Summary
종양 면역 요법에 사용하기 위해자가 수지상 세포의 큰 숫자 (DCS)를 생성하기위한 가장 일반적으로 사용되는 방법을 설명합니다. 방법은 단핵 세포에서 수지상 세포를 분화하는 IL-4, GM-CSF를 사용합니다. 그들은 환자에게 다시 주입하기 전에 미성숙 수지상 세포는 성숙하고 항원과 함께로드를 자극한다.
Abstract
임상 연구는 항원 -로드 DC 백신은 안전하고 종양 1 유망한 치료 것을 설치하는 동안, 그들의 임상 효능은 확립되어야 남아있다. 이 방법은, 좋은 제조 공정 (GMP) 지침에 따라 준비, 아래에 설명 된 임상 연구 2 수지상 세포의 큰 숫자를 생성하기위한 가장 일반적인 전직 생체 제조 방법의 최적화입니다.
우리의 방법은 합성 TLR 3 작용제 수지상 세포를 자극하는 Polyinosinic-Polycytidylic 산성 폴리-L-라이신 카복시 메틸 셀룰로오스를 (폴리 ICLC)를 사용합니다. 우리의 이전 연구는 CD83과 CD86, 인터루킨-12의 유도 (IL-12), 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론 감마 유도의 상향 조절에 의해 평가로 폴리 ICLC 인간 DC에 대한 가장 강력한 개인의 성숙 자극이다 설립 단백질 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) 및 유형 I 인터페론 (IFN), 그리고 최소한의 인터루킨 10 (IL-10) 생산. 수지상 세포는 채집 술에 의해 얻어진 림프구가 냉동 말초 혈액 단핵 세포 (말초 혈액)에서 차별화된다. 말초 혈액을 Ficoll 기울기 원심 분리하여 분리 및 분취에 고정되어 있습니다. 1 일에서 말초 혈액을 해동하고 ° C에서 조직 문화 인큐베이터 37 1-2 시간 배양 한 후 플라스틱 표면에 부착 단핵구를 위해 선택하는 조직 문화 플라스크에 도금. 배양 후 림프구는 씻어하고 부착 단핵 세포는 인터루킨-4의 존재 (IL-4)와 미성숙 수지상 세포로 분화하는 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 5 일 동안 배양한다. 6 일에, 미성숙 수지상 세포는 백신의 품질에 대한 관리 역할 및 백신 3의 면역 원성을 높일 수있는 열쇠 구멍 삿갓 조개 헤 모시 아닌 (KLH) 단백질과 펄스 있습니다. 수지상 세포는 성숙 자극 펩티드 항원로드 하룻밤 배양한다. 7 일에 세포를 세척하고 포함 1 ML의 분주에 냉동4 - 제어 속도 냉동고를 사용하여 20 X 10 6 세포. 수지상 세포의 배치를위한 방출 시험이 수행되고 그들이 환자에 주입되기 전에 최소 사양을 충족해야합니다.
Protocol
1. 말초 혈액 4의 분리 및 냉동
- 무균 스파이크 플라즈마 전송 집합을 사용하여 leukapheresis 부대에있는 액세스 포트 중 하나입니다. 60 ML의 주사기를 사용하여 멸균 500 ML 병에 환자로부터 얻은 leukapheresis를 전송합니다.
- 상온 RPMI를 사용하여 원래 볼륨을 2 배 leukapheresis의 볼륨을 조정합니다. 철저하게 섞는다.
- 부드럽게 Ficoll-Paque PLUS의 병을 섞는다. 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 12 ML Ficoll-Paque PLUS를 추가합니다.
- Ficoll을 포함하는 각 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 희석 leukapheresis 제품의 부드럽게 층 30 ML. Ficoll과 세포 현탁액 사이의 인터페이스를 방해하지 않도록주의하십시오.
- leukapheresis의 모든 계층 될 때까지 단계 1.3 및 1.4를 반복합니다.
- 없이 브레이크와 실온에서 20 분간 1,000 × g에서 50 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기.
- 조심스럽게 각 튜브 및 transfe에서 말초 혈액의 흐림 층을 수확새로운 멸균 50 ML 튜브에 대한 연구.
- 50 ML의 최종 볼륨에 각 튜브에 RPMI를 추가합니다. 반전에 의해 부드럽게 섞는다.
- 4 10 분 ° C 풀 브레이크를 위해 500 × g에서 세포를 원심 분리기.
- 각 튜브에서 상층 액을 제거합니다. 각 튜브에서 세포 펠렛을 Resuspend하고 50 ML의 최종 볼륨에 RPMI를 추가합니다. 반전에 의해 부드럽게 섞는다.
- 4시 6 분 ° C.에 대한 500 × g에서 세포를 원심 분리
- 각 튜브에서 상층 액을 제거합니다. 를 Resuspend 한 50 ML 원뿔 튜브에 함께 풀 세포 현탁액.
- 위로 더 RPMI 50 ML에 풀 말초 혈액의 양을 가져옵니다. 반전에 의해 부드럽게 섞는다.
- 4시 6 분 ° C.에 대한 300 × g에서 세포를 원심 분리
- 상층 액을 제거합니다. 50 ML RPMI에있는 세포 펠렛을 resuspend. 균일 한 세포 현탁액을 보장하기 위해 부드럽게 섞는다.
- 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다.
- 300에서 세포를 원심 분리4시 6 분 × g ° C. 냉동 매체를 준비합니다. 인간 AB 혈청 (밸리 생명)에서, 냉동 매체는 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO있는 Miltenyi Biotec은)으로 구성되어 있습니다.
- 상층 액을 제거합니다. 2 × 10 8 세포 / 차가운 냉동 미디어 ML의 최종 농도에서 세포를 resuspend을.
- 1.8 ML의 cryovials 1 ML의 aliquots을 확인합니다.
- 제어 속도 냉동실에 cryovials를 전송하고 동결 실행, 프로그램 시작 1. 실행의 끝에, 즉시 액체 질소 냉동고의 기상에 냉동 cryovials를 전송합니다.
2. 일 0 단핵구에서 수지상 세포의 분화
- 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 30 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장을 추가합니다.
- 37 ° C의 물을 욕조에서 교반하여 냉동 말초 혈액의 해동 분주. 완전히 해동 할 때, 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 튜브의 내용을 전송합니다. 철저하게 섞는다.
- 6 분 동안 세포를 원심 분리상온에서 500 × g에서. 상층 액을 제거하고 RPMI / 1 %자가 혈장의 작은 볼륨 펠렛 세포를 resuspend을. 다음 50 ML의 최종 볼륨에 더 RPMI / 1 %자가 혈장을 추가합니다. 철저하게 섞는다.
- 500 6 분 × g, 실온에서 다시 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 50 ML RPMI / 1 %자가 혈장 펠렛을 resuspend을. 철저하게 섞는다.
- 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다.
- 판 1.40 40 RPMI의 ML / 225cm 2 EasyFlask 위에 1 %자가 혈장에서 x 10 8 세포. 모든 세포가 도금 될 때까지 반복합니다.
- 1 옆으로 납작 EasyFlasks 품다 - 37 2 시간을 ° C 조직 문화 인큐베이터는 단핵구가 술병을 준수 할 수 있도록 5 % CO 2를 포함합니다.
- 배양이 완료되면, 인큐베이터에서 EasyFlask을 제거하고 비 부착 세포에게 USI 제거를 두 번 세척prewarmed RPMI의 NG 30 ML.
- 두 번째 세척 후, 400-1,000 IU / ML IL-4, 100-1,000 IU / ㎖ GM-CSF 5-8 40 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장을 추가합니다. 이 프로토콜에 대한, 우리는 400 IU / ML IL-4, 100 IU / ㎖ GM-CSF를 사용하고 있습니다.
- 37 2 일간 EasyFlasks을 품어 ° 조직 문화 인큐베이터에서 C가 5 % CO 2를 포함.
3. 주 2 : IL-4, GM-CSF와 수지상 세포의 먹이
- 각 EasyFlask에 400-1,000 IU / ML IL-4, 100-1,000 IU / ㎖ GM-CSF와 4 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장을 추가합니다. 소용돌이 옆으로 흔들어 섞는다.
- 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 5 % CO 2를 포함에서 더보기 3 일 EasyFlasks을 (5 일까지) 품어.
4. 5 일 : 미성숙 수지상 세포의 수확
- 적극적 플라스크 소용돌이에 의해 비 부착 느슨하게 자기편 세포를 resuspend을하고 위아래로 pipetting하여 문화를 수확. 를 전송새로운 50 ML 원뿔 튜브에 수확 세포.
- 상온에서 6 분간 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 50 ML RPMI / 1 %자가 혈장에있는 세포 펠렛을 resuspend. 철저하게 섞는다.
- 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다.
- 상온에서 6 분간 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 플레이트 1-2 × 10 400 IU / ML IL-4 및 6 - 잘 조직 배양 플레이트에 100 IU / ㎖ GM-CSF 3 ML RPMI / 1 %자가 혈장에서 잘 당 6 셀.
- 37 접시를 품어 ° C는 조직 문화 인큐베이터 2 밤새 5 % CO를 포함.
5. 6 일 : 수지상 세포의 성숙과 항원 로딩 중
- 10 ㎍ / ㎖ KLH에 6 자 문화 접시에있는 우물의 1 / 3 추가 할 수 있습니다. 소용돌이 판 섞어. KLH는 첫 번째 DC 백신에 사용되기 때문에 KLH는 우물의 1 / 3에 추가됩니다. 이후 DC 백신 콘만 종양 항원 펩티드를 테인.
- 수지상 세포는 다양한 자극을 사용하여 성숙 자극 할 수 있습니다. 임상 연구에 사용 된 가장 일반적인 성숙 자극 크린 시토 킨의 칵테일 (TNFα, IL-1 β, 및 IL-6)과 프로스타글란딘 E2 (PGE 2) 9,10왔다. 더 최근에, 수신자 같은 수용체 (TLR) 작용제의 사용은 인기 11,12를 얻고있다. 이 프로토콜에서는, 우물 2 MG / ML Polyinosinic-Polycytidylic 산성 폴리-L-라이신 카르복시 메틸 (폴리 ICLC)를 추가하고 잘 섞는다. 폴리 ICLC 폴리-L-*-라이신 및 카르복시 메틸 셀룰로오스 (Oncovir, 주식 회사에 의해 제조)로 안정화 폴리 IC의 임상 등급 정립이다.
- 각 잘 간 경쟁 13을 피하기 위해 단일 펩티드를 받고, 그 지정 우물에 100 ㎍ / ㎖ 긴 펩티드 항원 (NY-ESO-1 및 / 또는 Melan-A/MART-1)를 추가합니다.
- 37 접시를 품어 조직 문화 인큐베이터는 5 % CO를 포함 10 ° C <서브> 2 O / N.
6. 7 일 : 수지상 세포의 냉동 보존
- 자가 혈장과 10 % DMSO를 사용하여 DC 냉동 솔루션을 준비합니다. 모든 미립자 물질을 제거하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 2,000 DC 냉동 솔루션 × g의 원심 분리기. 새로운 라벨 15 ML 원뿔 튜브에 뜨는을 전송합니다. 4에서 보관 ° 사용까지 C.
- 하룻밤 배양이 완료되면, 수확 및 수영장 50 ML 원뿔 튜브에 펩타이드와 펄스 DC가 포함 된 모든 우물.
- 6 분 동안 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거합니다. 5 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장에있는 세포 펠렛을 resuspend. 최대 RPMI / 1 %자가 플라즈마 50ml로 전체 볼륨을 가져와. 철저하게 섞는다.
- 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다.
- 상온에서 6 분간 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 5 ML steri의 각 펠렛을 resuspend을르 0.9 % 염화나트륨, USP 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송. 더 멸균 0.9 % 염화나트륨, USP와 함께 14 ML 각 세포 현탁액을 가져옵니다. 반전에 의한 모자 및 섞는다.
- 이전 단계를 두 번 반복합니다. 마지막으로 원심 분리 한 후 펠렛을 방해하지 않고 최대한 가까이 세포 펠렛을 받고, 상층 액을 제거하십시오.
- 4시에 DC 냉동 용액에 세포 펠렛을 Resuspend - 20 X 10 6 세포 / 각 1.8 ML의 CryoTube 유리 병에 ML 및 나누어지는 1 ML.
- DC 백신의 분주을 동결하고 장기 저장을위한 액체 질소 냉동고의 기상으로 즉시 전송, 제어 속도 냉장고, 프로그램 사용 1.
7. 많은 릴리스 테스트
- DC 백신의 각 배치를 평가하고 일반적으로 5~6주 백신 준비 후 연구에서 환자에 주입 해제되기 전에 특정 로트 출하 기준 (표 1)을 만족해야합니다.
- 생존 :자동 셀 카운터를 사용하여 DC 백신의 가능성을 평가한다. 최소 허용 가능성 사양> 70 %이다.
- 식별 : 유동 세포 계측법에 의해 성숙 수지상 세포 (CD11c + CD14-CD83 +)의 신원을 평가합니다. CD11c의 + 세포의 비율> 75 %이어야한다. CD11c + 및 CD14 + 세포의 비율이되어야합니다 <30 % CD11c의 비율 +, CD14-, 및 CD83 + 세포가 있어야한다> 75 %.
- 불임 : 직접 문화 그램 얼룩에 의한 혐기성과 호기성 세균과 곰팡이의 존재에 대한 테스트 DC 백신. 직접 배양 시스템 및 지표 세포주 DNA 형광 염색 분석을 사용하여 마이코 플라스마의 존재를 평가한다. 이러한 테스트의 최소 사양 집합은 성장이 모든 문화에서 관찰되는 것입니다.
- 독소 : 운동-QCL 운동 발색 LAL 분석을 사용하여 독소의 내용을 평가하고 최소한의 기준을 충족 <50 EU / ML해야합니다.
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Representative Results
10 사이 - 시작 말초 혈액의 20 %는 문화 시대의 끝에서 수지상 세포로 분화. 성숙 수지상 세포는 CD11c 있습니다 +, CD14-, CD83 +, CD40 +, 및 CCR7 + (그림 1). 그들은 MHC 클래스 I 및 II 분자와 보조 자극 분자 CD80 및 CD86의 높은 수준을 표현한다. 다른 TLR 길항제 (14)에 비해 폴리 ICLC는 PDL-1의 낮은 수준을 유도. 또한 이러한 폴리 IC-성숙 수지상 세포 분비 큰 IL-12의 양의 (그림 2, 15,16)과 동종 T 세포 (그림 3)의 확산을 유도.
그림 1. 완전히 차별화 된 수지상 세포의 대표적인 표현형 폴리 IC와 성숙. 모든 수지상 세포는 앞으로 및 측면 산점도에 문이 있었다. 수지상를 발견했다의 CD11c + 및 CD14 -. 폴리 ICLC 님의 질문에 답변 수지상 세포의 성숙 (굵은 선) CD83, CD40, 및 CCR7의 발현에 따라 평가하고 자극받지 않은 수지상 세포 (회색 음영)을 비교 하였다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 수지상 세포는 사이토 카인의 높은 수준을 생산 폴리-IC와 성숙 3. 건강한 기증자 차별화 된 수지상 세포의 상층 액은 폴리 IC와 수지상 세포의 하룻밤 숙성 후 수집 하였다. 생성 된 사이토 카인 사이토 카인 비드 배열 (CBA)에 의해 측정 된 인간의 염증성 사이토 카인 IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1β, 그리고 IL-8 측정 키트 (BD Biosciences의).
RC는 = "/ files/ftp_upload/50085/50085fig3.jpg"/>
그림 3. 수지상 세포는 동종 T 세포의 증식을 유도 폴리 ICLC으로 성숙. 폴리 ICLC 숙성 건강한 기증자로부터 수지상 세포가 Carboxyfluorescein 디아 석신 에스테르 (CFSE) 표시 동종 T 세포와 1:10 배양 하였다. 육일 후, 증식 (A)는 CD3에 게이트 + T 세포 인구 유동 세포 계측법에 의해 평가되었다. X 축, 확산의 측정으로, CFSE의 희석을 표시하는 다양한 공동 배양 조건 : T 세포 형, DC, 폴리 ICLC 자극 DC 및 phytohaemagglutinin (PHA) 자극 T 세포를 자극받지. 사이토 카인 분비 (B) 확산 과정 BD CBA 인간 IFNγ를 측정 Th1/Th2 사이토 카인 키트 II (BD Biosciences의), TNF, IL-10, IL-6, IL-4를 사용하여 문화의 상층 액에서 평가하고 있었다 IL-2. 다른 사이토 카인이 분석에서 측정 가능한 수준으로 검출되지 않았다로만 IFNγ가 표시됩니다./ / www.jove.com/files/ftp_upload/50085/50085fig3large.jpg "대상 ="_blank "는> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 테스트 | 방법 | 기준 |
| 생존 능력 | ViaCount 시약과 구아바 개인 세포 분석 | > 70 % |
| 정체 | 유동 세포 계측법 - % CD11c + 세포 | > 75 % |
| 유동 세포 계측법 - % CD11c + CD14 + 세포 | <30 % | |
| 유동 세포 계측법 - %의 CD11c + CD14-CD83 + 세포 | > 75 % | |
| 불임 | 세균 및 진균 배양 | 부정 |
| 마이코 플라스마 : 직접 세포 배양 | 부정 | |
| 독소 | 운동 발색 LAL 시험 법 | <50 EU / ㎖ |
| 기능 | 혼합 림프구 반응 | 결과보고 |
표 1. 많은 자료 기준.
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Discussion
단계 I 및 II는 단핵구 유래 수지상 세포의 임상 시험은 환자 그러나 임상 적 성공은 1 제한되었습니다에 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났습니다. 이 종양 immunotherapeutic 사용을위한 최적의 수지상 세포를 생성하는 방법에 대한 합의의 부족으로 인해 부분적으로 할 수 있습니다. 임상 등급 수지상 세포를 생성하는 여러 가지 방법이 있지만,이 방법은 단핵 세포 성숙을 유도하는 데 자극 항원 로딩하는 방법을 구분하는 데 사용되는 사이토 카인의 사용 조건에 따라 다릅니다. 최적의 수지상 세포를 생성하는 수식은 여전히 2 정의 할 수 남아 있습니다.
체외 연구에서 최근의 수지상 세포는 임상 시험의 대부분에 사용 된 염증성 사이토 카인 (10)의 칵테일 성숙 특히 PGE2의 존재가, 규제 T 세포와 Th2 사이토 응답 17, 급행 IDO의 분화를 유도 할 수있는 것으로 나타났습니다 18 및 IL-12p70에 불충분생산 19. 이러한 효과는 크게 면역 반응을 유도하므로 생체에 미치는 영향을 최적화하기 위해 성숙 수지상 세포의 대체 방법을 평가하는 필요를 지원하는 백신의 능력을 훼손.
TLR 길항제의 사용은 특히 TLR 3 작용제 폴리 IC는, 폴리 IC-성숙 수지상 세포는 MHC 분자와 CD83의 안정된 표정을 유지하는 체외에서 연구 보여 주었다. 수지상 세포는 수지상 세포의 임상 효능을 향상시킬 수 있습니다 성숙하는 보조 자극 분자 CD40, CD80, 및 CD86 14,15,20. 또한, 폴리 IC-성숙 수지상 세포는 IL-12 14,16,20 높은 수준의 항 종양 반응 (21)의 생성에 중요한 사이토 카인뿐 아니라 TNF-α 등의 염증성 사이토 카인 IL-6 생산, IL-1β, IP-10, 및 유형 I은 14 IFNs. 더 중요한 것은, 같은 인간 Papilloma 바이러스 (HPV) 항원 펄스 DC가가, 생쥐 종양 모델에서 표시 및 W 성숙 된i 번째 폴리 IC-끝났다 세포 독성 T 세포 반응은 HPV16 - 표현 종양에게 22를 설립 근절 할 수 있었다. 수지상 세포의 성숙 상태와 IL-12의 존재가 임상 시험 23,24의 효과와 상관 관계를 나타나는 성숙 수지상 세포에 폴리-IC의 사용은 임상 성공의 목표를 달성하기위한 중요한 단계가 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 다음에서 재정 지원을받은 : NIH (AI061684, AI071078, AI044628, 및 K08 AI084578 (밀러)), 빌과 멜린다 게이츠 재단, 도리스 듀크 자선 재단, 암 연구소, 루퍼스 연구를위한 동맹, 그리고 에메랄드 재단. 니나 Bhardwaj는 자료 및 내성을 조작하는 수지상 세포의 사용과 관련된 특허에 coinventor입니다. 저자는 다른 관련 제휴 나 금융 관심이나 떨어져 개시된에서 원고에서 논의 된 주제 나 자료와 재무 충돌 어떤 조직이나 기업과 금융 참여가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 폴리 ICLC의 선물 안드레스 살라을 (Oncovir, 주식 회사) 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
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