השיטה הנפוצה ביותר להפקת כמויות גדולות של תאים דנדריטים אוטולוגי (DCS) לשימוש באימונותרפיה גידול מתוארת. השיטה משתמשת IL-4 ו-GM-CSF להבדיל מDCs מונוציטים. את DCs הבוסר הוא גירוי לבוגרת ולאחר מכן נטען עם אנטיגנים לפני שהם מוזרקים חזרה לחולה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנת תאים דנדריטים גידול Antigen טעון בוגרים לחיסוניים
במאמר זה
סיכום
תקציר
בעוד שמחקרים קליניים הוכיחו שהחיסונים DC אנטיגן טעונים בטוחים ומבטיחים לטיפול בגידולים 1, היעילות הקלינית שלהם עדיין לא הוקמה. השיטה המתוארת להלן, ערוכה בהתאם לתהליך ייצור טוב (GMP) הנחיות, היא אופטימיזציה של שיטת הכנת vivo לשעבר הנפוצה ביותר ליצירת מספר רב של מחקרים קליניים לDCs 2.
השיטה שלנו מנצלת את TLR הסינטטי 3 אגוניסט carboxymethylcellulose חומצה פולי-L-ליזין Polyinosinic-Polycytidylic (פולי-ICLC) כדי לעורר את DCS. המחקר הקודם שלנו הוקם שפולי-ICLC הוא גירוי התבגרות הפרט החזק ביותר לDCs אדם כפי שהוערך על ידי גברת ביטוי של CD83 וCD86, אינדוקציה של interleukin-12 (IL-12), גורם נמק גידול (TNF), אינטרפרון גאמא-Induced חלבון 10 (IP-10), 1 interleukmin (IL-1), וסוג שהאינטרפרונים (IFN), והמינימאלי אינטרלוקין 10 (IL-10) ייצור. DCs הם מובחנים מתאי קפואים דם היקפי (mononuclear PBMCs) המתקבלים על ידי leukapheresis. PBMCs מבודד על ידי צנטריפוגה שיפוע Ficoll וקפוא בaliquots. ביום 1, PBMCs הם הפשירו ומצופה על צלוחיות תרבית רקמה כדי לבחור למונוציטים שנצמדים למשטחי הפלסטיק לאחר דגירה 1-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת החממה. לאחר דגירה, הלימפוציטים הם לשטוף ומונוציטים חסיד בתרבית במשך 5 ימים בנוכחות של interleukin-4 (IL-4) וגורם מגרה מקרופאג'ים מושבה granulocyte (GM-CSF) כדי לבדל לDCs בשלה. ביום 6, DCS בשלה הם פעמו עם חלבון hemocyanin עלוקת חור המנעול (KLH) המשמש כבקרה לאיכות של החיסון ועלולים להגביר את התגובה החיסונית של החיסון 3. את DCs מומרצים להבשיל, עמוס אנטיגנים פפטיד, וטופחו במשך הלילה. ביום 7, התאים נשטפים, וקפוא ב1 aliquots מ"ל המכיל4 - 20 x 10 6 תאים באמצעות מקפיא מבוקר שיעור. בדיקות שחרורו הרבה לקבוצות של DCs מבוצעת וחייבות לעמוד במפרט מינימאליים לפני שהם מוזרקים לחולים.
פרוטוקול
1. בידוד וCryopreservation של PBMCs 4
- הסביבה נקי מחיידקי ספייק אחת מיציאות הגישה בתיק leukapheresis באמצעות מערך העברת פלזמה. באמצעות מזרק 60 מ"ל, להעביר leukapheresis מתקבל מחולים לתוך בקבוק 500 מ"ל סטרילי.
- התאם את עוצמת קול של leukapheresis ל2x נפחו המקורי תוך שימוש בטמפרטורת החדר RPMI. מערבבים היטב.
- לערבב בעדינות את בקבוק Ficoll-Paque PLUS. הוסף PLUS 12 מיליליטר Ficoll-Paque לתוך צינור סטרילי 50 מיליליטר חרוטי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בין 10 ל - 20% של PBMCs מתחיל להתמיין DCs בסוף תקופת התרבות. DCs בוגרת הן CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, וCCR7 + (איור 1). הם מבטאים רמות גבוהות של MHC כיתה אני ומולקולות השנייה ואת מולקולות costimulatory CD80 ו CD86. Poly-ICLC גם מושרה רמות נמוכות יותר של PDL-1, בהשוואה לאגוניסטים TLR האחרים 14. בנוסף, סכומים אלה Poly-IC-הבשיל DCs מפרישים הגדולים של IL-12 (איור 2 ו15,16) ולגרום להתפשטות של תאי T אלוגנאית (איור 3).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלב I ו-II של ניסויים קליניים DCs מונוציטים הנגזרות הראו כי הם לעורר תגובות חיסוניות בחולים עם זאת הצלחה קלינית הייתה מוגבלת 1. זה עשוי להיות בחלקו בשל חוסר הסכמה על איך ליצור את DCs האופטימלי לשימוש immunotherapeutic גידול. אמנם יש דרכים רבות כדי ליצור DCs הקליני בדרגה, בשיטות אלה משתנים במונחים של השימוש בציטוקינים המשמשים כדי להבדיל את מונוציטים, גירויים המשמשים כדי לגרום להבשלה, ושיטות לטעינת אנטיגן. נוסחה ליצירה את DCs האופטימלי עדיין להיות מוגדרת 2.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים קיבלת תמיכה כספית מהפעולות הבאות: NIH (AI061684, AI071078, AI044628, וK08 AI084578 (מילר)), ביל ומלינדה גייטס קרן, קרן הצדקה של דוריס דיוק, לחקר סרטן במכון, למחקר לופוס ברית, ואמרלד קרן. נינה Bhardwaj הוא coinventor על פטנטים הקשורים להכנה ושימוש בתאים דנדריטים לתפעל חסינות. יש החוקרים אין השתייכות רלוונטיות אחרות או מעורבות כספית עם כל ארגון או ישות עם אינטרס כלכלי בסכסוך כספי או עם העניין או חומרי הנושא נדון בכתב היד מלבד אלה פורסמו.
תודות
המחברים מבקשים להודות לאנדרס סלזר (Oncovir, Inc) על המתנה של פולי-ICLC.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 בינוני עם L-גלוטמין | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES תמיסת מלח חוצצת | BioWhittaker | 17-737E | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| אלבומין אנושי, תמיסה 25% USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB סרום | עמק ביו-רפואי | HP1022 | |
| מלח סטריליים USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 מ"ג/מ"ל | ברלקס | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| הילטונול, Poly-ICLC, 2 מ"ג/מ"ל | אונקוביר | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 ס"מ רבוע EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6 בארות צלחות תרבית רקמות | Becton Dickinson | 353046 | |
| בקבוקוני CryoTube 1.8 מ"ל | Nalgene Nunc | 377267 | |
| מקפיא קצב מבוקר | Thermo | CryoMed |
מקורות
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
