Summary
हम कोशिकी रिकॉर्डिंग बहु इकाई invertebrate घ्राण मार्ग के पहले तीन चरणों में गंध पैदा प्रतिक्रियाओं विशेषताएँ तकनीक का बदलाव को प्रदर्शित करता है. इन तकनीकों को आसानी से अन्य तंत्रिका तंत्र में पहनावा गतिविधि के रूप में अच्छी तरह से जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
और घ्राण cues की जांच व्याख्या कई जीवों के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हैं. उल्लेखनीय है, संघो भर में प्रजातियों strikingly समान घ्राण प्रणाली का सुझाव दिया है कि संवेदन रासायनिक जैविक दृष्टिकोण विकासवादी 1 समय में अनुकूलित किया गया है. कीट घ्राण प्रणाली में, odorants एंटीना में घ्राण रिसेप्टर (ORN) न्यूरॉन्स, जो ऐक्शन पोटेंशिअल की गाड़ियों में रासायनिक उत्तेजनाओं परिवर्तित द्वारा transduced कर रहे हैं. तो antennal लोब (एक हड्डीवाला घ्राण बल्ब अनुरूप संरचना AL) ORNs से संवेदी इनपुट relayed है. 2,3, अल में odors के लिए तंत्रिका अभ्यावेदन spatiotemporal फायरिंग प्रिंसिपल (भी प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के रूप में जाना जाता है पीएन) न्यूरॉन्स की ensembles भर में वितरित पैटर्न के रूप ले. अल उत्पादन बाद में नीचे की ओर मशरूम (MB) शरीर, एक घ्राण स्मृति और 4,5 सीखने के साथ जुड़े संरचना में Kenyon कोशिकाओं (KCS) द्वारा संसाधित है. उसकेई, हम electrophysiological रिकॉर्डिंग तकनीकों पेश करने के लिए इन घ्राण सर्किट में गंध पैदा तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की निगरानी.
सबसे पहले, हम एक एकल sensillum रिकॉर्डिंग विधि 6,7 ORNs की आबादी के स्तर पर गंध पैदा की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन प्रस्तुत करते हैं. हम खारा भरा बढ़ाई इलेक्ट्रोड के रूप में शीशे pipettes का उपयोग करने के extracellularly ORN प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने पर चर्चा की. अगला, हम लिए extracellularly पी.एन. एक वाणिज्यिक 16 चैनल 3 इलेक्ट्रोड का उपयोग प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. एक समान दृष्टिकोण का उपयोग कर एक कस्टम निर्मित 8-चैनल मुड़ तार tetrode Kenyon सेल रिकॉर्डिंग 8 के लिए प्रदर्शन किया है. हम हमारे प्रयोगात्मक सेटअप और इन तकनीकों में से प्रत्येक के लिए वर्तमान प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग के निशान के विवरण प्रदान करते हैं.
Protocol
1. गंध तैयारी और डिलिवरी
- खनिज तेल में गंध समाधान मात्रा द्वारा वांछित एकाग्रता स्तर को प्राप्त करने के पतला. एक 60 मिलीलीटर कांच की बोतल में खनिज तेल और odorant की एक 20 मिलीलीटर मिश्रण स्टोर. एक रबर डाट (19 गेज), और नीचे से ऊपर से अन्य में दो सिरिंज सुई डालें, एक Inlet और एक दुकान लाइन प्रदान. इस रबर डाट के साथ कांच की बोतल सील और एक कस्टम डिजाइन सक्रिय कार्बन इनलेट लाइन (चित्रा 1 ए) के लिए फिल्टर देते हैं.
- कार्बन फिल्टर दो 6 मिलीलीटर सीरिंज का उपयोग किया जाता है. आधे में सीरिंज काटें और सवार अंत त्यागें. उन्हें साथ जोड़ने गर्मी हटना ट्यूबिंग का उपयोग करने से पहले कपास और सक्रिय लकड़ी का कोयला के साथ शेष टुकड़े में से प्रत्येक भरें.
- (Nalgene FEP टयूबिंग, 5.8 मिमी आईडी) प्लास्टिक ट्यूब (चित्रा 1B है कि एंटीना भर में एक निरंतर airflow की आपूर्ति करने के लिए गंध बोतल (polyethylene टयूबिंग, 0.86 मिमी आईडी का उपयोग कर) की दुकान लाइन कनेक्ट
- एक प्लास्टिक टिड्डी एंटीना के कुछ सेमी के भीतर रखा ट्यूब का उपयोग टिड्डी की ओर, प्रत्यक्ष कार्बन फ़िल्टर, dehumidified हवा (प्रवाह दर, 0.75 एल / मिनट वाहक गैस).
- गंध उत्तेजना के लिए, बोतल में गंध समाधान ऊपर headspace स्थिर की एक निरंतर मात्रा (0.1 एल / मिनट) विस्थापित. Dehumidified हवा के एक बराबर राशि एक पिको - पंप (डब्ल्यूपीआई, पी.वी. 820) का उपयोग कर बोतल में इंजेक्शन द्वारा हासिल की है. गंध बोतल से vapors airflow ट्यूब (चित्रा 1 बी) पर आउटलेट लाइन के माध्यम से निर्देशित कर रहे हैं.
- ~ 10 सेमी टिड्डी एंटीना के पीछे एक निर्वात कीप रखने के द्वारा वितरित गंध vapors निकालें.
2. Locust एंटीना एकल Sensillum रिकॉर्डिंग के लिए की तैयारी
- पूरी तरह से विकसित पंखों के साथ या तो सेक्स के एक टिड्डी युवा वयस्क का चयन करें, लेकिन संभोग चरण के लिए पहले एक भीड़ कॉलोनी से. टिड्डी को नियंत्रित करना, पहले अपने पैरों को काटना. ऊतक चिपकने वाला (Vetbond, 3M) के साथ विच्छेदन साइटों सील. सुरक्षित टीवह एक कस्टम डिजाइन बिजली के टेप का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग कर अपनी छाती के चारों ओर लिपटी (2A चित्रा) कक्ष टिड्डी.
- एक विच्छेदन खुर्दबीन के तहत, ऐन्टेना स्थापन के लिए मोम मंच (2A चित्रा) में एक उथले नाली बनाते हैं. नाली में एंटीना प्लेस और इसे स्थिर ऐन्टेना (चित्रा 2B; एक electrowaxer मोम के पिघलने के लिए प्रयोग किया जाता है) के दोनों सिरों पर batik मोम का उपयोग.
- छाती (~ 1 सेमी दूर सिर से) में एक जमीन इलेक्ट्रोड (chlorided चांदी के तार) डालें. दोनों सील चीरा साइट batik मोम का प्रयोग करें और जगह (2A चित्रा) में जमीन तार पकड़.
3. एकल Sensillum घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ORNs) से रिकॉर्डिंग गंध पैदा की प्रतिक्रियाओं को मॉनिटर करने के लिए
- एक stereomicroscope (Leica M205C) के तहत एक कंपन अलगाव (टीएमसी) तालिका (चित्रा 3A) पर स्थिर टिड्डी ऐन्टेना जगह. सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग sensillum के आधार स्पष्ट हैदिखाई ly (3B चित्रा).
- एक micropipette डांड़ी (Sutter P-1000) का उपयोग करने के लिए ग्लास (3-10 प्रतिबाधा MΩ जब टिड्डी साथ 9 खारा, टिप व्यास 1-3 सुक्ष्ममापी भरा) इलेक्ट्रोड एक borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब (ओवर ड्राफ्ट 1.2 मिमी, आईडी 0.69 मिमी) का उपयोग बनाना.
- ग्लास इलेक्ट्रोड एक micropipette धारक कि एक motorized micromanipulator (Sutter सांसद 285) से जुड़ा हुआ है में रखें. धीरे एक sensillum (3B चित्रा) के आधार में इलेक्ट्रोड सम्मिलित करें. ध्यान दें कि प्रत्येक sensillum टिड्डियां 10 में 3-50 ORNs शामिल कर सकते हैं.
- संकेत (10,000 बार) एक एसी प्रवर्धक (घास पी 55) का उपयोग बढ़ाना. 0.3 के बीच सिग्नल फ़िल्टर - 10.0 kHz और एक 15 kHz नमूना दर (चित्रा 3 डी) एक डाटा अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग (LabView, PCI-MIO-16E-4 DAQ कार्ड, नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स) के अधिग्रहण.
4. Locust antennal पालि और मशरूम शारीरिक रिकॉर्डिंग के लिए विच्छेदन प्रक्रिया
- Restraini का पालन करेंएनजी प्रक्रिया के रूप में 2.1 खंड में वर्णित है. चित्रा -4 ए और बी के रूप में दिखाया गया एक कस्टम डिजाइन कक्ष में टिड्डी स्थिति.
- दौरान खारा छिड़कना और विच्छेदन की प्रक्रिया के बाद, टिड्डी सिर के चारों ओर एक मोम कप का निर्माण. मोम कप मुँह भागों बस के ऊपर से शुरू करना चाहिए, और दो एंटीना के बीच मिश्रित क्षेत्र को शामिल चित्रा 4C में दिखाया आँखों से परे का विस्तार.
- एंटीना मोम कप के माध्यम से पारित करने की अनुमति के लिए, (polyethylene) प्लास्टिक टयूबिंग (5 मिमी लंबे, आईडी 0.86 मिमी) का उपयोग करते हुए दोनों पक्षों पर छोटे सुरंगों को बनाने के लिए. सुनिश्चित करें कि प्लास्टिक टयूबिंग मोम कप के माध्यम से स्लाइड कर सकते हैं. बाद एक रबर गैसकेट कि कसकर प्लास्टिक ट्यूब के आसपास wraps का उपयोग करके हासिल की है, लेकिन कप मोम (चित्रा 4C) से जुड़ी है.
- Epoxy राल, प्लास्टिक टयूबिंग के नीचे अंत करने के लिए एंटीना के आधार देते हैं. यह कदम यह सुनिश्चित करता है कि एंटीना जगह में आसपास के बाद भी आयोजित की जाती हैंछल्ली हटा दिया है.
- इस बिंदु के बाद से खारा 9 समाधान के साथ भरा मोम कप रखें. दो एंटीना (अग्रपश्च अक्ष के साथ गठबंधन आयत की लंबी पक्ष) के बीच एक केंद्रीय आयताकार क्षेत्र को हटाने के द्वारा शुरू करो. इसके बाद, एंटीना (चित्रा 4D) के आधार पर मिश्रित आँखें और छल्ली परेशान बिना पड़ोसी क्षेत्रों में छल्ली हटा दें.
- ठीक संदंश का प्रयोग, धीरे हवा की थैलियों और वसा मस्तिष्क के आसपास निकायों को हटा दें. इस चरण के अंत में, टिड्डी मस्तिष्क स्पष्ट रूप से हो सकता है (चित्रा 4D) देखा जाना चाहिए. सूचना है कि मस्तिष्क क्षेत्रों है कि घ्राण जानकारी (हल्के पीले pigmentation के साथ) की प्रक्रिया दो एंटीना के बीच स्थित हैं.
- टिड्डियां में आंत मस्तिष्क के नीचे और शरीर की लंबाई के साथ चलाता है. संभावित तैयारी को अस्थिर करने से पेट के आंदोलन को रोकने के लिए, धीरे अग्रांत्र खींचने के लिए और यह कटौती ठीक कैंची का उपयोग. पेट में एक छोटा सा चीरामलाशय ऊपर और मोटे संदंश के साथ पश्चांत्र खींच पेट को हटा दें. एक नमकीन रिसाव को रोकने के लिए तुरंत सीवन धागे के साथ चीरा साइट के लिए पूर्वकाल पेट टाई.
- एक छोटे से मोम की एक परत ठीक करने के लिए मस्तिष्क की तरक्की और इसे स्थिर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी दौरान 11 रूप में चित्रा 4D में दिखाया के साथ एक पतली लेपित तार के बने मंच का उपयोग करें.
- कीट मस्तिष्क एक पतली इन्सुलेट म्यान कि प्रयोगों के लिए पहले हटा दिया जाना चाहिए द्वारा कवर किया जाता है. Desheath मस्तिष्क, धीरे एक एंजाइम (0.3-.4 मिलीग्राम protease, सिग्मा Aldrich) की एक छोटी राशि का उपयोग कर ठीक 9 संदंश मस्तिष्क की सतह पर फैल गया. ~ एंजाइम आवेदन के 5-10 के बाद, मस्तिष्क नमक के साथ अच्छी तरह कुल्ला. सुपर ठीक संदंश का प्रयोग बहुत धीरे को चुटकी और म्यान खींच और बाद में आंसू यह रिकॉर्डिंग स्थानों (AL और एमबी, चित्रा 4E, एफ में दिखाया गया है) पर खुला.
5. Antennal पालि से बहु इकाई रिकॉर्डिंग औरमशरूम शारीरिक
- एक एक कंपन अलगाव की मेज पर रखा एक बूम स्टैंड से निलंबित stereomicroscope के तहत टिड्डी तैयारी (चित्रा 5A) रखें.
- एक प्रयोग भर में खारा छिड़काव दर (0.04 एल / घंटा) के बारे में लगातार बनाए रखें. एक chlorided चांदी खारा भरे ग्राउंड इलेक्ट्रोड के रूप में मोम कप में डूब तार का उपयोग करें.
- पी.एन. रिकॉर्डिंग के लिए, एक 16-चैनल सिलिकॉन जांच (NeuroNexus टेक्नोलॉजीज, A2x2-tet-3mm-150-150-121-A16 # आइटम, चित्रा 5 ब) का उपयोग करें. एक प्रयोग करने से पहले, 200-300 kΩ रेंज में impedances को प्राप्त करने के लिए सोने के साथ इलेक्ट्रोड बिजली से. विद्युत के लिए 7 चित्रा में दिखाया सर्किट का उपयोग करें.
- स्थिति antennal पालि की सतह के करीब इलेक्ट्रोड और धीरे यह एक मैनुअल (डब्ल्यूपीआई, M3301R) micromanipulator (चित्रा 5D) का उपयोग करने के ऊतकों में सम्मिलित है.
- ~ 10 सुक्ष्ममापी चरणों में इलेक्ट्रोड अग्रिम. हर कदम पर 2-3 मिनट रुको और के अधिग्रहण का मूल्यांकनघ संकेत गुणवत्ता. एक आदर्श रिकॉर्डिंग साइट में, कोशिकी संकेतों एकाधिक रिकॉर्डिंग चैनलों द्वारा उठाया जाएगा और एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR> 3-5 बार शोर एसडीएस) होगा.
- के.सी. रिकॉर्डिंग के लिए एक कस्टम निर्मित मुड़ तार tetrode (निर्माण, कदम दर कदम प्रक्रिया धारा 6 में प्रस्तुत चित्रा 5C) का उपयोग करें. इन इलेक्ट्रोड बिजली के रूप में 5.3 चरण में चर्चा की. एमबी (चित्रा 5E) की सतह पर tetrode प्लेस के.सी. somata के रूप में 8 एमबी की सतही परत तक ही सीमित हैं.
- दोनों पी.एन. और के.सी. रिकॉर्डिंग ही टिड्डी तैयारी से एक साथ बनाया जा सकता है के रूप में schematically चित्रा 5A में दिखाया.
- रिकॉर्डिंग स्थान पाने लिए इलेक्ट्रोड के स्थिरीकरण की अनुमति के बाद कम से कम 15 मिनट रुको.
- 15 KHz, 0.3-6 KHz के बीच फिल्टर में सभी कोशिकी संकेत अधिग्रहण, और (10,000 बार) बढ़ाना एक 16 चैनल एसी प्रवर्धक (जीवविज्ञान इलेक्ट्रॉनिक्स की दुकान, कैलटेक, पासाडेना, CA) का उपयोग (चित्रा 6A, बी).
6. के.सी. रिकॉर्डिंग के लिए मुड़ तार इलेक्ट्रोड प्रक्रियाएं
- के.सी. रिकॉर्डिंग के लिए एक बहु - इकाई इलेक्ट्रोड डिजाइन, अछूता निकल क्रोमियम (RO800, .0005 "रेशा) 8 तार का उपयोग करें.
- यदि आठ इलेक्ट्रोड वांछित हैं तो एक गत्ता 4 बार की 10-15 सेमी लंबा टुकड़ा चारों ओर तार लपेट. गत्ते के सिरों प्लास्टिक टयूबिंग के साथ कवर किया जा सकता तार काटने से किनारों को रोकने के लिए. जबकि लपेटकर, यकीन है कि वहाँ थोड़ा सुस्त है, लेकिन यह सुनिश्चित करना है कि तार तना हुआ नहीं है. तार ध्यान से संभाल के रूप में यह आसानी से टूट जाती है.
- गत्ते के शीर्ष पर तारों को एक साथ गुच्छा और टेप का एक टुकड़ा (समय टेप, टी 534 आर) का उपयोग करने के लिए उन्हें एक साथ पकड़. कट दूसरे छोर पर किस्में. तार किस्में और तारों के समूह में कटौती के रूप में अच्छी तरह से अंत में टेप का एक और टुकड़ा का उपयोग पर निकालें.
- एक अनुमापांक प्लेट हिलनेवाला (थर्मो वैज्ञानिक, 4625Q मॉडल) का प्रयोग, किस्में एक साथ हवा (~ राजस्व 72/3 के लिए न्यूनतम) मिनट के लिए एक मुड़ तार फार्म. टेप किस्में के नीचे अनुमापांक प्लेट रोटर को काटा जा सकता है और शीर्ष एक बूम स्टैंड को काटा जा सकता है. समापन के दौरान, तार थोड़ा सुस्त है, अभी तक तना हुआ नहीं होना चाहिए.
- इन्सुलेशन गर्मी (6966C Weller) बंदूक व्यक्तिगत किस्में एक साथ रहना और एक ही तार फार्म के साथ साथ पिघल. तार की लंबाई पर 3-4 धीमी गुजरता (3-4 सेकंड प्रत्येक) गर्मी और फ्यूज किस्में एक साथ करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. फिर नीचे से तार जारी है और यह आराम करने की अनुमति है. करने के लिए टेप को दूर करने के लिए सिरों के पास तार छाँटो.
- एक 5-6 सेमी लंबी, कांच केशिका ट्यूब (आयुध डिपो 1.0 मिमी, आईडी 0.58 मिमी) के माध्यम से तार का एक छोर से डालें. के अलावा एक ठीक चिमटी का उपयोग कर अंत में मुड़ तार तंग और बहुत संक्षेप में एक लौ का उपयोग अंत torching कोटिंग हटा. यह कदम सावधानी से किया जाना चाहिए, भी लंबे समय के लिए लौ तार को उजागर किस्में पिघल और उलझन का कारण होगा.
- धीरे flamed छोर पर 8 किस्में अलगएन डी मिलाप एक 8 पिन आईसी सॉकेट में प्रत्येक को अलग से किनारा. कोट epoxy के साथ आईसी गर्तिका के ऊपर जगह में किस्में और केशिका गिलास पकड़. इसके अलावा जगह (चित्रा 5C) में तार पकड़ केशिका के दूसरे छोर पर एक epoxy की एक छोटी सी बूंद जगह है.
- अंत में, केशिका सिरे से 0.5 सेमी के बारे में एक कार्बाइड कैंची के साथ 45 डिग्री के कोण पर तार की नोक में कटौती.
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Representative Results
दो अलग अलग alcohols के लिए एक एकल ORN की गंध पैदा प्रतिक्रियाओं चित्रा 3 डी में दिखाए जाते हैं. रिकॉर्डिंग स्थान के आधार पर (sensilla प्रकार, इलेक्ट्रोड की प्लेसमेंट) रिकॉर्डिंग बहु इकाई प्राप्त किया जा सकता है.
अल रिकॉर्डिंग से एक कच्चे कोशिकी तरंग 6A चित्र में दिखाया गया है. ऐक्शन पोटेंशिअल या अलग अलग पीएन से प्रारंभिक amplitudes spikes इस वोल्टेज का पता लगाने में देखा जा सकता है. हालांकि टिड्डी antennal पालि उत्तेजक प्रक्षेपण न्यूरॉन्स और निरोधात्मक स्थानीय न्यूरॉन्स है, केवल पीएन सोडियम spikes कि extracellularly 3 से पता लगाया जा सकता है उत्पन्न करते हैं. इस अवलोकन से पता चलता है कि बहु इकाई रिकॉर्डिंग तकनीक यहाँ प्रस्तुत करने के लिए चुनिंदा antennal पालि सर्किट के उत्पादन पर नजर रखने, जिससे टिड्डियां घ्राण कोडिंग के अध्ययन के लिए एक आकर्षक invertebrate मॉडल बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
एक मशरूम शरीर रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण में दिखाया गया है इन बहु इकाई रिकॉर्डिंग से एकल इकाई प्रतिक्रियाओं को अलग करने के लिए, हम बंद लाइन कील छँटाई (सबसे अच्छा चार चैनलों के साथ) प्रकाशित इगोर (Wavemetrics) प्रो 12 में लागू किया सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया. पी.एन. और केसी कील छँटाई के उदाहरण 6C, चित्रा, और डी में दिखाए जाते हैं, क्रमशः. 
चित्रा 1. गंध उत्तेजना. (ए) एक गंध की बोतल तैयार करने के लिए आवश्यक सभी घटकों को दिखाए जाते हैं. (बी) पिको पंप और गंध बोतल से गंध वितरण ट्यूब आउटलेट कनेक्शन से इनलेट कनेक्शन दिखाए जाते हैं. Desiccated हवा के एक निरंतर प्रवाह वाहक गैस धारा के रूप में प्रयोग किया जाता है और प्रयोगों के दौरान एंटीना पर निर्देशित है.
चित्रा 2. (ए) एकल sensillum रिकॉर्डिंग के लिए एक टिड्डी एंटीना की तैयारी टिड्डी एक कस्टम बनाया कक्ष में एक जमीन पेट में रखा इलेक्ट्रोड के साथ रखा गया है. (बी) के लिए एक एक मोम मंच का उपयोग एंटीना को स्थिर करने के लिए एक तरीका दिखाया गया है.
चित्रा 3. एकल sensillum रिकॉर्डिंग (ए) एक ठेठ रिकॉर्डिंग सेट अप. वाहक गैस और गंध वाष्प का एक मिश्रण एक प्रसव ट्यूब के माध्यम से आपूर्ति की है. ORN कार्रवाई की क्षमता एक गिलास इलेक्ट्रोड का उपयोग कर दर्ज कर रहे हैं. वितरित odorants एक निर्वात एंटीना के ठीक पीछे स्थित कीप का उपयोग कर हटा रहे हैं. (बी) इलेक्ट्रोड नियुक्ति के रूप में stereomicroscope के माध्यम से देखा. तीर एक sensillum के आधार पर कांच इलेक्ट्रोड टिप की नियुक्ति से संकेत मिलता है. (ग) एक स्कीमाटिक एकल sensillum रिकॉर्डिंग दृष्टिकोण के. (D) कच्चे कोशिकी वोल्टेज निशान दो अलग odors (2 octanol और 1-HEXANOL) एक ORN की प्रतिक्रियाओं दिखा.
चित्रा 4. Locust विच्छेदन प्रक्रिया (ए) एक टिड्डी स्र्द्ध और एक विच्छेदन कस्टम डिजाइन सेटअप के रूप में दिखाया गया में तैनात है. (बी) टिड्डी सिर के ऊपर से देखें. दोनों यौगिक आँखें और एंटीना को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है (सी) विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान और बाद में खारा छिड़काव की अनुमति के लिए एक मोम कप विच्छेदन स्थल के चारों ओर बनाया गया है. (डी) एक उजागर टिड्डी मस्तिष्क (पीले pigmented तंत्रिका ऊतक) दिखाया गया है. एक मंच मस्तिष्क के नीचे रखा गया है, के रूप में करने के लिए मस्तिष्क को स्थिर कर दिखाया गया है. एक खारा छिड़काव ट्यूब मोम कप से जुड़ा हुआ है. (ई) टिड्डी मस्तिष्क के एक योजनाबद्ध. (एफ) विच्छेदन स्पष्ट रूप से हित के क्षेत्रों को दिखाने के बाद टिड्डी मस्तिष्क के एक बढ़ाया छवि: एकtennal (AL) lobes और मशरूम निकायों (MB). तंत्रिका antennal (एक) अक्षतंतु बंडलों है कि एंटीना से antennal पालि ORN ऐक्शन पोटेंशिअल संचारित.
चित्रा 5. बहु antennal लोब और मशरूम शरीर से इकाई (ए) एक योजनाबद्ध रिकॉर्डिंग रिकॉर्डिंग विन्यास और गंध वितरण सेटअप दिखा. (बी) एक 16 चैनल NeuroNexus रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड दिखाया पी.एन. रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जाता है. (सी) वाम पैनल, एक कस्टम बनाया 8 चैनल मुड़ तार इलेक्ट्रोड दिखाया गया है. सही पैनल, इलेक्ट्रोड टिप और तारों के आईसी गर्तिका कनेक्शन दिखाए जाते हैं. (डी) 16-चैनल अल में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की नियुक्ति. केवल एक जूते के तल्ले का मध्य भाग में नीचे चार इलेक्ट्रोड ऊतक में डाला जाता है. (एफ) के.सी. रिकॉर्डिंग के लिए सतही MB परतों में मुड़ तार इलेक्ट्रोड की नियुक्ति दिखाया गया है.
6 चित्रा एक antennal (AL) लोब और एक मशरूम (MB) शरीर रिकॉर्डिंग से प्रतिनिधि परिणाम. (ए) एक बहु इकाई से एक कच्चे कोशिकी ट्रेस AL रिकॉर्डिंग को दिखाया गया है. एक 4 गंध नाड़ी समय ग्रे बॉक्स के संकेत की अवधि के दौरान लागू किया गया था. (बी) के इसी तरह के साजिश लेकिन एक गंध के लिए कच्चे के.सी. प्रतिक्रियाओं दिखा. (सी) पी.एन. कील छँटाई का एक उदाहरण है. एक मल्टी चैनल इलेक्ट्रोड के चार स्वतंत्र चैनल से बाह्य waveforms सभी spiking एक एकल पी.एन. से उत्पन्न होने वाली घटनाओं के लिए दिखाए जाते हैं. व्यक्तिगत घटनाओं (काला), (लाल) का मतलब है, और एसडीएस (नीला) दोनों कक्षों के लिए दिखाए जाते हैं. अपने मतलब जोड़ने लाइन पर उच्च आयामी पी.एन. घटना अभ्यावेदन (180 आयामी सदिश सभी चार इलेक्ट्रोड से 3 एमएस संकेतों concatenating द्वारा प्राप्त) द्वारा पेश प्राप्त Histograms. एक अच्छी तरह से isola पर विचार किया जाटेड इकाई के रूप में इस मामले में, क्लस्टर केन्द्रों के साथ कम से कम पांच बार शोर एसडी एक bimodal वितरण के अलावा एक साथ दर्ज 12 कोशिकाओं के हर जोड़ी के लिए उम्मीद है. (D) के.सी. कील छँटाई का एक उदाहरण दिखाया गया है.
7 चित्रा electroplating सेट अप: सर्किट के विभिन्न घटकों के बीच कनेक्शन दिखा आरेख वास्तविक सेटअप के एक चित्र के ऊपर दिखाए जाते हैं. संक्षेप में, एक समारोह जनरेटर (MCP, एसजी 1639A) से 3 हर्ट्ज वर्ग दालों (5V आयाम) एक प्रोत्साहन (डब्ल्यूपीआई, A365) अलगाने है कि फिर एक इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा परीक्षक (बक इलेक्ट्रॉनिक्स, वर्तमान की 5 μA उद्धार फाटक के लिए उपयोग किया जाता है छोटा सा भूत ) 2. प्रतिबाधा परीक्षक या तो इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा परीक्षण या अनुमति उत्तेजना अलगाने से वर्तमान दालों सोना चढ़ाना के लिए इलेक्ट्रोड के लिए लागू किया जा करने के लिए संचालित किया जा सकता है. दोनों ही मामलों में, इकाई बहु इलेक्ट्रोड im रखा हैएक अच्छी तरह से सोने के समाधान युक्त electroplating में mersed. एक स्विच इलेक्ट्रोड चैनल के चयन सोना मढ़वाया होने की अनुमति देता है.
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Discussion
अधिकांश संवेदी उत्तेजनाओं मिश्रित प्रतिक्रियाओं कि न्यूरॉन्स की ensembles भर में वितरित कर रहे हैं आह्वान. इसलिए, बहु न्यूरॉन गतिविधि के साथ - साथ निगरानी समझ कैसे प्रोत्साहन विशिष्ट जानकारी का प्रतिनिधित्व किया और मस्तिष्क में तंत्रिका सर्किट द्वारा कार्रवाई करने के लिए आवश्यक है. यहाँ, हम बहु इकाई कोशिकी रिकॉर्डिंग करने के लिए कीट घ्राण मार्ग के साथ पहले तीन प्रसंस्करण केन्द्रों पर गंध पैदा प्रतिक्रियाओं विशेषताएँ तकनीक का प्रदर्शन किया है. हमें यह ध्यान रखना है कि यहाँ प्रस्तुत तकनीक घ्राण कोडन पर पिछले अध्ययनों के एक नंबर में इस्तेमाल किया है और कर रहे हैं इस 3,6,13-17 क्षेत्र में एक मानक अभ्यास बनने. यहाँ प्रस्तुत तकनीकों का मेल एक invertebrate घ्राण प्रणाली के डिजाइन और कंप्यूटिंग के सिद्धांतों की जांच करने के लिए एक सिस्टम दृष्टिकोण विकसित कर सकते हैं. यहाँ, हम लाभदायक गाइल्स लौरेंत, मार्क Stopfer, और उनके सहयोगियों 2,3,8,9,13,16,18-21, जो इन approa बीड़ा उठाया द्वारा किए गए योगदान को पहचान चाहिएches प्रकट करने के लिए और घ्राण कोडिंग के कई मौलिक सिद्धांतों स्पष्ट.
अंत में, यह ध्यान देने योग्य बात है कि ऑप्टिकल तकनीक भी सफलतापूर्वक किया गया है कीट घ्राण 22-27 सर्किट में पहनावा गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया है. जबकि इन ऑप्टिकल तकनीक फायदेमंद हैं जब लक्ष्य के लिए एक साथ न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या में तंत्रिका गतिविधि पर नजर रखने के लिए है, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक अभी भी 'सोने के मानक' जब व्यक्तिगत कार्रवाई की क्षमता का पता लगाने के वांछित है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
उदार शुरू हुआ धन बायोमेडिकल इंजीनियरिंग विभाग से वाशिंगटन विश्वविद्यालय, सिस्टम न्यूरोसाइंस अनुदान, नौसेना अनुसंधान अनुदान के एक कार्यालय के लिए एक McDonnell सेंटर (अनुदान #: N000141210089) बीआर लेखकों के इस काम के वित्तपोषण के लिए निम्नलिखित धन्यवाद करना चाहते हैं
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrophysiology Equipment | |||
| A.C. amplifier | GRASS | Model P55 | for single sensillum recordings |
| Audio monitor (model 3300) | A-M Systems | 940000 | |
| Custom-made 16 channel pre-amplifier and amplifier | Cal. Tech. Biology Electronics Shop | for AL and MB recordings | |
| Data acquisition unit | National Instruments | BNC-2090 | |
| Fiber optic light | WPI | SI-72-8 | |
| Light source 115 V | WPI | NOVA | |
| Manual micromanipulator | WPI | M3301R | for locust brain recordings |
| Stereomicroscope1 on boom stand | Leica | M80 | for locust brain recordings |
| Stereomicroscope2 | Leica | M205C | for single sensillum recordings |
| Vibration-isolation table | TMC | 63-500 series | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP285/T | |
| Oscilloscope | Tektronix | TD2014B | |
| Electrodes/Construction Tools | |||
| 16-channel electrode | NeuroNexus | A2x2-tet-3mm-150-121 | for antennal lobe recordings |
| Borosilicate capillary tubes with filament, ID 0.69 mm | Sutter Instruments | BF120-69-10 | for making glass electrodes |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Function generator | Multimeter Warehouse | SG1639A | for gold-plating electrodes |
| Gold plating solution (non cyanide) | SIFCO Industries | NC SPS 5355 | |
| Impedance tester | BAK Electronics Inc. | IMP-2 | for gold-plating electrodes |
| Switch rotary | Electroswitch | C7D0123N | for gold-plating electrodes |
| Pulse isolator | WPI | A365 | for gold-plating electrodes |
| Q series electrode holder | Warner Instruments | 64-1091 | |
| Silver wire 0.010" diameter | A-M Systems | 782500 | ground electrode |
| 8 pin DIP IC socket | Digikey | ED90032-ND | |
| Borosilicate capillary tubes with filament, ID 0.58 mm | Warner Instruments | 64-0787 | |
| Heat gun | Weller | 6966C | |
| Rediohm-800 wire | Kanthal Precision Technologies | PF002005 | |
| Titer plate shaker | Thermo Scientific | 4625Q | twisting wires |
| Carbide scissors, 4.5" | Biomedical Research Instr | 25-1000 | for cutting twisted tetrode wires |
| Fine point tweezers | HECO | 91-EF5-SA | for teasing tetrode wires apart |
| Odor Delivery | |||
| 6 ml syringe | Kendall | 1180600777 | for custom designed activated carbon filter |
| Brown odor bottles | Fisher | 08-912-165 | |
| Charcoal | BuyActivatedCharcoal.com | GAC-48C | |
| Desiccant | Drierite | 23005 | |
| Drierite gas drying jar | Fischer Scientific | 09-204 | |
| Heat shrink tubing | 3M | EPS-200 | odor filter preparation |
| Hypodermic needle aluminum hub, gauge 19 | Kendall | 8881-200136 | for providing inlet and outlet lines for odor bottles |
| Mineral oil | Mallinckrodt Chemicals | 6357-04 | for odor dilution |
| Nalgene plastic tubing, 890 FEP | Thermo Scientific | 8050-0310 | for carrier gas delivery |
| Pneumatic picopump | WPI | sys-pv820 | for odor delivery |
| Polyethylene tubing ID 0.86 mm | Intramedic | 427421 | for odor bottle outlet connections and saline profusion tubing |
| Stoppers | Lab Pure | 97041 | for sealing odor bottles |
| Time tape | PDC | T-534-RP | |
| Tubing luer | Cole-Parmer | 30600-66 | |
| Vacuum tube | McMaster-Carr | 5488K66 | |
| Preparation/Dissection | |||
| 100 x 15 mm petri dish | VWR International | 89000-304 | |
| 18 AWG copper stranded wire | Lapp Kabel | 4510013 | |
| 22 AWG stranded hookup wire | AlphaWire | 1551 | brain platform |
| Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
| Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | |
| Electrowaxer | Almore International | 66000 | |
| Epoxy, 5 min | Permatex | 84101 | |
| Hypodermic needle aluminum hub | Kendall | 8881-200136 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | for desheathing locust brain |
| Suture thread non-sterile | Fisher | NC9087024 | for tying the abdomen after gut removal |
| Vetbond | 3M | 1469SB | for sealing amputation sites |
| Dumont #1 forceps (coarse) | WPI | 500335 | |
| Dumont #5 titanium forceps (fine) | WPI | 14096 | |
| Dumont #5SF forceps (super-fine) | WPI | 500085 | desheathing locust brain |
| 10 cm dissecting scissors | WPI | 14393 | for removing legs and wings |
| Vannas scissors (fine) | WPI | 500086 | for removing cuticle, cutting the foregut |
| Saline Profusion | |||
| Extension set with rate flow regulator | Moore Medical | 69136 | for regulating saline flow |
| IV administration set with Y injection site | Moore Medical | 73190 | for regulating saline flow |
References
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