Summary
אנחנו מדגימים וריאציות של טכניקה רבת יחידת ההקלטה התאית לאפיין תגובות ריח מעורר בשלושת השלבים הראשונים של מסלול ההרחה חסר חוליות. טכניקות אלה יכולים בקלות להיות מותאמות לבחינת פעילות הרכב במערכות עצביות אחרות גם כן.
Abstract
זיהוי ופירוש של רמזי חוש ריח הם קריטיים להישרדות של יצורים רבים. למרבה הפלא, מינים על פני טווח מערכת יש מערכות חוש ריח דומות להפליא שמרמזים כי הגישה הביולוגית כימית לחישה בצורה מיטבית לאורך זמן אבולוציוני 1. במערכת הרחת חרקים, odorants הם transduced ידי נוירונים קולטניים ריח (orn) באנטנה, המשתמשים בגירויים כימיים לרכבות של פוטנציאל פעולה. קלט חושי מORNs אז העביר לאונת מחושים (AL; מבנה דומה לפקעת הרחת חוליות). בAL, ייצוגים עצביים לריחות בצורה של דפוסי ירי חלל ובזמן המופצים על פני רכבים של נוירונים העיקריים (PNS; מכונה גם נוירונים הקרנה) 2,3. פלט AL מעובד לאחר מכן על ידי תאי קניון (KCs) בגוף במורד זרם הפטריות (MB), מבנה הקשור לזיכרון ולמידת הרחת 4,5. שלהדואר, אנו מציגים טכניקות הקלטת אלקטרו לעקוב אחרי תגובות ריח מעורר עצביות במעגלי ריח אלה.
ראשית, אנו מציגים שיטת הקלטת sensillum יחידה כדי לחקור את תגובות ריח מעורר ברמה של אוכלוסיות של ORNs 6,7. אנו דנים בשימוש בpipettes המלוח מלא חדד זכוכית כאלקטרודות extracellularly לעקוב אחרי תגובות orn. בשלב הבא, אנו מציגים שיטת extracellularly לעקוב אחרי תגובות PN באמצעות אלקטרודה מסחרית 16-ערוץ 3. גישה דומה באמצעות חוט tetrode ערוץ 8-מעווה אישית הוא הוכיח לתא הקלטות קניון 8. אנו מספקים פרטי ההתקנה הניסיונית שלנו ועקבות הקלטה יציגה נוכחיות לכל אחת מהשיטות הללו.
Protocol
1. הכנת ריח ומשלוח
- לדלל פתרוני ריח בשמן מינרלים לפי נפח כדי להשיג את רמת הריכוז הרצוי. אחסן תערובת 20 מ"ל של שמן מינרלים וodorant בבקבוק 60 מיליליטר זכוכית. הכנס שתי מחטי מזרק לתוך פקק גומי (מד 19), אחד מלמטה והשני מלמעלה, כדי לספק כניסה וקו יציאה. לאטום את בקבוק הזכוכית עם פקק גומי זו ולצרף אישית מעוצבת מסנן פחם לקו היניקה (איור 1 א) מופעל.
- מסנן הפחם נעשה שימוש בשני מזרקים 6 מ"ל. חותך את המזרקים במחצית והשלך את סוף הבוכנה. מלא כל אחד מהחלקים שנותרו עם כותנה ופחם פעיל לפני חיבורם יחדיו באמצעות צינורות כיווץ בחום.
- חבר את קו היציאה של בקבוק הריח (באמצעות צינורות פוליאתילן, מזהה 0.86 מ"מ) לצינור הפלסטיק (אבובי Nalgene FEP, מזהה 5.8 מ"מ) המספק זרימת אוויר קבועה לאורך האנטנה (התרשים 1B
- ישיר פחם בפילטר, אוויר dehumidified (גז מוביל; ספיקה, 0.75 L / min) לקראת הארבה באמצעות צינור פלסטיק ממוקם בתוך כמה סנטימטרים של אנטנת ארבה.
- לגירוי ריח, לתפוס נפח קבוע (0.1 ליטר / דקה) של אמיץ סטטי מעל פתרון הריח בבקבוק. זו מושגת על ידי הזרקת כמות שווה של אוויר dehumidified לבקבוק באמצעות משאבת פיק (WPI, PV-820). האדים מבקבוק הריח מופנים דרך הקו לשקע על צינור זרימת האוויר (1B איור).
- הסר את אדי הריח נמסרו על ידי הצבת משפך ואקום ~ 10 סנטימטרים מאחורי אנטנת ארבה.
2. הכנת אנטנת ארבה להקלטת Sensillum יחידה
- בחר ארבה צעיר בוגר של שני מינים עם כנפיים במלוא גודל, אבל לפני שלב ההזדווגות ממושבה הומה אדם. כדי לרסן את הארבה, לכרות תחילה את רגליה. לאטום את אתרי קטיעה עם דבק רקמות (Vetbond, 3M). לא מאובטחהוא הארבה לחדר מתוכנן מותאם אישית באמצעות פיסה קטנה של סרט חשמל עטופה סביב החזה שלה (איור 2 א).
- תחת מיקרוסקופ נתיחה, לעשות שקע רדוד בפלטפורמת השעווה (איור 2 א) להצבת אנטנה. הנח את האנטנה לתוך החריץ ולייצב אותו באמצעות שעווה בטיק בשני קצוות של האנטנה (האיור 2B; electrowaxer משמש להמסת השעווה).
- הכנס האלקטרודה קרקע (חוטי כסף chlorided) לתוך בית החזה (~ 1 סנטימטר מראש). להשתמש בשעווה בטיק לשניהם חותם אתר החתך והחזק את חוט הקרקע במקום (איור 2 א).
3. הקלטת Sensillum יחידה לעקוב אחרי תגובות ריח מעורר מנוירונים קולטניים ריח (ORNs)
- הנח את אנטנת הארבה התייצב תחת stereomicroscope (היקה M205C) על שולחן בידוד רעידות (TMC) (איור 3 א). ודא שבסיס sensillum ההקלטה ברורly גלוי (איור 3 ב ').
- השתמש micropipette חולץ (סאטר P-1000) לפברק אלקטרודות זכוכית (עכבה 3-10 MΩ כאשר התמלא ארבה 9 מלוחים, מיקרומטר 1-3 קוטר קצה) באמצעות צינור נימי זכוכית ורוסיליקט (1.2 מ"מ OD, מזהה 0.69 מ"מ).
- הנח את אלקטרודת הזכוכית לבעל micropipette שמצורף לmicromanipulator ממונע (סאטר MP-285). הכנס בעדינות את האלקטרודה לתוך בסיס sensillum (איור 3 ב '). שימו לב שכל sensillum יכול להכיל 3-50 ORNs בארבה 10.
- להגביר את האות (10,000 פעמים) באמצעות מגבר AC (גראס P-55). סנן האות בין 0.3-10.0 קילוהרץ ולרכוש בקצב דגימה 15 קילוהרץ (האיור 3D) באמצעות מערכת רכישת נתונים (LabVIEW, PCI-MIO-16E-4 כרטיסי DAQ; מכשירים הלאומיים).
4. נוהל Dissection ארבה לאונת מחושים והקלטות גוף פטריות
- עקוב restrainiנהלי ng כמתוארים בסעיף 2.1. מקם את הארבה בחדר מותאם במיוחד כפי שמוצג באיור 4 א 'וב'.
- לתנקב מלוח במהלך ולאחר הליך הנתיחה, לבנות כוס שעווה סביב ראש ארבה. כוס השעווה צריכה להתחיל בדיוק מעל לאיברי הפה, ולהרחיב מעבר לעיניים המורכבות המקיפות את האזור שבין שתי האנטנות, כפי שמוצג באיור 4C.
- כדי לאפשר האנטנות לעבור כוס השעווה, ליצור מנהרות קטנות בשני הצדדים באמצעות צינורות (5 מ"מ אורך, 0.86 מ"מ ID) פלסטיק (פוליאתילן). ודא שצינור הפלסטיק יכול להחליק דרך כוס השעווה. האחרונים מושגים באמצעות אטם גומי שעוטף בחוזקה את צינור הפלסטיק אבל מצורפים לשעוות הגביע (האיור 4C).
- שימוש בשרף אפוקסי, לצרף את הבסיס של האנטנות לקצה התחתון של צינור הפלסטיק. צעד זה מבטיח שהמחושים מוחזקים במקום גם לאחר שמסביבציפורן הוסרה.
- שמור על כוס שעווה מלאה בתמיסת מלח 9 מנקודה זו ואילך. בגין על ידי הסרת אזור מלבני מרכזי בין שתי האנטנות (צד ארוך של המלבן המיושר עם ציר anteroposterior). לאחר מכן, להסיר ציפורן באזורים סמוכים מבלי להפריע לעיניים המורכבות והציפורן בבסיס האנטנה (האיור 4D).
- שימוש במלקחיים עדינים, בעדינות להסיר צקי אוויר וגופי שומן המקיפים את המוח. בסופו של שלב זה, מוח הארבה צריך לראות בבירור (האיור 4D). שים לב שהאזורים במוח המעבדים את מידע ההרחה (עם פיגמנטציה צהובה בהירה) נמצאים בין שתי האנטנות.
- בארבה המעיים פועלים מתחת למוח ולאורכו של הגוף. כדי למנוע תנועה של המעי מערעור יציבות בהכנה פוטנציאלית, משוך בעדינות את המעי הקדמי וחותך אותו בעזרת מספריים עדינים. לעשות חתך קטן בבטן פשוטמעל הרקטום ולהסיר את המעיים על ידי משייכת המעי האחורי עם מלקחיים גסים. כדי למנוע דליפה מי מלח, לקשור את הבטן מייד הקדמית לאתר החתך עם נושאי תפר.
- השתמש בפלטפורמה קטנה עשויה מחוט דק מצופה בשכבה דקה של שעווה כדי לרומם את המוח ולייצב אותה במהלך 11 electrophysiology כפי שמוצג באיור 4D.
- מוח החרקים מכוסה במעטה דקה בידוד שיש להסיר לפני ניסויים. לdesheath המוח, בעדינות להפיץ כמות קטנה של אנזים (0.3-0.4 מ"ג פרוטאז, סיגמה אולדריץ) על פני השטח של המוח באמצעות מלקחיים עדינים 9. לאחר ~ של 5-10 של יישום אנזים, שטיפת המוח ביסודיות עם תמיסת מלח. שימוש במלקחיים ועדינים מאוד בעדינות לצבוט ולמשוך את הנדן ובהמשך יקרע אותו על מקומות ההקלטה (AL וMB; שמוצג באיור 4E, F).
5. קלטות רבות של יחידות מהאונה והמחושיםגוף הפטרייה
- הנח את הכנת הארבה (האיור 5A) תחת stereomicroscope הושעה מדוכן ום מונח על שולחן בידוד רעידות.
- שמור על קצב קבוע מלוח זלוף (כ 0.04 ליטר / שעה) לאורך הניסוי. השתמש בחוט כסף chlorided השקוע בכוס השעווה מלוחה המלאה כהאלקטרודה הקרקע.
- להקלטות PN, השתמש ערוץ 16-סיליקון חללית (טכנולוגיות NeuroNexus, פריט # A2x2-ט-3mm-150-150-121-A16, 5B איור). לפני כל ניסוי, Electroplate את האלקטרודות בזהב כדי להשיג עכבות בטווח kΩ 200-300. השתמש במעגל שמוצג באיור 7 עבור electroplating.
- מקם את האלקטרודה הקרובה לפני השטח של אונת המחושים ועדינות להכניס אותו לתוך הרקמות באמצעות micromanipulator ידני (WPI, M3301R) (האיור 5D).
- לקדם את האלקטרודה ב~ 10 צעדי מיקרומטר. חכה 2-3 דקות בכל שלב ולהעריך לרכושאיכות אות ד. באתר הקלטה אידיאלי, אותות תאיים יהיו נטל על ידי ערוצי הקלטה מרובים ויהיה יחס גבוה אות לרעש (SNR> 3-5 פעמי הרעש SDS).
- להקלטות KC, השתמש tetrode מחוייט שזור חוט (איור 5 ג; הליך ייצור צעד אחר צעד הוצג בסעיף 6). Electroplate אלקטרודות אלה כפי שפורט בשלב 5.3. הנח tetrode על פני השטח של MB (האיור 5E) כKC somata מוגבל לשכבה השטחית של מגה 8.
- ניתן גם הקלטות KC PN ובו זמנית מאותה הכנת ארבה כפי שמוצגים באופן סכמטי 5A איור.
- חכה לפחות 15 דקות לאחר שמצא את מיקום ההקלטה כדי לאפשר התייצבות של אלקטרודות.
- לרכוש את כל האותות התאיים ב15 קילוהרץ, ומסנן בין 0.3-6 קילוהרץ, ולהגביר (10,000 פעמים) באמצעות ערוץ 16 AC מגבר (ביולוגית אלקטרוניקת חנות; קלטק בפסדינה, קליפורניה) (איור 6 א ', ב').
6. הליכים להפוך אלקטרודה תיל המפותלת להקלטות KC
- כדי לעצב האלקטרודה רבה יחידה להקלטות KC, השתמש חוט מבודד ניקל כרום (RO800, 0.0005 "חוט) 8.
- אם 8 האלקטרודות רצויות, ואז עוטף את החוט מסביב לחלק ארוך של 10-15 סנטימטר 4 פעמי קרטון. את הקצוות של הקרטון יכולים להיות מכוסים בצינורות פלסטיק כדי למנוע את הקצוות מחיתוך התיל. למרות עטיפה, לוודא שיש קצת רפוי, אך יש לוודא שהחוטים אינם מתוחים. טפל בחוט בזהירות כפי שהוא נשבר בקלות.
- חבורה יחד את החוטים בחלק העליון של הקרטון ולהשתמש בחתיכת הסרט (Tape זמן, T-534-RP) כדי להחזיק אותם יחד. חותך את החוטים בקצה השני. הסר את חוטי תיל וקבוצה את החוטים בסוף לחתוך גם באמצעות קטע אחר של הסרט.
- שימוש בכייל צלחת ייקר (Thermo Scientific, 4625Q דגם), כורכים את החוטים יחד (~ 72 rev / min 3דקות) כדי ליצור חוט שזור אחד. התחתון של קווצות השיער המודבק יכול להיות מקוטע לרוטור צלחת כייל והעליון יכול להיות מקוטע לדוכן בום. במהלך מפותל, החוט צריך להיות רפוי מעט, ובכל זאת לא להיות מתוח.
- ממס את הבידוד יחד עם אקדח חום (ולר 6966C) לתקוע את הגדילים הבודדים יחד וליצור חוט אחד. עובר איטי 3-4 שניות (3-4 כל אחד) מעל אורך החוט צריך להיות מספיק כדי לחמם ולהתיך את הגדילים ביחד. לאחר מכן שחרר את החוט מהתחתית ולאפשר לו להירגע. חתוך את החוט ליד הקצוות כדי להסיר את הסרט.
- קצה אחד של החוט דרך צינורית 5-6 סנטימטר, זכוכית נימים (OD 1.0 מ"מ, 0.58 מ"מ ID). ניסיתי להפריד את החוט השזור בקצה אחד באמצעות פינצטה העדינה ולהסיר את הציפוי על ידי הצתה מאוד הסוף באמצעות להבה בקצרה. צעד זה חייב להיעשות בזהירות; לחשוף את החוט ללהבה במשך זמן רב מדי יגרום לגדילים כדי להמס וסבך.
- בעדינות להפריד בין 8 גדילים בקצה flamednd הלחמת גדיל אחד בנפרד לתוך שקע IC 8-PIN. מעייל העליון של שקע IC עם אפוקסי להחזיק את החוטים וזכוכית נימים במקום. גם מקום טיפה קטנה של אפוקסי בקצה השני של הנימים להחזיק את החוט במקום (איור 5 ג).
- לבסוף, לחתוך את הקצה של החוט בזווית של 45 מעלות עם מספרי קרביד על 0.5 סנטימטר מקצה הנימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תגובות ריח של עוררו-orn אחת לשני כהלים שונים מוצגות באיור 3D. בהתאם למיקום ההקלטה (סוג sensilla, מיקום של האלקטרודה) הקלטות מרובות יחידה יכול להיות מושגת.
גל תאי גלם מקלטת AL מוצג באיור 6 א. פוטנציאל פעולה או קוצים של אמפליטודות שונות שמקורם PNS השונה ניתן להבחין בשמץ המתח הזה. למרות אונת מחושי הארבה יש נוירונים הקרנה מעוררים ומעכבים נוירונים מקומיים, רק PNS לייצר קוצי נתרן כי ניתן לאתר extracellularly 3. תצפית זו מצביעה על כך שטכניקת ההקלטה רבה היחידה שהוצגה כאן ניתן להשתמש באופן סלקטיבי כדי לפקח על התפוקה של מעגלי אונת המחושים, ובכך ארבה מודל חסר חוליות אטרקטיבית ללימוד קידוד ריח.
דוגמה להקלטת גוף פטרייה מוצגת ב
כדי לבודד תגובות יחידה אחת מההקלטות הללו מרובים יחידות, בצע מיון לא מקוון ספייק (עם ארבעה הערוצים הטובים ביותר) באמצעות תוכנה שפורסמה מיושמת באיגור Pro (Wavemetrics) 12. דוגמאות למיון PN קייסי וספייק מוצגות באיור 6C, ו-D, בהתאמה.
איור 1. גירוי ריח. () כל הרכיבים דרושים להכנת בקבוק ריח מוצגים. (ב) חיבור הכניסה מpico-משאבה והחיבור לשקע מבקבוק הריח לצינור אספקת הריח מוצג. זרם בלתי פוסק של אוויר מיובש משמש כזרם הגז המוביל ומכוון האנטנה במהלך ניסויים.
class = "jove_content" fo: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 2. הכנת אנטנת ארבה להקלטות sensillum בודדות. () הארבה ממוקם בתא בהתאמה אישי עם אלקטרודה קרקע ממוקמת במעיים. (ב) שיטה לייצוב אנטנה באמצעות פלטפורמת שעווה מוצגת.
איור 3. הקלטות sensillum יחידות. () הקלטה טיפוסית להגדיר. תערובת של גז מוביל ואדי ריח מסופקת באמצעות צינור אספקה. פוטנציאל פעולת orn נרשם באמצעות אלקטרודות זכוכית. odorants נמסר יוסר באמצעות משפך ואקום הממוקם ממש מאחורי האנטנה. (ב) מיקום אלקטרודה כמו לראות דרך stereomicroscope. חיצים מעידים על מיקומו של קצה האלקטרודה הזכוכית בבסיס sensillum. (ג) סכימהטיקים של גישת הקלטת sensillum אחת. (ד) עקבות מתח תאי גלם מראות תגובות של orn לשני ריחות שונים (2-1-octanol וhexanol).
איור 4. הליך ארבה נתיחה. () ארבה מאופק וממוקם בהתקנה מותאמת אישית נתיחה מעוצבת כפי שמוצג. (ב) צפה בארבה הראש מלמעלה. שני העיניים המורכבות והמחושים ניתן לראות בבירור (C) כוס שעווה בנויה סביב אתר הנתיחה כדי לאפשר לזלוף מי מלח במהלך ואחרי תהליך הנתיחה. (ד) מוח ארבה נחשף מוצג (רקמה העצבית פיגמנט צהוב). פלטפורמה ממוקמת מתחת למוח, כפי שמוצג על מנת לייצב את המוח. צינור זלוף מלוח מצורף לכוס השעווה. (ה) סכמטי של מוח ארבה. (F) תמונה מוגדלת של מוח הארבה לאחר הנתיחה מראה את האזורים של עניין באופן ברור: אונות tennal (AL) וגופי הפטריות (MB). עצבי המחושים () מכילים צרורות האקסון שמעבירים את פוטנציאל פעולת orn מאנטנה לאונת מחושים.
איור 5. הקלטות של יחידה רבה מאונת המחושים וגוף הפטרייה. () סכמטית המראה את תצורת ההקלטה והתקנת משלוח הריח. (ב) אלקטרודה הקלטה 16-ערוץ NeuroNexus משמשת לPN הקלטות מוצגת. (ג) לוח שמאלי, בהתאמה אישית האלקטרודה תיל מפותלת מוצגת ערוץ 8-. לוח ימני, קצה האלקטרודה ואת החיבורים של חוטים לשקע IC מוצגים. (ד) מיקום של האלקטרודה ההקלטה בערוץ 16-AL. רק ארבע אלקטרודות התחתונות בכל שוק מוכנסות לתוך הרקמה. (F) מיקום של האלקטרודה החוט השזורה בשכבות השטחיות לייט KC הקלטות מוצג.
o: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 6. נציג תוצאות מאונת מחושים (AL) וגוף פטרייה (MB) הקלטה. () עקבות תאיות גלם מיחידה רבה הקלטת AL מוצגת. דופק הריח של 4 יושם בתקופת הזמן שצוינה על ידי התיבה האפורה. (ב) עלילה דומה אך מראים תגובות KC גלם לריח. (ג) דוגמה למיון ספייק PN. גל תאי מארבעה ערוצים עצמאיים של האלקטרודה רב ערוצים מוצגים לכל האירועים הנובעים מתקיעת מסמר אחד PN. אירועים בודדים (שחור), אומרים (אדום), וSDs (כחול) מוצגים לשני התאים. היסטוגרמות מתקבלת על ידי הקרנת ייצוגי אירוע PN גבוה ממדיים (וקטור ממדי 180 התקבל על ידי שרשור 3 אותות ms מכל הארבע אלקטרודות) על הקו המחבר בין האמצעים שלהם. כדי להיחשב היטב Isolaטד יחידה, כמו במקרה זה, חלוקת bimodal עם מרכזי מצרר לפחות חמש פעמים את הרעש SD בנפרד צפויה לכל זוג של תאים שנרשמו בו זמנית 12. (ד) דוגמה למיון ספייק KC מוצגת.
איור 7 electroplating להגדיר:. דיאגרמת המעגל מראה קשרים בין המרכיבים השונים מוצג לעיל תמונה של ההתקנה בפועל. בקצרה, 3 הרץ מרובע פעימות (5V אמפליטודה) ממחולל פונקציה (MCP, SG 1639A) משמשות לשער מבודד גירוי (WPI, A365) שלאחר מכן מספק 5 μA של זרם לבוחן עכבת אלקטרודה (בק אלקטרוניקה, IMP- 2). בוחן העכבה יכול להיות מופעל גם לבדוק את עכבת אלקטרודה או לאפשר פולסים שוטפים ממבודד הגירוי שיחולו על אלקטרודה לציפוי זהב. בשני המקרים, את האלקטרודה רבה היחידה נשמרה immersed בelectroplating גם מכיל פתרון זהב. מתג מאפשר בחירה של ערוץ האלקטרודה להיות מצופית זהב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גירויים חושיים ביותר לעורר תגובות קומבינטורית המופצים על פני רכבים של נוירונים. לפיכך, ניטור סימולטני של פעילות רב נוירון הוא הצורך להבין כיצד גירוי ספציפי המידע מיוצג ומעובד על ידי מעגלים עצביים במוח. הנה, יש לנו הפגנו טכניקות רבות יחידת הקלטה תאיות לאפיין תגובות ריח מעורר בשלושת מרכזי העיבוד 1 לאורך שביל הרחת החרקים. נציין כי את הטכניקות שהוצגו כאן כבר בשימוש במספר המחקרים הקודמים בקידוד ריח והופכות מקובל בתחום 3,6,13-17 זה. שילוב בין הטכניקות מוצגות כאן אפשר לפתח הגישה של מערכת לחוקר את עקרונות עיצוב ומחשוב של מערכת ההרחה של חסרת חוליות. כאן, עלינו להכיר בתרומות זרע שנעשו על ידי ז'יל לורן, מארק Stopfer, ועמיתיהם 2,3,8,9,13,16,18-21, שהיה חלוצים approa אלהצ 'ס כדי לחשוף ולהבהיר כמה עקרונות יסוד של קידוד ריח.
לבסוף, ראוי לציין כי שיטות אופטיות יש גם שמשו בהצלחה ללמוד פעילות הרכב במעגלי ריח חרקים 22-27. בעוד שיטות אופטיות אלו הן יתרון כאשר המטרה היא בו זמנית כדי לעקוב אחר פעילות עצבית על פני מספר גדול של תאי עצב, טכניקות electrophysiology עדיין 'סטנדרט הזהב' כאשר זיהוי של פוטנציאל פעולה הבודד הוא רצוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לגורמים הבאים על מימון עבודה זו: נדיב הזנק כספים מהמחלקה להנדסה ביו רפואית באוניברסיטת וושינגטון, מקדונל מרכז למערכות Neuroscience מענק, משרד מחקר של צי מענק (גרנט #: N000141210089) לBR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrophysiology Equipment | |||
| A.C. amplifier | GRASS | Model P55 | for single sensillum recordings |
| Audio monitor (model 3300) | A-M Systems | 940000 | |
| Custom-made 16 channel pre-amplifier and amplifier | Cal. Tech. Biology Electronics Shop | for AL and MB recordings | |
| Data acquisition unit | National Instruments | BNC-2090 | |
| Fiber optic light | WPI | SI-72-8 | |
| Light source 115 V | WPI | NOVA | |
| Manual micromanipulator | WPI | M3301R | for locust brain recordings |
| Stereomicroscope1 on boom stand | Leica | M80 | for locust brain recordings |
| Stereomicroscope2 | Leica | M205C | for single sensillum recordings |
| Vibration-isolation table | TMC | 63-500 series | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP285/T | |
| Oscilloscope | Tektronix | TD2014B | |
| Electrodes/Construction Tools | |||
| 16-channel electrode | NeuroNexus | A2x2-tet-3mm-150-121 | for antennal lobe recordings |
| Borosilicate capillary tubes with filament, ID 0.69 mm | Sutter Instruments | BF120-69-10 | for making glass electrodes |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Function generator | Multimeter Warehouse | SG1639A | for gold-plating electrodes |
| Gold plating solution (non cyanide) | SIFCO Industries | NC SPS 5355 | |
| Impedance tester | BAK Electronics Inc. | IMP-2 | for gold-plating electrodes |
| Switch rotary | Electroswitch | C7D0123N | for gold-plating electrodes |
| Pulse isolator | WPI | A365 | for gold-plating electrodes |
| Q series electrode holder | Warner Instruments | 64-1091 | |
| Silver wire 0.010" diameter | A-M Systems | 782500 | ground electrode |
| 8 pin DIP IC socket | Digikey | ED90032-ND | |
| Borosilicate capillary tubes with filament, ID 0.58 mm | Warner Instruments | 64-0787 | |
| Heat gun | Weller | 6966C | |
| Rediohm-800 wire | Kanthal Precision Technologies | PF002005 | |
| Titer plate shaker | Thermo Scientific | 4625Q | twisting wires |
| Carbide scissors, 4.5" | Biomedical Research Instr | 25-1000 | for cutting twisted tetrode wires |
| Fine point tweezers | HECO | 91-EF5-SA | for teasing tetrode wires apart |
| Odor Delivery | |||
| 6 ml syringe | Kendall | 1180600777 | for custom designed activated carbon filter |
| Brown odor bottles | Fisher | 08-912-165 | |
| Charcoal | BuyActivatedCharcoal.com | GAC-48C | |
| Desiccant | Drierite | 23005 | |
| Drierite gas drying jar | Fischer Scientific | 09-204 | |
| Heat shrink tubing | 3M | EPS-200 | odor filter preparation |
| Hypodermic needle aluminum hub, gauge 19 | Kendall | 8881-200136 | for providing inlet and outlet lines for odor bottles |
| Mineral oil | Mallinckrodt Chemicals | 6357-04 | for odor dilution |
| Nalgene plastic tubing, 890 FEP | Thermo Scientific | 8050-0310 | for carrier gas delivery |
| Pneumatic picopump | WPI | sys-pv820 | for odor delivery |
| Polyethylene tubing ID 0.86 mm | Intramedic | 427421 | for odor bottle outlet connections and saline profusion tubing |
| Stoppers | Lab Pure | 97041 | for sealing odor bottles |
| Time tape | PDC | T-534-RP | |
| Tubing luer | Cole-Parmer | 30600-66 | |
| Vacuum tube | McMaster-Carr | 5488K66 | |
| Preparation/Dissection | |||
| 100 x 15 mm petri dish | VWR International | 89000-304 | |
| 18 AWG copper stranded wire | Lapp Kabel | 4510013 | |
| 22 AWG stranded hookup wire | AlphaWire | 1551 | brain platform |
| Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
| Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | |
| Electrowaxer | Almore International | 66000 | |
| Epoxy, 5 min | Permatex | 84101 | |
| Hypodermic needle aluminum hub | Kendall | 8881-200136 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | for desheathing locust brain |
| Suture thread non-sterile | Fisher | NC9087024 | for tying the abdomen after gut removal |
| Vetbond | 3M | 1469SB | for sealing amputation sites |
| Dumont #1 forceps (coarse) | WPI | 500335 | |
| Dumont #5 titanium forceps (fine) | WPI | 14096 | |
| Dumont #5SF forceps (super-fine) | WPI | 500085 | desheathing locust brain |
| 10 cm dissecting scissors | WPI | 14393 | for removing legs and wings |
| Vannas scissors (fine) | WPI | 500086 | for removing cuticle, cutting the foregut |
| Saline Profusion | |||
| Extension set with rate flow regulator | Moore Medical | 69136 | for regulating saline flow |
| IV administration set with Y injection site | Moore Medical | 73190 | for regulating saline flow |
References
- Ache, B. W., Young, J. M. Olfaction: diverse species, conserved principles. Neuron. 48, 417-430 (2005).
- Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. Journal of Neuroscience. 16, 3837-3847 (1996).
- Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
- Steven de Belle, J., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263, 692-695 (1994).
- Cassenaer, S., Laurent, G. Conditional modulation of spike-timing-dependent plasticity for olfactory learning. Nature. 482, 47-52 (2012).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Raman, B., Joseph, J., Tang, J., Stopfer, M. Temporally diverse firing patterns in olfactory receptor neurons underlie spatiotemporal neural codes for odors. Journal of Neuroscience. 30, 1994-2006 (2010).
- Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
- Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. The Journal of Neuroscience. 14, 2993-3004 (1994).
- Ochieng, S. A., Hallberg, E., Hansson, B. S. Fine structure and distribution of antennal sensilla of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). Cell and Tissue Research. 291, 525-536 (1998).
- Burrows, M., Laurent, G. Synaptic Potentials in the Central Terminals of Locust Proprioceptive Afferents Generated by Other Afferents from the Same Sense Organ. Journal of Neuroscience. 13, 808-819 (1993).
- Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. Journal of Neuroscience Methods. 122, 43-57 (2002).
- Mazor, O., Laurent, G. Transient dynamics versus fixed points in odor representations by locust antennal lobe projection neurons. Neuron. 48, 661-673 (2005).
- Christensen, T. A., Pawlowski, V. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Multi-unit recordings reveal context dependent modulation of synchrony in odor-specific neural ensembles. Nature Neuroscience. 3, 927-931 (2000).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (36), e1725 (2010).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural Encoding of Rapidly Fluctuating Odors. Neuron. 61, 570-586 (2009).
- Ito, I., Ong, R. C., Raman, B., Stopfer, M. Sparse odor representation and olfactory learning. Nature Neuroscience. 11, 1177-1184 (2008).
- Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Review Neuroscience. 3, 884-895 (2002).
- Brown, S. L., Joseph, J., Stopfer, M. Encoding a temporally structured stimulus with a temporally structured neural representation. Nature Neuroscience. 8, 1568-1576 (2005).
- MacLeod, K., Laurent, G. Distinct mechanism for synchronization and temporal patterning of odor-encoding neural assemblies. Science. 274, 976-979 (1996).
- Wehr, M., Laurent, G. Relationship between afferent and central temporal patterns in the locust olfactory system. The Journal of Neuroscience. 19, 381-390 (1999).
- Moreaux, L., Laurent, G. Estimating firing rates from calcium signals in locust projection neurons in vivo. Frontiers in Neural Circuits. 1, 1-13 (2007).
- Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain. Journal of Neuroscience Methods. 76, 61-69 (1997).
- Galan, R. F., Sachse, S., Galizia, C. G., Hez, A. V. M. Odor-driven attractor dynamics in the antennal lobe allow for simple and rapid olfactory pattern classification. Neural Computation. 16, 999-1012 (2004).
- Kuebler, L. S., Schubert, M., Karpati, Z., Hansson, B. S., Olsson, S. B. Antennal Lobe Processing Correlates to Moth Olfactory Behavior. Journal of Neuroscience. 32, 5772-5782 (2012).
- Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (61), e2976 (2012).
- Skiri, H. T., Galizia, C. G., Mustaparta, H. Representation of Primary Plant Odorants in the Antennal Lobe of the Moth Heliothis virescens Using Calcium Imaging. Chemical Senses. 29, 253-267 (2004).
