethylcellulose (מיוצר על ידי Oncovir, Inc).
- הוסף 100 מיקרוגרם / אנטיגנים פפטידים ארוכים מ"ל (NY-ESO-1 ו / או Melan-A/MART-1) לבארות המיועדות שלהם, כל אחד מקבל רק פפטיד יחיד למניעת הצטלבות תחרות 13 כן.
- דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה המכילה 5% CO <תת> 2 O / נ
6. יום 7: Cryopreservation של תאי דנדריטים
- הכן את הפתרון מקפיא DC באמצעות הפלזמה אוטולוגית ו10% DMSO. צנטריפוגה הפתרון מקפיא DC ב 2000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי להסיר חומר חלקיקים כל. העבר את supernatant לצינור חדש שכותרת מ"ל 15 חרוטי. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- כאשר הדגירה הלילה הוא סיים, קציר ובריכת את כל הבארות המכילות DCs פעם עם פפטידים לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל.
- צנטריפוגה הצינורות ב 500 × גרם במשך 6 דקות. הסר את supernatants. Resuspend התא גלולה ב 5 מ"ל של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית. תביא את הנפח הכולל של עד 50 מ"ל עם RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית. מערבבים היטב.
- לספור את מספר התאים ולקבוע כדאיות תא. חישוב מספר כולל של תאי קיימא.
- צנטריפוגה הצינורות ב 500 × גרם במשך 6 דקות בטמפ 'החדר. הסר את supernatants וresuspend כל גלולה ב 5 מ"ל SteriLe 0.9% NaCl, USP והעברה לצינורות חדש 15 מ"ל החרוטים. להביא כל השעיה תא 14 מ"ל עם סטרילי יותר 0.9% NaCl, USP. כובע ומערבב על ידי היפוך.
- חזור על השלב קודם פעמיים. לאחר צנטריפוגה האחרונה, להסיר את supernatants, מקבל קרוב ככל האפשר לכדורי התא מבלי להפריע את כדורים.
- Resuspend את כדורי תא הקפאה בפתרון DC ב4 - 20 x 10 6 תאים / מ"ל ומיליליטר aliquot 1 לכל בקבוקון cryotube 1.8 מ"ל.
- השתמש מבוקר שיעור המקפיא, תכנית 1, להקפיא במורד aliquots של חיסוני DC ולהעביר מייד לשלב האדים של מקפיא חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
7. בדיקת שחרור הרבה
- כל מנה של חיסון DC חייבת להיות מוערכת ועומדות בקריטריונים לשחרור הרבה ספציפיים (טבלת 1) לפני שהוא שוחרר להזרקה לחולים שהשתתפו במחקר, בדרך כלל 5 עד 6 שבועות לאחר הכנת חיסון.
- כדאיות:להעריך את הכדאיות של חיסון DC באמצעות מונה תא אוטומטי. מפרט הכדאיות המקובל המינימום הוא> 70%.
- זהות: להעריך את זהותו של DCs הבוגר (CD11c + CD14-CD83 +) על ידי cytometry הזרימה. אחוז + תאי CD11c צריך להיות> 50%. אחוז CD11c + ו CD14 + התאים צריך להיות <30% ואחוז CD11c +, CD14-, וCD83 + תאים צריכים להיות> 50%.
- עקרות: מבחן חיסון DC לנוכחות של חיידקים אנאירוביים ואירוביים ופטריות על ידי תרבות הישירה וכתמי גרם. להעריך את קיומו של Mycoplasma באמצעות מערכת תרבות ישירה ו assay מכתים fluorochrome DNA עם שורת תאי מחוון. לבדיקות אלה, סט המפרט המינימאלי הוא שאין צמיחה נצפתה מכל התרבויות.
- רעלן פנימי: הערכת תוכן רעלן פנימי באמצעות assay LAL chromogenic הקינטית קינטי-QCL וזה חייב להיות <50 איחוד אירופי / מ"ל על מנת לעמוד בקריטריונים המינימאליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בין 10 ל - 20% של PBMCs מתחיל להתמיין DCs בסוף תקופת התרבות. DCs בוגרת הן CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, וCCR7 + (איור 1). הם מבטאים רמות גבוהות של MHC כיתה אני ומולקולות השנייה ואת מולקולות costimulatory CD80 ו CD86. Poly-ICLC גם מושרה רמות נמוכות יותר של PDL-1, בהשוואה לאגוניסטים TLR האחרים 14. בנוסף, סכומים אלה Poly-IC-הבשיל DCs מפרישים הגדולים של IL-12 (איור 2 ו15,16) ולגרום להתפשטות של תאי T אלוגנאית (איור 3).
איור 1. הפנוטיפ נציג של DCs מובחן באופן מלא התבגר עם פולי-IC. כל DCs היה מגודר ובקדימה עלילת צד הפיזור. DCs זוהושל CD11c + ו-CD14. התבגרות של DCs בתגובה לפולי-ICLC (קו מודגש) הוערכה בהתבסס על הביטוי של CD83, CD40, וCCR7 ובהשוואה לDCs unstimulated (גוון אפור). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. DCs התבגר עם פולי-IC לייצר רמות גבוהות של ציטוקינים. Supernatants מDCs נבדל מ3 תורמים בריאים נאספו לאחר הבשלת הלילה של DCs עם פולי-IC. ציטוקינים המיוצרים נמדדו על ידי מערך חרוז ציטוקין (CBA) ציטוקינים דלקתיים אדם Kit (BD Biosciences) אשר מודד IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1β, ו-IL-8.
RC = "/ files/ftp_upload/50085/50085fig3.jpg" />
איור 3. DCs התבגר עם פולי-ICLC לגרום להתפשטות של תאי T אלוגנאית. פוליפוני-ICLC-התבגר DCs מתורמים בריאים הודגרו 1:10 עם Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFSE) שכותרתו תאי T אלוגנאית. לאחר 6 ימים, התפשטות () הוערכה על ידי cytometry זרימת gating על ידי CD3 + אוכלוסיית תאי T. ציר ה-X מראה את הדילול של CFSE, כמדידה של התפשטות, בתנאים השונים שיתוף התרבות: תאי T לבד, unstimulated הבירה, פולי-DC ICLC מגורה, וphytohaemagglutinin תאי T (PHA), מגורה. הפרשת ציטוקינים (ב ') במהלך ההתפשטות הוערכה מsupernatants בתרבויות באמצעות BD-CBA אנוש Th1/Th2 ציטוקין ערכה השני (BD Biosciences) אשר מודדת IFNγ, TNF, IL-10, IL-6, IL-4, ו IL-2. IFNγ רק מוצג כציטוקינים האחרים לא התגלו לרמות מדידות בassay./ / Www.jove.com/files/ftp_upload/50085/50085fig3large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
| מבחן | שיטה | קריטריונים |
| יכולת חיוניות הקיום | ניתוח תא אישי גויאבה עם מגיב ViaCount | > 70% |
| זהות | Cytometry זרימה - CD11c% + תאים | > 50% |
| Cytometry זרימה - CD11c% + CD14 + תאים | <30% | |
| Cytometry זרימה - CD11c% + CD14-CD83 + תאים | > 50% | |
| עקרות | תרבויות חיידקים ופטריות | שלילי |
| תרבות סלולרי ישירה: Mycoplasma | שלילי | |
| רעלן פנימי | Assay LAL chromogenic קינטי | <50 איחוד אירופי / מ"ל |
| פונקציה | תגובה לימפוציטים מעורבת | תוצאות דוח |
טבלת מס '1. קריטריונים לשחרור לוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב I ו-II של ניסויים קליניים DCs מונוציטים הנגזרות הראו כי הם לעורר תגובות חיסוניות בחולים עם זאת הצלחה קלינית הייתה מוגבלת 1. זה עשוי להיות בחלקו בשל חוסר הסכמה על איך ליצור את DCs האופטימלי לשימוש immunotherapeutic גידול. אמנם יש דרכים רבות כדי ליצור DCs הקליני בדרגה, בשיטות אלה משתנים במונחים של השימוש בציטוקינים המשמשים כדי להבדיל את מונוציטים, גירויים המשמשים כדי לגרום להבשלה, ושיטות לטעינת אנטיגן. נוסחה ליצירה את DCs האופטימלי עדיין להיות מוגדרת 2.
אחרונים במחקרים במבחנה הראו כי DCs התבגר עם קוקטייל של ציטוקינים מעודדי דלקת 10 אשר שימש ברוב המכריע של ניסויים קליניים, בפרט בנוכחות PGE2, עשויה לגרום להתמיינות של תאי T רגולטוריים ותגובות Th2 17, ההגעה ועידו 18, והם חסרים IL-12p70ייצור 19. תופעות אלה פוגעים ביכולתו של החיסון כדי לגרום לתגובה חיסונית, ולכן תומך בצורך להעריך שיטות חלופיות של DCs התבגרות על מנת לייעל את ההשפעות שלהם in vivo באופן משמעותי.
השימוש באגוניסטים TLR, אגוניסט TLR 3 פוליפוני-IC, לבפרט להבשיל את DCs עשוי לשפר את היעילות הקלינית של DCS. במבחנה מחקרים הראו כי DCs Poly-IC-הבשיל שמר ביטוי גבוה יציב של מולקולות MHC וCD83 ו מולקולות costimulatory CD40, CD80, CD86 ו14,15,20. DCs בנוסף, Poly-IC-הבשיל הופק רמות גבוהות של IL-12, 14,16,20 ציטוקינים חשובים עבור הדור של תגובה נגד גידול 21, כמו גם ציטוקינים מעודדי דלקת אחרות כגון TNF-α, IL-6, IL-1β, IP-10, ואני מסוג IFNs 14. יותר מכך, כפי שהוכח במודלי גידול Murine, DCs פעם עם וירוס הפפילומה אנושי (HPV) ואנטיגנים התבגר wתגובות תא T ציטוטוקסיות IC-דרוך פוליפוני-ith היו מסוגלים ביעור הוקם HPV16-לבטא גידולים 22. כמעמד ההתבגרות של DCs והנוכחות של IL-12 יופיעו כדי לתאם עם יעילות בניסויים קליניים 23,24, השימוש בפולי-IC לDCs בוגרת עשוי להיות צעד חשוב לקראת השגת המטרה של הצלחה קלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים קיבלת תמיכה כספית מהפעולות הבאות: NIH (AI061684, AI071078, AI044628, וK08 AI084578 (מילר)), ביל ומלינדה גייטס קרן, קרן הצדקה של דוריס דיוק, לחקר סרטן במכון, למחקר לופוס ברית, ואמרלד קרן. נינה Bhardwaj הוא coinventor על פטנטים הקשורים להכנה ושימוש בתאים דנדריטים לתפעל חסינות. יש החוקרים אין השתייכות רלוונטיות אחרות או מעורבות כספית עם כל ארגון או ישות עם אינטרס כלכלי בסכסוך כספי או עם העניין או חומרי הנושא נדון בכתב היד מלבד אלה פורסמו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לאנדרס סלזר (Oncovir, Inc) על המתנה של פולי-ICLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
- Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, Suppl 2. 1-2 (2001).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
- Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
- O'Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
- de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
- Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
- Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, Suppl 4. A8-A22 (2002).
- Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
- Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants? Cancer J. 16, 382-391 (2010).
- Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
- Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
- Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
- Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
- Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
- Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
- Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
- Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
- Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
- Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
- Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
- Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).
