Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

إعداد ورم مستضد محملة الخلايا الجذعية الناضجة لعلاج مناعي

Published: August 1, 2013 doi: 10.3791/50085
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Cancer Institute, NYU Langone Medical Center, 2Infectious Diseases, NYU Langone Medical Center

Summary

يوصف الأسلوب الأكثر استخداما لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية ذاتي (DCS) لاستخدامها في العلاج بالخلايا الجذعية السرطانية. يستخدم الأسلوب IL-4 و GM-CSF للتمييز البلدان النامية من حيدات. يتم تحفيز البلدان النامية غير ناضجة لتنضج ومن ثم تحميلها مع مستضدات قبل أن يتم حقنها مرة أخرى في جسم المريض.

Abstract

بينما أثبتت الدراسات السريرية أن اللقاحات DC مستضد محملة آمنة والعلاج واعدة للأورام 1، يبقى فعاليتها السريرية التي ستنشأ. الطريقة الموضحة أدناه، التي أعدت وفقا للإجراءات التصنيع الجيدة (GMP) المبادئ التوجيهية، هو تعظيم الاستفادة من طريقة إعداد فيفو السابقين الأكثر شيوعا لتوليد أعداد كبيرة من البلدان النامية للدراسات السريرية 2.

لدينا وسيلة تستخدم TLR الاصطناعية 3 ناهض Polyinosinic-Polycytidylic ميثيل السيلولوز حمض بولي-L-يسين (بولي ICLC) لتحفيز البلدان النامية. أنشئت لدينا دراسة سابقة أن بولي ICLC هو أقوى التحفيز نضوج الفرد بالنسبة للبلدان النامية الإنسان وفقا لتقييم زيادة إفراز من CD83 CD86 و، تحريض انترلوكين 12 (IL-12)، عامل نخر الورم (TNF)، انترفيرون غاما الناجمة عن بروتين 10 (IP-10)، interleukmin 1 (IL-1)، والنوع الأول إنترفيرون (الإنترفيرون)، والحد الأدنى من انترلوكين 10 (IL-10) الإنتاج. يتم التمييز البلدان النامية من خلايا وحيدات النوى المجمدة الدم المحيطي (PBMCs) التي حصلت عليها فصادة الكريات البيض. يتم عزل PBMCs بواسطة الطرد المركزي المتدرج Ficoll والمجمدة في مأخوذة. في يوم 1، ويتم إذابة PBMCs ومطلي على قوارير زراعة الأنسجة لتحديد لحيدات التي تلتزم سطح البلاستيك بعد 1-2 ساعة الحضانة عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة. بعد الحضانة، ويتم غسل الخلايا الليمفاوية قبالة ويتم تربيتها وحيدات ملتصقة لمدة 5 أيام في وجود انترلوكين 4 (IL-4) ومحببة عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (GM-CSF) للتمييز إلى البلدان النامية غير ناضجة. في يوم 6، ونابض البلدان النامية غير ناضجة مع البطلينوس هيموسيانين (KLH) بروتين ثقب المفتاح التي هي بمثابة مراقبة لجودة اللقاح، وربما تعزيز المناعية للقاح 3. يتم تحفيز البلدان النامية إلى أن تنضج، محملة مستضدات الببتيد، وحضنت بين عشية وضحاها. في يوم 7، يتم غسلها الخلايا، وجمدت في 1 مليلتر مأخوذة تحتوي على4-20 × 10 6 خلايا باستخدام المجمد سعر للرقابة. يتم تنفيذ الكثير الإفراج اختبار للدفعات من البلدان النامية ويجب أن تستوفي الحد الأدنى من المواصفات قبل أن يتم حقنها في المرضى.

Protocol

1. العزلة والحفظ بالتبريد من PBMCs 4

  1. جو معقم و مطهر سنبلة واحدة من منافذ الوصول في كيس فصادة الكريات البيض باستخدام مجموعة نقل البلازما. باستخدام 60 مل حقنة، ونقل فصادة الكريات البيض التي تم الحصول عليها من المرضى إلى العقيمة 500 مل زجاجة.
  2. ضبط مستوى الصوت من فصادة الكريات البيض إلى 2x حجمه الأصلي باستخدام درجة حرارة الغرفة RPMI. تخلط جيدا.
  3. مزيج بلطف زجاجة من Ficoll-Paque PLUS. إضافة 12 مل Ficoll-PLUS Paque في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  4. بلطف طبقة 30 مل من المنتج فصادة الكريات البيض المخفف إلى كل العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي يحتوي Ficoll. يجب الحرص على عدم تعكير صفو اجهة بين Ficoll وتعليق خلية.
  5. كرر الخطوات من 1.3 و 1.4 حتى يتم الطبقات كل من فصادة الكريات البيض.
  6. الطرد المركزي 50 مل أنابيب مخروطية في 1،000 × ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع عدم وجود الفرامل.
  7. حصاد بعناية طبقة غائم من PBMCs من كل أنبوب وحوالةR إلى جديد معقم 50 مل أنابيب.
  8. إضافة RPMI إلى كل أنبوب إلى الحجم النهائي من 50 مل. المزيج بلطف بواسطة انقلاب.
  9. الطرد المركزي الخلايا في 500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية مع الفرامل الكاملة.
  10. إزالة supernatants من كل أنبوب. Resuspend وكريات خلية من كل أنبوب وإضافة RPMI إلى الحجم النهائي من 50 مل. المزيج بلطف بواسطة انقلاب.
  11. الطرد المركزي الخلايا في 500 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية.
  12. إزالة supernatants من كل أنبوب. Resuspend وبركة معا في تعليق خلية واحدة إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  13. تبرزي حجم من PBMCs مجمعة تصل إلى 50 مل مع أكثر RPMI. المزيج بلطف بواسطة انقلاب.
  14. الطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية.
  15. إزالة طاف. Resuspend وبيليه الخلية في 50 مل RPMI. المزيج بلطف لضمان تعليق خلية موحدة.
  16. حساب عدد الخلايا وتحديد بقاء الخلية. حساب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة.
  17. الطرد المركزي الخلايا في 300× ز لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. إعداد وسائل الإعلام التجميد. ويتكون سائل الإعلام تجميد 10٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO؛ بيوتيك Miltenyi) في الإنسان AB مصل (وادي الطبية الحيوية).
  18. إزالة طاف. resuspend الخلايا في تركيز النهائي من 2 × 10 8 خلية / مل في وسائل الإعلام تجميد الباردة.
  19. جعل 1 مل aliquots في 1.8 مل cryovials.
  20. نقل cryovials في الفريزر أسعار تسيطر عليها والبدء في تشغيل تجميد، برنامج 1. في نهاية المدى، ونقل على الفور الى cryovials المجمدة مرحلة البخار من الفريزر النيتروجين السائل.

2. اليوم 0: تمايز الخلايا الجذعية من حيدات

  1. إضافة 30 مل من RPMI / بلازما ذاتي 1٪ إلى العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  2. ذوبان الجليد مأخوذة من PBMCs المجمدة من قبل الإثارة لطيف في 37 ° C حمام الماء. عندما تحسنت تماما، نقل محتويات قارورة معقمة إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تخلط جيدا.
  3. الطرد المركزي الخلايا لمدة 6 دقائقفي 500 × ز في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف و resuspend الخلايا مكعبات في حجم صغير من RPMI / بلازما ذاتي 1٪. ثم إضافة المزيد من RPMI / بلازما ذاتي 1٪ إلى الحجم النهائي من 50 مل. تخلط جيدا.
  4. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى لمدة 6 دقائق في 500 × ز في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف و resuspend بيليه في 50 مل RPMI / بلازما ذاتي 1٪. تخلط جيدا.
  5. حساب عدد الخلايا وتحديد بقاء الخلية. حساب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة.
  6. لوحة 1.40 × 10 8 خلايا في 40 مل من RPMI / 1٪ البلازما ذاتي على 225 سم 2 EasyFlask. كرر حتى تم مطلي جميع الخلايا.
  7. احتضان EasyFlasks مسطح على جانبها ل1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة تحتوي على 5٪ CO 2 للسماح للحيدات التمسك القارورة.
  8. عندما اكتمال الحضانة، وإزالة EasyFlask من الحاضنة، ويغسل مرتين لإزالة الخلايا غير ملتصقة USIنانوغرام 30 مل من prewarmed RPMI.
  9. بعد غسل الثاني، إضافة 40 مل من RPMI / بلازما ذاتي 1٪ مع 400-1،000 وحدة دولية / مل IL-4 و 100-1،000 وحدة دولية / مل GM-CSF 5-8. لهذا البروتوكول، ونحن نستخدم 400 وحدة دولية / مل IL-4 و 100 وحدة دولية / مل GM-CSF.
  10. احتضان لمدة 2 EasyFlasks أيام عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة تحتوي على 5٪ CO 2.

3. يوم 2: تغذية الخلايا الجذعية مع IL-4 و GM-CSF

  1. إضافة 4 مل من RPMI / بلازما ذاتي 1٪ مع 400-1،000 وحدة دولية / مل IL-4 و 100-1،000 وحدة دولية / مل GM-CSF إلى كل EasyFlask. مزيج من قبل دوامات وهزاز على جانبها.
  2. احتضان EasyFlasks لمدة 3 أيام أخرى (حتى يوم 5) عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة تحتوي على 5٪ CO 2.

4. يوم 5: حصاد الخلايا الجذعية غير ناضج

  1. حصاد الثقافات التي يحوم بقوة قوارير وpipetting صعودا وهبوطا ل resuspend الخلايا غير ملتصقة وملتصقة فضفاضة. نقلخلايا المقطوع إلى جديد 50 مل أنابيب مخروطية.
  2. أنابيب الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatants و resuspend الكرية خلية في 50 مل RPMI / بلازما ذاتي 1٪. تخلط جيدا.
  3. حساب عدد الخلايا وتحديد بقاء الخلية. حساب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة.
  4. أنابيب الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لوحة 1-2 × 10 6 خلايا لكل بئر في 3 مل RPMI / بلازما ذاتي 1٪ مع 400 وحدة دولية / مل IL-4 و 100 وحدة دولية / مل GM-CSF في 6 جيدا لوحات زراعة الأنسجة.
  5. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة التي تحتوي على 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها.

5. يوم 6: النضج ومولدة جار الخلايا الجذعية

  1. إضافة 10 ميكروغرام / مل KLH إلى 1/3 من الآبار في لوحات ثقافة 6 جيدا. دوامة لوحات لخلط. يضاف KLH فقط إلى 1/3 من الآبار لأنه يستخدم فقط KLH لقاح DC الأول. اللاحقة DC اللقاحات يخدعتين فقط الببتيدات مستضد الورم.
  2. يمكن حفز البلدان النامية إلى أن تنضج استخدام محفزات مختلفة. كانت المحفزات نضوج الأكثر شيوعا التي تم استخدامها في الدراسات السريرية مزيج من السيتوكينات (IL-1 β، TNFα، وIL-6) والبروستاغلاندين E2 (PGE 2) 9،10. وفي الآونة الأخيرة، واستخدام تول مثل مستقبلات (TLR) منبهات اكتسبت شعبية 11،12. في هذا البروتوكول، إضافة 2 ملغ / مل Polyinosinic-Polycytidylic ميثيل السيلولوز حمض بولي-L-يسين (بولي ICLC) إلى الآبار وتخلط جيدا. بولي ICLC هو صياغة السريرية الصف من بولي IC أن تكون ثابتة مع بولي-L-*-يسين وميثيل السيلولوز (المصنعة من قبل Oncovir، وشركة).
  3. إضافة 100 ميكروغرام / مل مستضدات الببتيد طويلة (NY-ESO-1 و / أو Melan-A/MART-1) إلى الآبار المحددة لها، كل تلقي جيدا فقط الببتيد واحدة لتجنب انتقال المنافسة 13.
  4. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة تحتوي على 5٪ CO <الفرعية> 2 O / N.

6. يوم 7: الحفظ بالتبريد من الخلايا الجذعية

  1. إعداد DC الحل التجميد باستخدام البلازما ذاتي و 10٪ DMSO. أجهزة الطرد المركزي في حل تجميد DC في 2،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة أي مواد الجسيمات. طاف لنقل صفت 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. عندما يتم الانتهاء من الحضانة بين عشية وضحاها، والحصاد وبركة جميع الآبار التي تحتوي على البلدان النامية نابض مع الببتيدات في أنابيب مخروطية 50 مل.
  3. أنابيب الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق. إزالة supernatants. Resuspend وبيليه الخلية في 5 مل من RPMI / بلازما ذاتي 1٪. جعل إجمالي حجم ما يصل الى 50 مل مع RPMI / بلازما ذاتي 1٪. تخلط جيدا.
  4. حساب عدد الخلايا وتحديد بقاء الخلية. حساب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة.
  5. أنابيب الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatants و resuspend كل بيليه في 5 مل STERIجنيه بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم، USP ونقل إلى جديدة 15 مل أنابيب مخروطية. جلب كل تعليق الخلية إلى 14 مل مع أكثر العقيمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم، USP. قبعة ومزيج من قبل انقلاب.
  6. كرر الخطوة السابقة مرتين. بعد الطرد المركزي مشاركة، وإزالة supernatants، والحصول على أقرب ما يمكن إلى الكريات الخلية دون إزعاج الكريات.
  7. Resuspend وكريات خلية في العاصمة الحل التجميد في 4-20 × 10 6 خلية / مل وقسامة 1 مل لكل قارورة CryoTube 1.8 مل.
  8. استخدام الثلاجة من الدرجة التي تسيطر عليها، البرنامج 1، لتجميد أسفل aliquots من اللقاحات DC ونقل على الفور إلى مرحلة البخار من الفريزر النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.

7. الكثير اختبار الإصدار

  1. يجب أن يتم تقييم كل دفعة من لقاح العاصمة وتلبية معايير الافراج عن الكثير محددة (الجدول 1) قبل إصدارها للحقن في المرضى في الدراسة، وعادة بعد 5-6 أسابيع تحضير لقاح.
  2. جدوى:تقييم جدوى لقاح DC باستخدام عداد الخلية الآلي. الحد الأدنى من مواصفات السلامة المقبول هو> 70٪.
  3. الهوية: تقييم هوية البلدان النامية الناضجة (CD11c و+ CD14-CD83 +) من قبل التدفق الخلوي. النسبة المئوية للخلايا + CD11c و> يجب أن يكون 50٪. النسبة المئوية للCD11c و+ CD14 + خلايا وينبغي أن يكون <30٪ ونسبة CD11c و+، CD14، وينبغي أن تكون CD83 + الخلايا> 50٪.
  4. العقم: اختبار لقاح العاصمة عن وجود البكتيريا اللاهوائية والهوائية والفطريات عن طريق الثقافة المباشر والبقع غرام. تقييم لوجود الميكوبلازما باستخدام نظام الثقافة المباشر والحمض النووي تألقي الفحص تلطيخ مع خط الخلية المؤشر. لهذه الاختبارات، والحد الأدنى لمجموعة المواصفات هو أنه لا يوجد نمو لوحظ من جميع الثقافات.
  5. الذيفان الداخلي: تقييم محتوى الذيفان الداخلي باستخدام الحركية-QCL الحركية مقايسة LAL مولد اللون ويجب أن يكون <50 الاتحاد الأوروبي / مل لتلبية الحد الأدنى من المعايير.
    6. وظيفة: تقييم وظائف DC في تفاعل اللمفاويات مختلطة من قبل الحضانة مع الخلايا T خيفي. وتفيد التقارير وجود انتشار بالمقارنة مع البلدان النامية unstimulated (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ما بين 10 - 20٪ من PBMCs بدءا تفرق في البلدان النامية في نهاية فترة التربية. البلدان النامية الناضجة هي CD11c و+، CD14، CD83 +، CD40 +، وCCR7 + (الشكل 1). وهم يعربون عن مستويات عالية من فئة MHC الأول والثاني جزيئات والجزيئات costimulatory CD80 CD86 و. أيضا بفعل بولي ICLC مستويات أقل من PDL-1 بالمقارنة مع غيرها من منبهات TLR 14. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذه البلدان النامية تفرز كميات كبيرة بولي IC-نضجت من IL-12 (الشكل 2 و 15،16) وتحفز تكاثر الخلايا T خيفي (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. النمط الظاهري ممثل من DCS متباينة تماما نضجت مع بولي IC. وكانت جميع البلدان النامية على بوابات إلى الأمام والجانب مبعثر مؤامرة. وقد تم تحديد البلدان النامية علىق CD11c و+ وCD14. نضوج DC في استجابة لبولي ICLC تم تقييم (خط عريض) على أساس التعبير عن CD83، CD40، وCCR7 وبالمقارنة مع البلدان النامية unstimulated (الظل الرمادي). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. نضجت البلدان النامية مع بولي IC إنتاج مستويات عالية من السيتوكينات. جمعت Supernatants من البلدان النامية متباينة من 3 المتبرعين الأصحاء بعد نضوج بين عشية وضحاها من DCS مع بولي IC. تم قياس السيتوكينات التي تنتجها خلوى صفيف الخرزة (CBA) السيتوكينات الالتهابية الإنسان كيت (العلوم البيولوجية دينار بحريني) والذي يقيس IL-12p70، TNF، IL-10، IL-6، IL-1β، وIL-8.

الشكل (3) RC = "/ files/ftp_upload/50085/50085fig3.jpg" />
الشكل (3). نضجت البلدان النامية مع بولي ICLC لحث على انتشار الخلايا T خيفي. بولي ICLC-نضجت وحضنت البلدان النامية من المتبرعين الأصحاء 01:10 Carboxyfluorescein مع ثنائي الأسيتات Succinimidyl استر (CFSE) المسمى خلايا T خيفي. بعد 6 أيام، والانتشار (A) تم تقييمها من قبل التدفق الخلوي بواسطة تبوب على CD3 + الخلايا التائية السكان. معارض X-محور التخفيف من CFSE، كمقياس الانتشار، في مختلف الظروف الثقافة المشتركة: خلايا T وحده، unstimulated DC، بولي ICLC حفز العاصمة، وphytohaemagglutinin خلايا T (PHA) حفز. إفراز خلوى (B) خلال انتشار تم تقييم من supernatants في الثقافات باستخدام BD CBA الإنسان Th1/Th2 خلوى كيت الثاني (العلوم البيولوجية دينار بحريني) والذي يقيس IFNγ، TNF، IL-10، IL-6، IL-4 و IL-2. ويرد IFNγ فقط كما لم يتم الكشف عن السيتوكينات الأخرى إلى مستويات قابلة للقياس في مقايسة./ / www.jove.com/files/ftp_upload/50085/50085fig3large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

اختبار طريقة المعايير
الجدوى الجوافة خلية التحليل الشخصية مع الكاشف ViaCount > 70٪
هوية التدفق الخلوي -٪ CD11c و+ الخلايا > 50٪
التدفق الخلوي -٪ CD11c و+ CD14 + الخلايا <30٪
التدفق الخلوي -٪ CD11c و+ CD14-CD83 + الخلايا > 50٪
عقم الثقافات البكتيرية والفطرية سلبي
خلية ثقافة مباشر: الميكوبلازما سلبي
سم داخلي المنشأ الحركية اللونية LAL الفحص <50 الاتحاد الأوروبي / مل
وظيفة رد فعل الخلايا الليمفاوية المختلطة تقرير النتائج

الجدول 1. معايير الافراج عن الكثير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المرحلة الأولى والثانية وقد أظهرت التجارب السريرية من DCS الوحيدات المستمدة أنها تحفز الاستجابات المناعية في المرضى لكن النجاح كان محدودا السريرية 1. قد يكون هذا يرجع جزئيا إلى عدم وجود توافق في الآراء بشأن كيفية توليد البلدان النامية الأمثل للاستخدام immunotherapeutic الورم. على الرغم من أن هناك طرق عديدة لتوليد البلدان النامية السريرية الصف، وهذه الأساليب تختلف من حيث استخدام السيتوكينات تستخدم للتمييز بين وحيدات، والمحفزات المستخدمة للحث على النضج، وطرق التحميل مستضد. الصيغة لتوليد البلدان النامية الأمثل لا يزال يتعين تعريف 2.

وقد أظهرت الدراسات الأخيرة في المختبر أن البلدان النامية نضجت مع كوكتيل من السيتوكينات proinflammatory 10 والتي تم استخدامها في معظم التجارب السريرية، وخصوصا وجود PGE2، ربما حمل تمايز الخلايا التنظيمية T والاستجابات TH2 17، صريحة IDO 18، وتعاني من نقص في IL-12p70إنتاج 19. هذه الآثار تقوض بشكل كبير قدرة اللقاح للحث على الاستجابات المناعية، وبالتالي دعم الحاجة إلى تقييم الأساليب البديلة من البلدان النامية تستحق في أجل تعظيم آثارها في الجسم الحي.

استخدام منبهات TLR، ولا سيما TLR 3 ناهض بولي IC، إلى أن تنضج في البلدان النامية قد تؤدي إلى تحسين الفعالية السريرية من البلدان النامية. في المختبر أظهرت الدراسات أن البلدان النامية بولي IC-نضجت الاحتفاظ التعبير عالية مستقرة من جزيئات MHC وCD83 و جزيئات costimulatory CD40، CD80، CD86 و14،15،20. تنتج البلدان النامية بالإضافة إلى ذلك، بولي IC-نضجت مستويات عالية من IL-12 14،16،20، وهو خلوى هامة لتوليد استجابة المضادة للورم 21، وكذلك السيتوكينات proinflammatory الأخرى مثل TNF-α، IL-6، IL-1β، IP-10، والنوع الأول الإنتيرفيرون 14. الأهم من ذلك، كما لم تظهر في نماذج الفئران ورم، البلدان النامية نابض مع فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) المستضدات ونضجت ثكانت إيث بولي IC-معبي السامة للخلايا استجابات الخلايا T قادرة في القضاء على تأسيس HPV16، معربا عن الأورام 22. كما وضع نضوج البلدان النامية ووجود IL-12 ويبدو أن ترتبط فعالية في التجارب السريرية 23،24، واستخدام بولي IC إلى البلدان النامية الناضجة قد تكون خطوة هامة نحو تحقيق هدف النجاح السريري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

قد وردت في كتاب الدعم المالي من الجهات التالية: المعاهد الوطنية للصحة (AI061684، AI071078، AI044628، وK08 AI084578 (ميلر))، ومؤسسة بيل وميليندا غيتس، مؤسسة دوريس ديوك الخيرية، معهد بحوث السرطان، التحالف من أجل أبحاث مرض الذئبة، والزمرد مؤسسة. نينا بهاردواج هو coinventor على براءات الاختراع المتعلقة بإعداد واستخدام الخلايا الجذعية لمعالجة الحصانة. الكتاب ليس لديهم انتماءات الأخرى ذات الصلة أو المشاركة المالية مع أي منظمة أو كيان له مصلحة مالية في الصراع أو المالية مع الموضوع أو المواد التي نوقشت في مخطوطة وبصرف النظر عن تلك المفصح عنها.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر اندريس سالازار (Oncovir، وشركة) للهدية من بولي ICLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 medium with L-glutamine BioWhittaker 12-702F
1M HEPES buffered saline BioWhittaker 17-737E
Phosphate buffered saline (PBS) BioWhittaker 17-516F
Human albumin, 25% solution USP Aventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUM GE Healthcare 17-5442-03
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Sterile saline USP Hospira
CryoMACS DMSO Miltenyi Biotec 170-076-303
Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml Berlex A02266
MACS GMP IL-4 Miltenyi Biotec 170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml Oncovir NA
VACMUNE KLH Biosyn
225 sq cm EasyFlasks Nalgene Nunc 159934
Falcon 6-well tissue culture plates Becton Dickinson 353046
1.8 ml CryoTube vials Nalgene Nunc 377267
Controlled Rate Freezer Thermo CryoMed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
  2. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
  3. Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, Suppl 2. 1-2 (2001).
  4. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  5. Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
  6. Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
  7. O'Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
  8. de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
  9. Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
  10. Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, Suppl 4. A8-A22 (2002).
  11. Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
  12. Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants? Cancer J. 16, 382-391 (2010).
  13. Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
  14. Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
  15. Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
  16. Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
  17. Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
  18. Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
  19. Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
  20. Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
  21. Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
  22. Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
  23. Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
  24. Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).

Tags

بيولوجيا السرطان، العدد 78، الطب، علم المناعة، علم الأحياء الجزيئي، علم الأحياء الخلوي، الهندسة الطبية الحيوية، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، والخلايا الجذعية، والخلايا الجذعية، الخلايا الجذعية، الخلايا الجذعية، لقاح، الخلية، والعزلة، التدفق الخلوي، ثقافة الخلية، وتقنيات السريرية
إعداد ورم مستضد محملة الخلايا الجذعية الناضجة لعلاج مناعي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabado, R. L., Miller, E.,… More

Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), e50085, doi:10.3791/50085 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter