Summary
O método mais vulgarmente usado para a geração de grandes números de células dendríticas autólogas (DCs), para uso na imunoterapia de tumores é descrita. O método utiliza a IL-4 e GM-CSF a partir de monócitos diferenciam DCs. As DC imaturas são estimuladas a maduro e, em seguida, carregado com os antigénios, antes de serem injectadas de novo no paciente.
Abstract
Embora estudos clínicos têm demonstrado que as vacinas DC antígeno-carregados são seguros e promissora terapia para tumores 1, sua eficácia clínica ainda não foi estabelecida. O método descrito abaixo, preparadas de acordo com as Boas Processo de Fabricação (GMP), é uma otimização do método de preparação ex vivo mais comum para a geração de um grande número de DCs para estudos clínicos 2.
Nosso método utiliza o TLR sintético 3 agonista Carboxymethylcellulose ácido poli-L-lisina Polyinosinic-Polycytidylic (Poly-ICLC) para estimular os DCs. O nosso estudo anterior estabeleceu que a poli-ICLC é o estímulo da maturação individual mais potente para DCs humanas, tal como avaliado por uma sobre-regulação de CD83 e CD86, a indução da interleucina-12 (IL-12), factor de necrose tumoral (TNF), o interferão-gama induzido proteína 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), e os interferões tipo I (IFN), e interleucina mínima 10 (IL-10) de produção. DCs são diferenciados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC congelados), obtidos por leucaferese. As PBMC são isoladas por centrifugação em gradiente de Ficoll e congelado em alíquotas. No dia 1, as CMSPs são descongelados e semeados em frascos de cultura de tecido para seleccionar os monócitos que aderiram à superfície plástica após 1-2 horas de incubação a 37 ° C na incubadora de cultura de tecido. Após a incubação, os linfócitos são lavados e os monócitos aderentes foram cultivadas durante 5 dias na presença de interleucina-4 (IL-4) e de granulócitos factor de estimulação de colónias de macrófagos (GM-CSF) para se diferenciarem para DCs imaturas. No dia 6, DCs imaturas são pulsadas com a proteína hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH), que serve como um controlo para a qualidade da vacina e pode aumentar-se a imunogenicidade da vacina contra a 3. As DCs são estimuladas a amadurecer, carregado com antígenos peptídeos, e incubadas durante a noite. No dia 7, as células são lavadas, e congelado em alíquotas de 1 ml contendo4-20 x 10 6 células, utilizando um congelador de taxa controlada. Testes de liberação de lote para os lotes de DCs é realizada e deve atender a especificações mínimas, antes de serem injetadas em pacientes.
Protocol
1. O isolamento e a criopreservação de PBMCs 4
- Assepticamente espiga de uma das portas de acesso na bolsa leucaferese utilizando um conjunto de transferência de plasma. Usando uma seringa de 60 ml, a transferência da leucaferese obtidos de pacientes em um frasco de 500 ml estéril.
- Ajustar o volume da leucaferese para 2x o seu volume original usando RPMI temperatura ambiente. Misture bem.
- Misture delicadamente a garrafa de Ficoll-Paque PLUS. Adicionar 12 ml de Ficoll-Paque Plus em tubo de 50 ml estéril.
- Suavemente camada de 30 ml do produto de leucaferese diluído a cada tubo de 50 ml estéril contendo Ficoll. Ter cuidado para não perturbar a interface entre o Ficoll e suspensão de células.
- Repita os passos 1.3 e 1.4 até que toda a leucaferese foram mergulhados.
- Centrifugar os tubos cónicos de 50 ml a 1000 × g durante 20 minutos à temperatura ambiente sem travagem.
- Colher cuidadosamente a camada turva de PBMCs de cada tubo e transfer para novos tubos estéreis de 50 ml.
- Adicionar RPMI a cada tubo para um volume final de 50 ml. Misture delicadamente por inversão.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 10 min a 4 ° C, com travão integral.
- Remove-se os sobrenadantes de cada tubo. Voltar a suspender as pelotas de células de cada tubo e adicionar meio RPMI para um volume final de 50 ml. Misture delicadamente por inversão.
- Centrifugar as células a 500 x g durante 6 min a 4 ° C.
- Remove-se os sobrenadantes de cada tubo. Ressuspender piscina e juntas as suspensões de células em um tubo de 50 ml.
- Levar o volume das CMSPs reunidas até 50 ml com mais meio RPMI. Misture delicadamente por inversão.
- Centrifugar as células a 300 x g durante 6 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular em 50 ml de RPMI. Misture com cuidado para assegurar a suspensão de células uniforme.
- Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis.
- Centrifugar as células em 300× g durante 6 min a 4 ° C. Prepare a mídia de congelamento. Meio de congelação é constituída de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO; Miltenyi Biotec) em soro AB humano (Vale Biomedical).
- Remover o sobrenadante. Ressuspender as células a uma concentração final de 2 x 10 8 células / ml em meio de congelamento frio.
- Faça alíquotas de 1 ml em criotubos de 1,8 ml.
- Transfira os criotubos no congelador de taxa controlada e começar a correr congelamento, Programa 1. No final da corrida, a transferência dos criotubos congelados imediatamente para a fase de vapor do congelador de azoto líquido.
2. Dia 0: diferenciação de células dendríticas a partir de monócitos
- Adicionar 30 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo para um tubo de 50 ml estéril.
- Alíquotas descongelamento de PBMCs congelados por agitação suave no banho de água 37 ° C. Quando completamente descongelado, transferir os conteúdos dos frascos com o tubo de 50 ml estéril. Misture bem.
- Centrifugar as células de 6 mina 500 x g à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender as células sedimentadas num pequeno volume de RPMI / 1% de plasma autólogo. Em seguida, adicionar mais RPMI / 1% de plasma autólogo até um volume final de 50 ml. Misture bem.
- Centrifugar as células mais uma vez durante 6 minutos a 500 x g à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Misture bem.
- Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis.
- Placa de 1,40 x 10 8 células em 40 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo para 225 centímetros 2 EasyFlask. Repetir até que todas as células foram plaqueadas.
- Incubar as EasyFlasks plana no seu lado para 1-2 horas a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO2 para permitir que os monócitos aderir ao balão.
- Quando a incubação estiver completa, remover o EasyFlask da incubadora e lavar duas vezes para remover as células não aderentes using 30 ml de meio RPMI pré-aquecido.
- Após a segunda lavagem, adicionar 40 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo, com 400-1.000 UI / ml de IL-4 e 100-1.000 UI / ml de GM-CSF 5-8. Para este protocolo, nós estamos usando 400 UI / ml IL-4 e 100 UI / ml de GM-CSF.
- Incubar as EasyFlasks durante 2 dias a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO 2.
3. Dia 2: A alimentação de células dendríticas com IL-4 e GM-CSF
- Adicionar 4 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo, com 400-1.000 UI / ml de IL-4 e 100-1.000 UI / ml de GM-CSF para cada EasyFlask. Misture agitando e balançando ao seu lado.
- Incubar as EasyFlasks para mais 3 dias (até ao dia 5), a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO 2.
4. Dia 5: Colheita de células dendríticas imaturas
- Colher as culturas agitando vigorosamente os frascos e pipetando cima e para baixo para voltar a suspender as células não aderentes e pouco aderente. Transferir océlulas colhidas para novos 50 ml tubos cônicos.
- Centrifugar os tubos a 500 x g durante 6 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 50 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Misture bem.
- Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis.
- Centrifugar os tubos a 500 x g durante 6 min à temperatura ambiente. Placa de 1-2 x 10 6 culas por po em 3 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo, com 400 UI / ml de IL-4 e 100 UI / ml de GM-CSF em placas de cultura de tecidos de 6 poços.
- Incubar as placas a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO 2 durante a noite.
5. Dia 6: Maturação e Antígeno Carregando de células dendríticas
- Adicionam-se 10 ug / ml de KLH a 1/3 dos poços das placas de cultura de 6 poços. Redemoinho as placas para misturar. KLH só é adicionada a 1/3 dos poços KLH porque é usado apenas para a primeira vacina DC. Subseqüente DC vacinas conTain apenas os péptidos de antigénios tumorais.
- DCs podem ser estimuladas a amadurecer com diferentes estímulos. Os estímulos de maturação mais comum que tem sido usado em estudos clínicos, tem sido um cocktail de citocinas (IL-1 β, TNFa e IL-6) e prostaglandina E2 (PGE2) 9,10. Mais recentemente, a utilização de agonistas do receptor do tipo Toll (TLR) ganharam popularidade 11,12. Neste protocolo, adicionar 2 mg / ml de carboximetilcelulose em ácido poli-L-lisina-Polyinosinic Polycytidylic (Poli-ICLC) aos poços e misturar bem. Poli-ICLC é a formulação clínica grau de poli-CI que é estabilizado com poli-L-*-lisina e carboximetilcelulose (fabricado pela Oncovir, Inc.).
- Adicionam-se 100 ug / ml de antigénios peptídicos longas (NY-ESO-1 e / ou Melan-A/MART-1) designados para os seus poços, cada poço recebe apenas um único péptido a evitar competição cruzada 13.
- Incubar as placas a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO <sub> 2 S / N.
6. Dia 7: Criopreservação de células dendríticas
- Preparar a solução de congelamento DC usando plasma autólogo e 10% DMSO. Centrifugar a solução de congelação DC a 2000 × g durante 20 min a 4 ° C para remover qualquer matéria em partículas. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml rotulados cónica. Armazenar a 4 ° C até utilização.
- Quando a incubação durante a noite está terminado, a colheita e piscina todos os poços que contêm as DCs pulsadas com péptidos em tubos cónicos de 50 ml.
- Centrifugar os tubos a 500 × g por 6 min. Remove-se os sobrenadantes. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Levar o volume total a 50 ml com RPMI / 1% de plasma autólogo. Misture bem.
- Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis.
- Centrifugar os tubos a 500 × g por 6 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 5 ml sterile 0,9% de NaCl, USP e transferência para novos tubos de 15 mL cónicos. Traga a cada suspensão de células para 14 ml com mais estéril a 0,9% de NaCl, USP. Tampar e misturar por inversão.
- Repetir etapa anterior por duas vezes. Após a última centrifugação, remove-se os sobrenadantes, ficando tão próximo quanto possível para as pelotas de células, sem perturbar os sedimentos.
- Ressuspender as células em peletes DC Solução de congelação em 4 - 20 x 10 6 células / ml e alíquotas de 1 ml a cada frasco 1,8 ml de tubo criogénico.
- Usar o congelador de taxa controlada, um programa, para congelar as alíquotas de vacinas DC e transferir imediatamente para a fase de vapor de um congelador de azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo.
7. Lote testes de liberação
- Cada lote de vacina DC devem ser avaliados e atender aos critérios de liberação de lote específicos (Tabela 1), antes de ser liberado para injeção em pacientes no estudo, tipicamente de 5 a 6 semanas após a preparação da vacina.
- Viabilidade:Avaliar a viabilidade da vacina DC utilizando um contador de células automatizado. A especificação mínima aceitável é de viabilidade> 70%.
- Identidade: Avaliar a identidade do DCs maduras (CD11c + CD14-CD83 +) por citometria de fluxo. A percentagem de células + CD11c deve ser> 50%. A percentagem de células CD14 + e CD11c + deve ser <30%, e a percentagem de CD11c +, CD14-e células CD83 + devem ser> 50%.
- Esterilidade: Testar a vacina DC para a presença de bactérias e fungos anaeróbio e aeróbio por cultura direta e manchas de grama. Avaliar a presença de micoplasma usando um sistema de cultura directa e ADN fluorocromo Ensaio de Coloração com a linha celular indicadora. Para estes testes, o conjunto mínimo de especificação é que não se observa o crescimento de todas as culturas.
- A endotoxina: Avaliar o teor de endotoxina utilizando o ensaio de LAL cromogénico cinético Kinetic QCL-e que deve ser <50 EU / ml para satisfazer os critérios mínimos.
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Representative Results
Entre 10 - 20% a partir de PBMCs diferenciarem em DCs no final do período de cultura. DCs maduras são CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 + e CCR7 + (Figura 1). Eles expressam altos níveis de moléculas MHC classe II, as moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 e eu e. Poli-ICLC também induziu níveis baixos de PDL-1, em comparação com outros agonistas de TLR 14. Além disso, estas DCs segregam grandes quantidades de poli-IC-maturados de IL-12 (Figura 2 e 15,16) e induzem a proliferação de células T alogénicos (Figura 3).
Figura 1. Fenótipo representante de DCs totalmente diferenciados amadureceu com Poly-IC. Todos os DCs foram fechado na frente e enredo lado de dispersão. DCs foram identificadass CD11c + e CD14-. Maturação das DCs em resposta a Poly-ICLC (linha em negrito) foi avaliada com base na expressão de CD83, CD40, e CCR7 e comparados com DCs não estimuladas (tom de cinza). Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. DCs amadureceu com Poly-IC produzir altos níveis de citocinas. Sobrenadantes das DCs diferenciadas de três doadores saudáveis foram coletadas após a maturação durante a noite de DCs com Poly-IC. As citocinas produzidas por citocinas foram medidos matriz do grânulo (CBA) Humanos citocinas inflamatórias Kit (BD Biosciences), que mede a IL-12p70, TNF, IL-10, IL-6, IL-1β, e IL-8.
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Figura 3. DC amadureceu com poli-ICLC induzir a proliferação de células T alogénicas. Poli-ICLC amadurecido DCs provenientes de dadores saudáveis foram incubadas com 1:10 diacetato de carboxifluoresceína Succinimidilo Ester (CFSE) marcadas com células T alogénicas. Após 6 dias, a proliferação (D) foi avaliada por citometria de fluxo, por propagação em células CD3 + a população de células T. Eixo dos X mostra a diluição de CFSE, como uma medida da proliferação, em várias condições de co-cultura: células T isoladamente, não estimulada, DC, poli-ICLC estimulada DC, e as células T (PHA) estimulada fitohemaglutinina. Secreção de citocinas (B) durante a proliferação foi avaliada a partir dos sobrenadantes das culturas, utilizando o BD CBA Humano das citocinas Th1/Th2 Kit II (BD Biosciences), que mede IFNy, TNF, IL-10, IL-6, IL-4, e IL-2. Apenas IFNy é mostrado como as outras citocinas não foram detectados em níveis mensuráveis no ensaio./ / Www.jove.com/files/ftp_upload/50085/50085fig3large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver a figura maior.
| Teste | Método | Critérios |
| Viabilidade | Goiaba Análise celular pessoal com Reagente ViaCount | > 70% |
| Identidade | Citometria de Fluxo -% de células CD11c + | > 50% |
| Citometria de Fluxo - as células CD11c% + CD14 + | <30% | |
| Citometria de Fluxo -% CD11c células CD14-CD83 + + | > 50% | |
| Esterilidade | Culturas de bactérias e fungos | Negativo |
| Cultura de Células direto: Mycoplasma | Negativo | |
| Endotoxina | Kinetic Chromogenic LAL Assay | <50 UE / ml |
| Função | Reacção de Linfócitos Mista | Os resultados do relatório |
Tabela 1. Lote Critérios de Lançamento.
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Discussion
Fase I e II de ensaios clínicos de DCs derivadas de monócitos têm mostrado que induzem respostas imunitárias em pacientes, no entanto o sucesso clínico tem sido limitada 1. Isto pode ser em parte devido à falta de consenso sobre a forma de gerar os DCs óptimas para a utilização de imunoterapia tumoral. Embora haja várias maneiras de gerar DCs clínico grau, estes métodos variam em termos do uso de citocinas utilizadas para diferenciar os monócitos, os estímulos utilizados para induzir a maturação, e os métodos de carregamento de antigénio. A fórmula para gerar os DCs ideal ainda precisa ser definido 2.
Estudos in vitro recentes têm mostrado que as DCs amadureceu com um cocktail de citocinas pró-inflamatórias 10 que foi utilizado na maioria dos ensaios clínicos, em particular na presença de PGE2, pode induzir a diferenciação de células T reguladoras e Th2 17, expressa IDO 18, e são deficientes em IL-12p70produção 19. Estes efeitos prejudicar significativamente a capacidade da vacina para induzir respostas imunes e, portanto, apoiar a necessidade de avaliar métodos alternativos de vencimento DCs, a fim de maximizar os efeitos in vivo.
O uso de agonistas de TLR, em particular o TLR 3 agonista Poly-IC, para amadurecer as DCs podem melhorar a eficácia clínica de DCs. Estudos in vitro têm mostrado que DCs Poly-IC-maturados retida elevada expressão estável de moléculas de MHC e CD83 e moléculas co-estimuladoras CD40, CD80 e CD86 14,15,20. DCs Adicionalmente, Poly-IC-maturados produziu níveis elevados de IL-12, 14,16,20, uma citocina importante para a geração de resposta anti-tumor, 21 bem como de outras citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, IL-6, IL-1β, IP-10 e IFN tipo I 14. Mais importante, tal como foi demonstrado em modelos de tumores de murinos, DCs pulsadas com o vírus do papiloma humano (HPV), antigénios e amadurecido wrespostas de células T Poly-IC-preparado citotóxicos om eram capazes de erradicar estabelecido HPV16 expressando tumores 22. Conforme o estado de maturação de DCs e a presença de IL-12 parecem correlacionar-se com uma eficácia em ensaios clínicos 23,24, o uso de poli-IC para DCs maduras podem ser um passo importante para a consecução do objectivo do sucesso clínico.
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Disclosures
Os autores receberam apoio financeiro a partir do seguinte: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 e K08 AI084578 (Miller)), a Fundação Bill e Melinda Gates, Doris Duke Charitable Foundation, Instituto de Pesquisa do Câncer, Alliance for Lupus Research, eo Emerald Foundation. Nina Bhardwaj é um co-inventor em patentes relacionadas com a preparação e utilização de células dendríticas para manipular a imunidade. Os autores não têm outras afiliações relevantes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com interesse financeiro em ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos no manuscrito além daqueles divulgados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Andres Salazar (Oncovir, Inc.) para o dom do Poly-ICLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
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