Summary
Wir zeigen Varianten der extrazellulären Multi-Unit-Aufnahmetechnik, um Geruch hervorgerufenen Reaktionen in den ersten drei Stufen der wirbellosen olfaktorischen charakterisieren. Diese Techniken können leicht an ensemble Aktivität in anderen neuronalen Systemen sowie zu untersuchen.
Abstract
Erkennung und Interpretation der Geruchssinn sind entscheidend für das Überleben vieler Organismen. Bemerkenswert ist, haben Arten in phyla auffallend ähnlich olfaktorischen Systeme darauf hindeutet, dass die biologische Ansatz zur chemischen Sensorik über evolutionäre Zeit 1 wurde optimiert. Im Insekt olfaktorische System werden Riechstoffe Geruchsrezeptor Neuronen (ORN) in der Antenne, die chemische Stimuli umzuwandeln in Züge von Aktionspotentialen transduziert. Sensorischen Input der ORN wird dann dem Antennallobus (; eine Struktur analog zu der Wirbeltier Riechkolben AL) weitergeleitet. In der AL, nehmen neuronale Repräsentationen für Gerüche in Form von raumzeitlichen Brennen Muster über Ensembles der wichtigsten Neuronen (PNs, auch als Projektionsfläche Neuronen genannt) verteilt 2,3. Die AL-Ausgang wird nachfolgend durch Kenyonzellen (KCS) in der stromabwärtigen Pilzkörper (MB), eine Struktur mit olfaktorischen Gedächtnis und Lernen 4,5 assoziiert verarbeitet. Ihre, präsentieren wir elektrophysiologische Aufnahmetechniken, um Geruch hervorgerufenen neuronalen Antworten in diesen olfaktorischen Schaltungen überwachen.
Zunächst präsentieren wir einen einzigen Sensillum Aufnahme Methode, um Geruchs-evozierte Potentiale auf der Ebene von Populationen von ORN 6,7 studieren. Wir diskutieren die Verwendung von Kochsalzlösung gefüllte geschärft Glaspipetten als Elektroden, um extrazellulär überwachen ORN Antworten. Weiter präsentieren wir eine Methode, um extrazellulär überwachen PN Reaktionen unter Verwendung eines handelsüblichen 16-Kanal-Elektrode 3. Ein ähnlicher Ansatz mit einem maßgeschneiderten 8-Kanal-twisted wire Tetrode für Kenyon Zellen Aufnahmen 8 demonstriert. Wir stellen Details unserer experimentellen Aufbau und Gegenwart repräsentative Aufzeichnung Spuren für jede dieser Techniken.
Protocol
Ein. Geruch Vorbereitung und Lieferung
- Verdünnte Geruch Lösungen in Mineralöl Vol. um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Speichern einer 20 ml Mischung aus Mineralöl und dem Duftstoff in einer 60 ml Glasflasche. Legen Sie zwei Spritze Nadeln in einen Gummistopfen (Gauge 19), eine von unten und die andere von oben, um einen Einlass und einen Auslass Linie bereitzustellen. Verschließen Sie die Glasflasche mit diesem Gummistopfen und fügen Sie eine kundenspezifische Aktivkohlefilter mit der Zuleitung (Abbildung 1A).
- Der Aktivkohlefilter wird mit zwei 6 ml Spritzen. Schneiden Sie die Spritzen in der Hälfte und entsorgen Sie die Kolben Ende. Füllen Sie jedes der restlichen Stücke mit Baumwolle und Aktivkohle, bevor Sie sie zusammen mit Schrumpfschlauch.
- Verbinden der Ausgangsleitung des Geruchs Flasche (mit Polyethylenschlauch, 0,86 mm ID), um den Kunststoffschlauch (Nalgene FEP Tubing, ID 5,8 mm), die einen konstanten Luftstrom liefert über die Antenne (1B
- Direkte Kohlenstoff-gefilterten, entfeuchtete Luft (Trägergas; Fließgeschwindigkeit, 0,75 l / min) in Richtung der Johannisbrotgummi über einen Kunststoffschlauch in wenigen cm des Johannisbrotgummi Antenne.
- Für Duftstimulation, verdrängen ein konstantes Volumen (0,1 l / min) des statischen Kopfraum über der Geruch Lösung in der Flasche. Dies wird durch Injizieren einer gleichen Menge von entfeuchteter Luft in die Flasche unter Verwendung eines Pico-Pumpe (WPI, PV-820) gelöst. Die Brüden aus der Flasche sind Geruch durch die Auslassleitung in die Luftströmungsrohr (1B) gerichtet ist.
- Entfernen Sie die gelieferte Geruch Dämpfen, indem ein Vakuum Trichter ~ 10 cm hinter der Heuschrecke Antenne.
2. Vorbereiten Locust Antenne für Einzel Sensillum Recording
- Wählen Sie ein junger Erwachsener locust beiderlei Geschlechts mit ausgewachsenen Flügel, aber vor der Paarung Etappe von einem überfüllten Kolonie. Um die Heuschrecke zurückzuhalten, erste amputieren den Beinen. Verschließen Sie die Amputation Seiten mit Gewebekleber (Vetbond, 3M). Sichere ter Heuschrecken zu einer maßgeschneiderten Kammer mit einem kleinen Stück Isolierband um seine Brust drapiert (Abbildung 2A).
- Unter einem Dissektionsmikroskop, einen flachen Nut in dem Wachs Plattform (2A) für die Antenne Platzierung. Die Antenne in die Nut und stabilisieren diese mit batik Wachs an den beiden Enden der Antenne (2B; ein electrowaxer wird zum Schmelzen des Wachses verwendet).
- Legen Sie eine Masseelektrode (chlorierten Silberdraht) in den Thorax (~ 1 cm vom Kopf). Verwenden Batik Wachs sowohl Siegel der Inzisionsstelle und halten Sie die Erdungsdraht (Abbildung 2A).
3. Einzel Sensillum Aufnahme auf Odor-evozierte Antworten von olfaktorischen Rezeptor-Neuronen (ORN) überwachen
- Legen des stabilisierten, Johannisbrotgummi Antenne unter einem Stereomikroskop (Leica M205C) auf einer Schwingungsisolierung Tisch (TMC) (3A). Stellen Sie sicher, dass die Basis der Aufnahme Sensillum klar ist,ly sichtbar (Abb. 3B).
- Verwenden eines Feinpipettenziehvorrichtung (Sutter P-1000) zu Glaselektroden (Impedanz 3-10 MOhm, wenn sie mit Johannisbrotgummi Kochsalzlösung 9, Spitzendurchmesser 1-3 um gefüllte) unter Verwendung eines Borsilikat-Glaskapillare (OD 1,2 mm, 0,69 mm ID) herzustellen.
- Das Glas Elektrode in eine Mikropipette Halter, der an einem motorisierten Mikromanipulator (Sutter MP-285) angebracht ist. Schieben Sie die Elektrode in die Basis eines Sensillum (3B). Beachten Sie, dass jedes Sensillum können 3-50 ORN in Heuschrecken 10 enthalten.
- Verstärken des Signals (10.000 mal) mit einem AC-Verstärker (Grass P-55). Filter das Signal zwischen 0,3 bis 10,0 kHz und erwerben bei 15 kHz Abtastrate (3D) mit einem Datenerfassungssystem (LabView, PCI-MIO-16E-4 DAQ-Karten; National Instruments).
4. Locust Dissection Vorgehensweise für Antennallobus und Pilzkörper Recordings
- Folgen Sie dem restraining Verfahren wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Positionieren Sie die Heuschrecke in einem individuell gestalteten Kammer, wie in Abbildung 4A und B gezeigt.
- Um perfundieren Kochsalzlösung während und nach der Dissektion Verfahren, bauen ein Wachs cup rund um die Heuschrecken Kopf. Das Wachs Tasse sollte knapp oberhalb der Mundwerkzeuge beginnen, und sich über die Facettenaugen umfasst den Bereich zwischen den beiden Antennen wie in 4C gezeigt.
- Damit die Antennen durch das Wachs Kelch an, erstellen kleine Tunnel auf beiden Seiten mit Kunststoff (Polyethylen)-Schlauch (5 mm lang, ID 0,86 mm). Stellen Sie sicher, dass das Kunststoffrohr kann durch das Wachs Tasse gleiten. Letztere wird unter Verwendung einer Gummidichtung, die eng umschlingt das Kunststoffrohr erreicht, aber mit dem Wachs-Becher (4C) befestigt sind.
- Verwendung von Epoxydharz, befestigen die Basis der Antennen mit dem unteren Ende des Kunststoffschlauchs. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Antennen an Ort und Stelle bleiben auch nach der Umgebung stattNagelhaut wird entfernt.
- Halten Sie das Wachs Tasse mit Kochsalzlösung 9 ab diesem Zeitpunkt gefüllt. Beginnen durch Entfernen eines zentralen rechteckigen Bereichs zwischen den beiden Antennen (längere Seite des Rechtecks mit dem anteroposterioren Achse ausgerichtet). Anschließend entfernen Nagelhaut in benachbarten Regionen, ohne die Facettenaugen und Nagelhaut an der Basis der Antenne (4D).
- Mit feinen Pinzette vorsichtig entfernen Luftsäcke und Fett umgebenden Körpern das Gehirn. Am Ende dieses Schritts sollte das Johannisbrotgummi Gehirn deutlich zu erkennen (Figur 4D). Beachten Sie, dass die Hirnregionen, die olfaktorische Information (mit Licht gelbe Pigmentierung) verarbeiten zwischen den beiden Antennen befinden.
- Heuschrecken in der Darm verläuft unterhalb des Gehirns und entlang der Länge des Körpers. Um die Bewegung des Darms von potenziell destabilisierenden die Vorbereitung zu verhindern, ziehen Sie die Vorderdarm und schneiden Sie es mit einer feinen Schere. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den Bauch nurüber dem Rektum und entfernen Sie den Darm, indem Sie den Enddarm mit groben Pinzette. Um eine Kochsalzlösung Leck zu verhindern, binden den Bauch sofort anterior der Inzisionsstelle mit Nähfäden.
- Mit einem kleinen Plattform eines dünnen Drahtes mit einer dünnen Schicht aus Wachs, das Gehirn zu erhöhen und zu stabilisieren 11 während Elektrophysiologie wie in 4D gezeigt, beschichtet ist.
- Das Insekt Gehirn wird durch eine dünne isolierende Hülle, die vor der Experimente entfernt werden muss abgedeckt. Um das Gehirn desheath sanft verteilt eine kleine Menge eines Enzyms (0,3 bis 0,4 mg Protease, Sigma Aldrich) über die Oberfläche des Gehirns mit feinen Pinzetten 9. Nach ~ 5-10 s von Enzym-Anwendung, spülen Sie das Gehirn gründlich mit Kochsalzlösung. Mit super-feinen Pinzette sehr sanft kneifen und ziehen Sie die Hülle und danach reißt es über die Aufnahmeorte (AL und MB; siehe Abbildung 4E, F) zu öffnen.
5. Multi-unit Aufnahmen aus der Antennallobus undPilzkörper
- Legen Sie die Heuschrecken Vorbereitung (5A) unter einem Stereomikroskop von einem Galgen auf einer Schwingungsisolierung Tisch aufgehängt.
- Aufrechterhaltung einer konstanten Kochsalzlösung Perfusionsrate (ungefähr 0,04 l / h) während des Experiments. Verwenden eines chlorierten Silberdraht in der Kochsalzlösung gefüllte Tasse Wachs als Masseelektrode eingetaucht.
- Für PN-Aufnahmen, mit einem 16-Kanal-Silizium-Sonde (NeuroNexus Technologies, item # a2x2-tet-3mm-150-150-121-A16, 5B). Vor jedem Versuch, elektroplattieren der Elektroden mit Gold, um Impedanzen im Bereich von 200 bis 300 kOhm erreichen. Verwenden Sie die Schaltung in Abbildung 7 für die Galvanotechnik gezeigt.
- Positionieren Sie die Elektrode in der Nähe der Oberfläche des Antennallobus und schieben Sie es in das Gewebe mit einer manuellen Mikromanipulator (WPI, M3301R) (Abbildung 5D).
- Schieben Sie den Elektrode in ~ 10 um Schritte. Warten Sie 2-3 min bei jedem Schritt und bewerten die zu erwerbend Signalqualität. In einer idealen Aufnahmeort wird extrazelluläre Signale an von verschiedenen Aufzeichnungskanälen abgeholt und ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR> 3-5 mal Rauschen SDs) haben.
- Für KC-Aufnahmen, verwenden Sie eine maßgeschneiderte verdrillte Tetrode (5C, Schritt-für-Schritt Fertigung in Abschnitt 6 dargestellt). Elektroplattieren dieser Elektroden, wie in Schritt 5.3 diskutiert. Platzieren Sie die Tetrode auf der Oberfläche des MB (5E) als KC Somata der Oberflächenschicht des MB 8 beschränkt sind.
- Sowohl PN und KC Aufnahmen gleichzeitig aus derselben Johannisbrotgummi Zubereitung hergestellt werden, wie schematisch in 5A gezeigt.
- Eine Wartezeit von mindestens 15 min nach dem Auffinden der Aufzeichnungsstelle zu einer Stabilisierung der Elektroden zu ermöglichen.
- Erwerben Sie alle extrazellulären Signalen bei 15 KHz, Filter zwischen 0,3-6 KHz, und verstärken (10.000 Mal) mit einem 16-Kanal-AC-Verstärker (Biology Electronics Shop; Caltech, Pasadena, CA) (6A, B).
6. Verfahren zur Twisted Wire Elektrode für KC Recordings Stellen
- Um eine Multi-Unit-Elektrode für KC-Aufnahmen gestalten, verwenden isoliert Chrom-Nickel-Draht (RO800, 0,0005 "Filament) 8.
- Wenn acht Elektroden gewünscht werden dann wickeln Sie den Draht um einen 10-15 cm langen Stück Pappe 4 mal. Die Enden des Kartons kann mit Kunststoffschlauch abgedeckt werden, um die Kanten von Schneiden des Drahts zu verhindern. Während wrapping, stellen Sie sicher, es gibt wenig schlaff, sondern sicherzustellen, dass der Draht nicht straff gespannt ist. Behandeln Sie den Draht vorsichtig, da es leicht bricht.
- Bunch die Drähte zusammen an der Spitze der Karton und mit einem Stück Klebeband (Time Tape, T-534-RP), um sie zusammenzuhalten. Schneiden die Stränge an dem anderen Ende. Entfernen Sie die Drahtlitzen und Gruppe die Drähte an dem abgeschnittenen Ende sowie mit einem anderen Stück des Bandes.
- Mit einem Titer Schüttler (Thermo Scientific, Modell 4625Q), Wind die Stränge (~ 72 U / min für 3min) zu einem verdrillten Draht zu bilden. Der Boden der abgeklebt Stränge können auf die Titerplatte Rotor befestigt werden und die obere kann zu einem Galgen befestigt werden. Beim Wickeln sollte der Draht haben wenig Spielraum, aber nicht gespannt sein.
- Die Isolierung schmelzen zusammen mit einer Heißluftpistole (Weller 6966C), um die einzelnen Stränge aneinander haften und bilden einen einzigen Draht. 3-4 langsam Durchgängen (3-4 Sek. jeweils) über die Länge des Drahtes sollte ausreichen, um zu erwärmen und zu verschmelzen die Stränge zusammen. Dann lassen Sie den Draht aus dem Boden und lassen Sie sich zu entspannen. Schneiden Sie den Draht in der Nähe der Enden, um das Band zu entfernen.
- Stecken Sie ein Ende des Drahtes durch einen 5-6 cm langen, Glaskapillare (OD 1,0 mm, ID 0,58 mm). Necken auseinander verdrillten Draht an einem Ende mit feinen Pinzetten und Entfernen der Beschichtung durch sehr kurz torching das Ende mit einer Flamme. Dieser Schritt muss sorgfältig durchgeführt werden; Aussetzen der Draht an der Flamme zu lange verursachen die Stränge zu schmelzen und zu verwirren.
- Vorsichtig trennen die 8 Stränge auf der geflammten Ende einnd Lot jeder Strang separat in einem 8-poligen IC-Sockel. Beschichtung der Spitze der IC-Fassung mit Epoxid zum Halten der Stränge und Glaskapillare vorhanden. Auch einen kleinen Tropfen von Epoxid an dem anderen Ende der Kapillare, um den Draht an Ort und Stelle (5C) zu halten.
- Schließlich schneiden die Spitze des Drahtes in einem 45 Grad-Winkel mit Hartmetall Schere etwa 0,5 cm von der Kapillarspitze.
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Representative Results
Geruch hervorgerufenen Reaktionen eines einzelnen ORN an zwei verschiedene Alkohole sind in der Figur 3D dargestellt. Abhängig von dem Aufnahmeort (Sensillen Typs, die Platzierung der Elektrode) mehrgliedrige Aufnahmen erreicht werden kann.
Eine rohe extrazellulären Wellenform von einem AL Aufnahme in 6A gezeigt. Aktionspotentiale oder Spikes unterschiedlicher Amplituden aus verschiedenen PNs kann in diesem Spannungsbereich Spur beobachtet werden. Obwohl das Johannisbrotgummi Antennallobus hat exzitatorische und inhibitorische Vorsprungs lokalen Neuronen Neuronen, erzeugen nur PNs Natrium Spikes, die extrazellulär 3 erfasst werden kann. Diese Beobachtung legt nahe, dass das mehrgliedrige Aufnahmetechnik hier dargestellten verwendet werden kann, um selektiv überwacht die Ausgabe der Antennallobus Schaltungen, wodurch ein attraktives Heuschrecken wirbellosen Modell zur Untersuchung olfaktorischen Codierung werden.
Ein Beispiel eines Pilzkörper Aufzeichnung wird im gezeigten Um Einheit Antworten von diesen Multi-Unit-Aufnahmen zu isolieren, haben wir off-line Spike Sortierung (mit den besten vier Kanäle) unter Verwendung veröffentlichter Software IGOR Pro (Wavemetrics) 12 umgesetzt. Beispiele von PN und KC Spike Sortierung werden in 6C und D gezeigt. 
Abbildung 1. Duftstimulation. (A) Alle Komponenten zur Herstellung eines Geruchs Flasche benötigt werden gezeigt. (B) Die Verbindung von dem Einlaß pico-Pumpe und den Auslaßstutzen von der Flasche zu dem Geruch Geruch Zuführröhrchen gezeigt. Ein konstanter Strom von getrockneter Luft als Trägergasstrom verwendet und wird an der Antenne während der Experimente gerichtet.
Abbildung 2. Vorbereitung einer Heuschrecke Antenne für einzelne Sensillum Aufnahmen. (A) Die Heuschrecke ist in einem speziell angefertigten Kammer mit einer Masseelektrode im Darm platziert. (B) Ein Verfahren, um eine Antenne mit einer Wachs-Plattform zu stabilisieren gezeigt.
Abbildung 3. Einzel Sensillum Aufnahmen. (A) Eine typische Aufnahme einzurichten. Ein Gemisch aus Trägergas und Geruch Dampf durch ein Zuführrohr zugeführt wird. ORN Aktionspotentiale werden unter Verwendung einer Glaselektrode. Geliefert Geruchsstoffe werden mit einem Vakuum-Trichter direkt hinter der Antenne befindet. (B) Electrode Placement als durch das Stereomikroskop gesehen. Pfeile zeigen die Platzierung der Glaselektrode Spitze an der Basis eines Sensillum. (C) Ein Schematic der einzelnen Sensillum Aufnahme Ansatz. (D) Rohmaterial extrazelluläre Spannung Spuren zeigt Reaktionen eines ORN zu zwei verschiedenen Gerüchen (2-Octanol und 1-Hexanol).
Abbildung 4. Locust Dissektion Verfahren. (A) A locust zurückgehalten wird und in einer speziell entworfenen Dissektion Setup wie gezeigt positioniert. (B) der Heuschrecke Kopf Ansicht von oben. Beide Facettenaugen und Antennen ist deutlich zu erkennen (C) Ein Wachs cup rund um die Dissektion Website wird gebaut, um Kochsalzlösung Perfusion während und nach dem Sezieren zu ermöglichen. (D) Eine freiliegende Johannisbrotgummi Gehirn gezeigt (die gelb-pigmentierten neuronale Gewebe). Eine Plattform unterhalb des Gehirns wie gezeigt platziert, um das Gehirn zu stabilisieren. Eine Kochsalzlösung Perfusionsschlauch ist mit dem Wachs Becher angebracht. (E) Ein Schema des Johannisbrotgummi Gehirn. (F) ein vergrößertes Bild der Heuschrecke Gehirn nach der Dissektion, die deutlich die Regionen von Interesse: eintennal Lappen (AL) und die Pilzkörper (MB). Die antennalen Nerven (AN) enthält Axon Bundles, die die ORN Aktionspotentiale von der Antenne zum Antennallobus übertragen.
Abbildung 5. Multi-unit Aufnahmen aus dem Antennallobus und der Pilzkörper. (A) eine schematische Darstellung der Aufnahme Konfiguration und den Geruch Lieferung Setup. (B) Ein 16-Kanal NeuroNexus Aufzeichnungselektrode für PN Aufnahmen eingesetzt gezeigt. (C) im linken Bereich, machte eine benutzerdefinierte 8-Kanal Twisted Drahtelektrode angezeigt wird. Rechten Bereich der Elektrodenspitze und die Anschlüsse der Drähte auf die IC-Fassung gezeigt. (D) Die Platzierung des 16-Kanal-Aufnahme-Elektrode in der AL. Nur die unteren vier Elektroden in jeder Schaft in das Gewebe eingeführt wird. (F) Platzierung des verdrillten Drahtelektrode in den oberflächlichen Schichten MB für KC-Aufnahmen gezeigt.
Abbildung 6. Repräsentative Ergebnisse einer Antennallobus (AL) und einem Pilzkörper (MB) der Aufnahme. (A) Eine rohe extrazellulären Spur von einem Multi-Unit-AL Aufnahme gezeigt. A 4 s Geruch Puls während des Zeitraums durch den grauen Kasten angedeutet angewendet. (B) Ähnliche Handlung, sondern zeigt raw KC Antworten auf eine Geruch. (C) Ein Beispiel für PN Spike Sortierung. Extrazelluläre Wellenformen aus vier unabhängigen Kanälen eines Mehrkanal-Elektrode für alle Spiking Ereignissen aus einem einzelnen PN gezeigt. Einzelne Ereignisse (schwarz), mittleren (rot) und SDS (blau) sind für beide Zellen gezeigt. Histogramme durch Projektion hochdimensionalen PN Event Darstellungen (180 dimensionaler Vektor durch Verkettung 3 ms Signale von allen vier Elektroden erhalten) auf der Verbindungslinie ihrer Mittel erhalten. Um als gut isola werdented Einheit, wie im vorliegenden Fall, eine bimodale Verteilung mit Clusterzentren mindestens fünfmal der Lärm SD abgesehen wird für jedes Paar von gleichzeitig aufgezeichnet Zellen 12 erwartet. (D) Ein Beispiel KC Spike Sortieranlage dargestellt.
Abbildung 7: Die Galvanik eingerichtet:. Das Schaltbild zeigt Verbindungen zwischen den verschiedenen Komponenten werden über ein Bild von der aktuellen Setup angezeigt. Kurz gesagt, werden 3 Hz Rechteckimpulsen (5V Amplitude) von einem Funktionsgenerator (MCP, SG 1639A) verwendet werden, um Gate-Isolator einen Stimulus (WPI, A365), die dann liefert 5 uA des Stroms zu einer Elektrodenimpedanz Tester (BAK Electronics, IMP- 2). Die Impedanz Tester kann betrieben werden, um entweder die Elektrodenimpedanz zu testen oder erlauben Stromimpulse aus dem Stimulus Isolator, um zu der Elektrode für Goldplattierung angewendet werden kann. In beiden Fällen wird der Multi-Unit-Elektrode gehalten imeingetaucht in einer Galvanik sowie die Gold-Lösung. Ein Schalter ermöglicht die Auswahl der Elektrode Kanal vergoldet werden.
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Discussion
Die meisten Sinnesreize wecken kombinatorischen Reaktionen, die über Ensembles von Neuronen verteilt sind. Daher ist die gleichzeitige Überwachung von mehreren Neuronen-Aktivität notwendig zu verstehen, wie Stimulus-spezifische Informationen dargestellt und durch neuronale Schaltkreise im Gehirn verarbeitet werden. Hier haben wir extrazelluläre Multi-Unit-Aufnahmetechniken, um Geruch hervorgerufenen Reaktionen auf die ersten drei Bearbeitungszentren entlang der Insekten olfaktorischen charakterisieren demonstriert. Wir stellen fest, dass die hier vorgestellten Verfahren in einer Reihe von früheren Studien über olfaktorische Kodierung verwendet wurden und werden immer eine gängige Praxis in diesem Bereich 3,6,13-17. Die Kombination der hier vorgestellten Verfahren kann man eines Systems Ansatz zur Untersuchung der Konstruktion und Berechnung Prinzipien der wirbellosen olfaktorische System zu entwickeln. Hier müssen wir erkennen, bahnbrechenden Beiträge von Gilles Laurent, Mark Stopfer und ihre Kollegen 2,3,8,9,13,16,18-21, die diese approa Vorreiter gemachtches zu offenbaren und erläutern einige grundlegende Prinzipien des olfaktorischen Codierung.
Schließlich ist es erwähnenswert, dass optische Techniken wurden auch erfolgreich eingesetzt, um Ensemble-Aktivität in Insektenzellen olfaktorischen Schaltungen 22-27 studieren. Während diese optische Techniken vorteilhaft sind, wenn das Ziel ist, gleichzeitig überwachen neuronale Aktivität über eine große Anzahl von Neuronen sind Elektrophysiologie Techniken noch der "Goldstandard" bei Detektion einzelner Aktionspotentiale gewünscht wird.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten den folgenden Personen für die Finanzierung dieser Arbeit danken: großzügige Anschubfinanzierung aus dem Department of Biomedical Engineering in Washington University, eine McDonnell Center for Systems Neuroscience Zuschuss, ein Office of Naval Research Grant (Grant #: N000141210089) auf BR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrophysiology Equipment | |||
| A.C. amplifier | GRASS | Model P55 | for single sensillum recordings |
| Audio monitor (model 3300) | A-M Systems | 940000 | |
| Custom-made 16 channel pre-amplifier and amplifier | Cal. Tech. Biology Electronics Shop | for AL and MB recordings | |
| Data acquisition unit | National Instruments | BNC-2090 | |
| Fiber optic light | WPI | SI-72-8 | |
| Light source 115 V | WPI | NOVA | |
| Manual micromanipulator | WPI | M3301R | for locust brain recordings |
| Stereomicroscope1 on boom stand | Leica | M80 | for locust brain recordings |
| Stereomicroscope2 | Leica | M205C | for single sensillum recordings |
| Vibration-isolation table | TMC | 63-500 series | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP285/T | |
| Oscilloscope | Tektronix | TD2014B | |
| Electrodes/Construction Tools | |||
| 16-channel electrode | NeuroNexus | A2x2-tet-3mm-150-121 | for antennal lobe recordings |
| Borosilicate capillary tubes with filament, ID 0.69 mm | Sutter Instruments | BF120-69-10 | for making glass electrodes |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Function generator | Multimeter Warehouse | SG1639A | for gold-plating electrodes |
| Gold plating solution (non cyanide) | SIFCO Industries | NC SPS 5355 | |
| Impedance tester | BAK Electronics Inc. | IMP-2 | for gold-plating electrodes |
| Switch rotary | Electroswitch | C7D0123N | for gold-plating electrodes |
| Pulse isolator | WPI | A365 | for gold-plating electrodes |
| Q series electrode holder | Warner Instruments | 64-1091 | |
| Silver wire 0.010" diameter | A-M Systems | 782500 | ground electrode |
| 8 pin DIP IC socket | Digikey | ED90032-ND | |
| Borosilicate capillary tubes with filament, ID 0.58 mm | Warner Instruments | 64-0787 | |
| Heat gun | Weller | 6966C | |
| Rediohm-800 wire | Kanthal Precision Technologies | PF002005 | |
| Titer plate shaker | Thermo Scientific | 4625Q | twisting wires |
| Carbide scissors, 4.5" | Biomedical Research Instr | 25-1000 | for cutting twisted tetrode wires |
| Fine point tweezers | HECO | 91-EF5-SA | for teasing tetrode wires apart |
| Odor Delivery | |||
| 6 ml syringe | Kendall | 1180600777 | for custom designed activated carbon filter |
| Brown odor bottles | Fisher | 08-912-165 | |
| Charcoal | BuyActivatedCharcoal.com | GAC-48C | |
| Desiccant | Drierite | 23005 | |
| Drierite gas drying jar | Fischer Scientific | 09-204 | |
| Heat shrink tubing | 3M | EPS-200 | odor filter preparation |
| Hypodermic needle aluminum hub, gauge 19 | Kendall | 8881-200136 | for providing inlet and outlet lines for odor bottles |
| Mineral oil | Mallinckrodt Chemicals | 6357-04 | for odor dilution |
| Nalgene plastic tubing, 890 FEP | Thermo Scientific | 8050-0310 | for carrier gas delivery |
| Pneumatic picopump | WPI | sys-pv820 | for odor delivery |
| Polyethylene tubing ID 0.86 mm | Intramedic | 427421 | for odor bottle outlet connections and saline profusion tubing |
| Stoppers | Lab Pure | 97041 | for sealing odor bottles |
| Time tape | PDC | T-534-RP | |
| Tubing luer | Cole-Parmer | 30600-66 | |
| Vacuum tube | McMaster-Carr | 5488K66 | |
| Preparation/Dissection | |||
| 100 x 15 mm petri dish | VWR International | 89000-304 | |
| 18 AWG copper stranded wire | Lapp Kabel | 4510013 | |
| 22 AWG stranded hookup wire | AlphaWire | 1551 | brain platform |
| Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
| Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | |
| Electrowaxer | Almore International | 66000 | |
| Epoxy, 5 min | Permatex | 84101 | |
| Hypodermic needle aluminum hub | Kendall | 8881-200136 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | for desheathing locust brain |
| Suture thread non-sterile | Fisher | NC9087024 | for tying the abdomen after gut removal |
| Vetbond | 3M | 1469SB | for sealing amputation sites |
| Dumont #1 forceps (coarse) | WPI | 500335 | |
| Dumont #5 titanium forceps (fine) | WPI | 14096 | |
| Dumont #5SF forceps (super-fine) | WPI | 500085 | desheathing locust brain |
| 10 cm dissecting scissors | WPI | 14393 | for removing legs and wings |
| Vannas scissors (fine) | WPI | 500086 | for removing cuticle, cutting the foregut |
| Saline Profusion | |||
| Extension set with rate flow regulator | Moore Medical | 69136 | for regulating saline flow |
| IV administration set with Y injection site | Moore Medical | 73190 | for regulating saline flow |
References
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