Böjstyvhet Mätningar av Biopolymerer Använda Gliding Analyser
Summary
En metod för att mäta längden persistens eller böjstyvhet av biopolymerer beskrivs. Metoden använder en kinesin driven mikrotubulus Gliding analys för experimentellt bestämma persistens längden av individuella mikrotubuli och är anpassningsbar till aktin-baserade glidande analyser.
Abstract
Mikrotubuli är cytoskelettala polymerer som spelar en roll vid celldelning, mekanik cell och intracellulär transport. Var och en av dessa funktioner kräver mikrotubuli som är hård och raka nog för att spänna en betydande del av cellens diameter. Som ett resultat av detta har mikrotubuli uthållighet längd, ett mått på styvhet, har studerats under de senaste två decennierna 1. Trots öppna frågor återstår: korta mikrotubuli är 10-50 gånger mindre stel än långa mikrotubuli 2-4, och även långa mikrotubuli har mätt uthållighet längder som varierar med en storleksordning 5-9.
Här presenterar vi en metod för att mäta längd mikrotubuli uthållighet. Metoden är baserad på en kinesin driven mikrotubulus segelflygning analys 10. Genom att kombinera gles fluorescerande märkning av enskilda mikrotubuli med enstaka partikel spårning av enskilda fluoroforer anslutna till mikrotubuli, den gliding banor av enstaka mikrotubuli spåras med nanometer-nivå precision. Den persistens längd banorna är samma som det fortfarande längden av mikrotubulus under de förhållanden som används 11. En automatiserad spårning rutin används för att skapa banor mikrotubuli från fluoroforer bundna till enskilda mikrotubuli, och ihållande längden av denna bana beräknas med rutiner skrivna i IDL.
Denna teknik är snabbt genomförbar, och kan mäta det fortfarande längd av 100 mikrotubuli i en dag av experimenterande. Metoden kan utsträckas för att mäta persistens längd under en mångfald tillstånd, inklusive persistens längd som en funktion av längden utmed mikrotubuli. Dessutom kan analysen använda rutiner utökas till myosin-baserade verkande glider analyser för att mäta bestående längd aktin filament också.
Introduction
Cytoskelettet, ett nätverk av biopolymerer som finns i de flesta eukaryota celler, spelar en roll vid cellulär organisation, intracellulär transport, och mekanik cell. De mekaniska egenskaperna hos biopolymerer i cytoskelettet (primärt aktin och mikrotubuli) spelar en betydande roll vid bestämning av mekaniska egenskaper hos cellen som helhet 12. Eftersom hela celler mekanik kan karakterisera friska och sjuka celler 13,14 och är involverad i cellulär motilitet 15, har de mekaniska egenskaperna för de underliggande cytoskelettala komponenterna varit en aktiv område av studien under de senaste två decennierna 1.
Flexibilitet (eller styvhet) av biopolymerer kännetecknas av ihållande längd, längden av polymer som böjer av ungefär en radian enligt termiska fluktuationer vid omgivande temperatur. Ett antal tekniker har utvecklats för att mäta persistens längd 16, för exemle aktiva tekniker som innebär att böja polymeren med hydrodynamiskt flöde, optiska fällor eller elektriska fält 4,17,18 och passiva tekniker som mäter svängningarna av fria polymerer i lösning 5,6. De aktiva mätningar kräver dock speciella inställningar för att genomföra kända krafter på mikrometerskala och fria variationer mätningar kan vara en utmaning på grund av diffusion ut ur planet i fokus för den använda mikroskop.
I den här artikeln beskriver vi en kompletterande, passiv, teknik att mäta bestående längden av mikrotubuli, en cytoskelett polymer. Tekniken innebär att glidande analyser som garanterar att polymeren alltid kvar i fokalplanet 19. Dessutom handlar det om spårning enstaka fluoroforer fästa permanent till polymeren av intresse, så att specifika platser längs polymeren väl karakteriserade.
En tecknad av förfarandet visas i Figure 1. Kinesin flyttar specifikt mot + slutet av mikrotubuli, så mikrotubuli i en glidande analys drivs enkelriktat. Den främre änden av mikrotubuli, utöver fast förra kinesin, är fri att fluktuera under termiska krafter den omgivande lösningen. Då mikrotubuli drivs framåt, varierar slutet tills bindning till en ny kinesin molekyl vidare längs glasskiva fryser i en given variation. Eftersom kinesin fäster mikrotubuli mycket starkt är mikrotubuli tvingas att följa den väg den främre änden. Därför, de statistiska fluktuationerna frysta i mikrotubulus bana är desamma som de statistiska fluktuationerna i den fria änden av mikrotubuli 11, och kan därför användas för att beräkna den ihållande längd enligt 20
<img alt="Ekvation 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg" />
där l p är det fortfarande längd mikrotubuli är θ s vinkeln mellan tangenterna till banan åtskilda av en kontur längd s och <> betecknar ett genomsnitt över alla par positioner åtskilda av en kontur längd är.
Den glidande analysen själv använder kinesin biotinylerades vid upprullad spiral-21 specifikt bunden till objektglaset genom ett streptavidin-biotin-bindning. Denna fastsättning säkerställer att motorns domänerna är fritt att binda till och driva mikrotubuli. För att följa mikrotubuli banor är mikrotubuli glest märkta med organiska fluoroforer 22,23 – etiketterna skall vara gles nog att enstaka fluoroforer är upplösningen med enkel mikroskopi molekyl fluorescens. Enstaka fluoroforer spåras med hjälp rutiner bildanalys skrivna i IDL. Banorna för varje fluorofor bunden till en viss mikrofonrotubule kombineras till en sammansatt mikrotubuli bana automatiskt 24. Tangenten vinklar θ för varje punkt längs en bana beräknas, från dessa tangent vinklar <cos s> beräknas för varje kontur längd är. Slutligen är dessa data som passar till Ekv. 1 i syfte att extrahera en persistens längd för en given mikrotubuli, eller för många mikrotubuli i samma glidande analys.
Metoden är tillräckligt robust för att arbeta med mikrotubuli framställda i en mängd olika tillstånd (med olika stabiliseringsmedel eller andra små molekyler bundna till mikrotubuli, med bundna tillhörande mikrotubuli proteiner (MAP), eller med en mängd av viskösa lösningar). I vårt labb, har tekniken använts för att karakterisera det fortfarande längden av mikrotubuli som en funktion av längden längs mikrotubuli och mikrotubuli med olika stabiliseringsmedel. Den viktigaste begränsningen är att mikrotubuli måste fortfarande sTÖD kinesin motilitet. Eftersom kinesin är en robust motor enzym, är detta en ganska lös begränsning. Genom att ersätta mikrotubuli med aktin och kinesin med en myosin familj enzym, kan det fortfarande längden av aktin mätas med användning av samma teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Persistens längdmätning är en god karakterisering av de mekaniska egenskaperna hos de enskilda biopolymerer. I denna artikel, har vi beskrivit en metod för att mäta det fortfarande längden av mikrotubuli. Såsom noterats i inledningen, är denna metod lätt utsträckas till undersöka mikrotubuli mekaniska egenskaper i en mängd olika tillstånd helt enkelt genom att variera reagens, temperatur, eller viskositet i det slutliga steget av glidande analysen, 3,9, eller genom att polymerisera mikrotubuli, steg 1,1, un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Melissa Klocke för hjälp att förbereda Figur 1 och Anna Ratliff för att visa protokollet. Detta arbete stöddes av Research Corporation for Science avancemang.
Materials
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
- Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).
- Pampaloni, F., et al. Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).
- Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model. Physical review letters. 100, 028102 (2008).
- Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).
- Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).
- Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness. Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).
- Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers. Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).
- van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity. Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).
- Hua, W., Chung, J., Gelles, J. Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements. Science. 295, 844-848 (2002).
- Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. “Gliding assays” for motor proteins: A theoretical analysis. Physical review letters. 74, 330-333 (1995).
- Mehrbod, M., Mofrad, M. R. On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics. PLoS one. 6, e25627 (2011).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea. Development. 139, 2187-2197 (2012).
- Gal, N., Weihs, D. Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential. Cell biochemistry and biophysics. , (2012).
- Volokh, K. Y. On tensegrity in cell mechanics. Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).
- Kasas, S., Dietler, G. Techniques for measuring microtubule stiffness. Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).
- Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).
- Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).
- van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories. Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).
- Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. . Physical biology of the cell. , (2008).
- Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments. Nature. 373, 718-721 (1995).
- Anderson, E. K., Martin, D. S. A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules. Biotechniques. 51, 43-48 (2011).
- Hyman, A. Preparation of modified tubulins. Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Lee, I. Curve reconstruction from unorganized points. Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).
- Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nature Methods. 7, 373-375 (2010).
- Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport. Nature. 3, 552-556 (2008).
