Summary
علينا أن نبرهن أشكال مختلفة من هذه التقنية خارج الخلية تسجيل متعددة الوحدات لوصف رائحة استجابات في المراحل الثلاثة الأولى من مسار لحاسة الشم اللافقارية. يمكن بسهولة أن تتكيف هذه التقنيات لدراسة النشاط العصبي في نظم فرقة أخرى أيضا.
Abstract
كشف وتفسير الإشارات الشمية حاسمة لبقاء العديد من الكائنات الحية. بشكل ملحوظ، والأنواع عبر حاسة الشم لديها نظم تظهر شعبة مماثلة لافت للنظر مما يشير إلى أن تم تحسين النهج البيولوجية الكيميائية إلى الاستشعار على مر الزمن التطوري 1. في النظام الشمي الحشرات، وtransduced odorants من الخلايا العصبية مستقبلات الشم (ORN) في الهوائي، التي تحول المحفزات الكيميائية في القطارات من إمكانات العمل. ثم يتم ترحيل المدخلات الحسية من ORNs إلى الفص antennal (AL؛ بنية مماثلة لمبة حاسة الشم في الفقاريات). في AL، تمثيل العصبية للروائح على شكل أنماط الزمانية المكانية اطلاق موزعة على مجموعات من الخلايا العصبية الرئيسية (السندات الإذنية، كما يشار إلى الخلايا العصبية الإسقاط) 2،3. بعد ذلك تتم معالجة الناتج من الخلايا AL كينيون (KCS) في الجسم الفطر المصب (MB)، بنية الذاكرة المرتبطة حاسة الشم والتعلم 4،5. لهاه، نقدم تقنيات التسجيل الكهربية لمراقبة رائحة استجابات العصبية في هذه الدوائر حاسة الشم.
أولا، نقدم تسجيل sensillum واحد طريقة لدراسة رائحة استجابات على مستوى السكان من 6،7 ORNs. نناقش استخدام ماصات زجاجية مليئة المالحة وشحذ أقطاب لرصد ردود ORN خارج الخلية. المقبل، نقدم طريقة لرصد ردود PN خارج الخلية باستخدام التجارية 16-قناة الكهربائي 3. ويتجلى نهج مماثل باستخدام مصنوعة خصيصا tetrode الأسلاك الملتوية 8-قناة لخلية كينيون التسجيلات 8. ونحن نقدم تفاصيل الإعداد لدينا التجريبية والحاضر آثار التسجيل ممثل لكل من هذه التقنيات.
Protocol
1. إعداد رائحة و التوصيل
- تمييع حلول رائحة في الزيوت المعدنية من حيث الحجم لتحقيق مستوى تركيز المطلوب. تخزين خليط 20 مل من الزيوت المعدنية والرائحة في زجاجة والزجاج 60 مل. إدراج الإبر المحاقن اثنين الى سدادة مطاطية (قياس 19)، واحدة من أسفل والأخرى من أعلى، لتوفير مدخل ومخرج خط. ختم زجاجة مع سدادة مطاطية وهذا إرفاق مصممة خصيصا الكربون المنشط تصفية لمدخل خط (الشكل 1A).
- يتم تصفية الكربون باستخدام اثنين من الحقن مل 6. قطع الحقن في نصف نهاية وتجاهل الغواص. ملء كل القطع المتبقية مع القطن والفحم المنشط قبل ربطها معا باستخدام انكماش الأنابيب.
- توصيل خط مخرج من القمقم رائحة (باستخدام أنابيب البولي ايثيلين، ID 0،86 ملم) إلى أنبوب بلاستيكي (Nalgene FEP الأنابيب، ID 5.8 ملم) التي تزود تدفق الهواء المستمر عبر الهوائي (1B الشكل
- المباشرة الكربون تصفيتها، جفف الهواء (الغاز الناقل؛ تدفق معدل، 0.75 لتر / دقيقة) نحو الجراد باستخدام أنبوب بلاستيكي يوضع داخل سم قليل من الهوائي الجراد.
- لتحفيز رائحة وتهجير وحدة تخزين ثابتة (0.1 لتر / دقيقة) من فراغ الرأس ثابت فوق حل رائحة في زجاجة. ويتحقق هذا عن طريق حقن مبلغ مساو من الهواء في زجاجة جفف باستخدام مضخة بيكو (WPI، PV-820). يتم توجيه الأبخرة من الزجاجة رائحة من خلال خط الأنبوب منفذ على تدفق الهواء (1B الشكل).
- إزالة رائحة أبخرة تسليمها عن طريق وضع قمع فراغ ~ 10 سم خلف الهوائي الجراد.
2. إعداد الهوائي لتسجيل Sensillum الجراد واحدة
- تحديد الجراد الشباب والكبار من كلا الجنسين مع أجنحة بالكامل نمت، ولكن قبل مرحلة التزاوج من مستعمرة المزدحمة. لكبح الجراد، بتر ساقيه 1. ختم مواقع بتر الأنسجة بمادة لاصقة (Vetbond، 3M). آمنة رانه الجراد إلى غرفة مصممة خصيصا باستخدام قطعة صغيرة من الشريط الكهربائية رايات حول الصدر والخمسين (الشكل 2A).
- تحت المجهر تشريح، وجعل الأخدود الضحلة في منهاج الشمع (الشكل 2A) لوضع الهوائي. وضع الهوائي في الأخدود واستقرار ذلك باستخدام الشمع في الباتيك طرفي الهوائي (الشكل 2B، يتم استخدام electrowaxer للذوبان الشمع).
- اضافة الى وجود القطب الأرض (chlorided الأسلاك الفضية) في الصدر (~ 1 سم بعيدا عن الرأس). استخدام الباتيك الشمع لختم كل موقع مع الاستمرار على شق الأرض في مكان الأسلاك (الشكل 2A).
3. واحد تسجيل Sensillum لرصد رائحة أثار ردود من الخلايا العصبية مستقبلات الشم (ORNs)
- وضع الهوائي الجراد استقرت تحت stereomicroscope (لايكا M205C) على طاولة الاهتزاز العزلة (TMC) (الشكل 3A). تأكد من أن قاعدة sensillum تسجيل واضحلاي مرئية (الشكل 3B).
- استخدام مجتذب micropipette (سوتر P-1000) لصنع أقطاب الزجاج (3-10 مقاومة عند MΩ مليئة المالحة الجراد 9، تلميح ميكرومتر قطرها 1-3) باستخدام أنبوب زجاجي البورسليكات الشعرية (OD 1.2 مم، ID 0،69 ملم).
- وضع قطب كهربائي في الزجاج حامل micropipette التي يتم تركيبها على الآلية مياداة مجهرية (سوتر MP-285). إدراج بلطف القطب في قاعدة لsensillum (الشكل 3B). لاحظ أن كل sensillum يمكن أن تحتوي على 3-50 في ORNs الجراد 10.
- تضخيم إشارة (10،000 مرات) باستخدام مكبر للصوت AC (العشب P-55). تصفية الإشارة بين 0،3 حتي 10،0 كيلوهرتز واكتساب بمعدل كيلو هرتز أخذ العينات 15 (الشكل 3D) باستخدام نظام الحصول على البيانات (ابفيف، PCI-MIO-16E-4 بطاقات دق؛ الصكوك الوطنية).
4. الجراد إجراء تشريح للوب Antennal والتسجيلات الجسم الفطر
- اتبع restrainiإجراءات نانوغرام كما هو موضح في القسم 2.1. وضع الجراد في غرفة مصمم خصيصا كما هو موضح في الشكل 4A وB.
- ليروي المالحة أثناء وبعد العملية تشريح، وبناء كوب الشمع حول الرأس الجراد. يجب أن نبدأ كأس الشمع فوق أجزاء الفم، وتتجاوز عيون مركبة تشمل المنطقة بين الهوائيين كما هو موضح في الشكل 4C.
- للسماح للهوائيات لتمرير خلال كأس الشمع، وخلق الأنفاق الصغيرة في كلا الجانبين باستخدام البلاستيك (البولي ايثيلين) أنابيب (5 ملم طويلة، ID 0،86 ملم). تأكد من أن أنابيب بلاستيكية يمكن أن تنزلق من خلال كأس الشمع. ويتحقق هذا الأخير باستخدام طوقا المطاط التي يلتف بإحكام حول الأنبوب البلاستيك ولكن تعلق على كأس الشمع (الشكل 4C).
- باستخدام راتنجات الايبوكسي، ونعلق على قاعدة هوائيات إلى نهاية الجزء السفلي من الأنابيب البلاستيكية. تضمن هذه الخطوة التي عقدت في مكان الهوائيات حتى بعد المحيطةتتم إزالة بشرة.
- الحفاظ على كأس مليئة الشمع محلول ملحي 9 من هذه اللحظة فصاعدا. تبدأ عن طريق إزالة منطقة وسط المستطيل بين الهوائيين (أطول جانب من المستطيل تتماشى مع محور الأمامي الخلفي). بعد ذلك، قم بإزالة بشرة في المناطق المجاورة من دون إزعاج أعين المجمع وبشرة في قاعدة الهوائي (الشكل 4D).
- باستخدام ملقط غرامة، وإزالة بلطف الحويصلات الهوائية والأجسام الدهنية المحيطة الدماغ. في نهاية هذه الخطوة، ينبغي الدماغ الجراد رؤيتها بوضوح (الشكل 4D). لاحظ أن تقع في مناطق الدماغ التي تعالج المعلومات الشمية (مع تصبغ أصفر فاتح) بين الهوائيين.
- في القناة الهضمية الجراد يعمل تحت الدماغ وعلى طول الجسم. لمنع حركة الأمعاء من زعزعة الاستقرار إعداد، وسحب بلطف المعى الأمامي وقطع عليه غرامة باستخدام مقص. جعل شق صغير في البطن فقطفوق المستقيم والأمعاء إزالة عن طريق سحب المعى المؤخر مع ملقط الخشنة. لمنع تسرب المياه المالحة، ربط البطن الأمامي على الفور إلى موقع شق مع الدرز المواضيع.
- استخدام منصة صغيرة مصنوعة من أسلاك رقيقة مطلية بطبقة من الشمع غرامة لرفع الدماغ والاستقرار فيه 11 خلال الكهربية كما هو موضح في الشكل 4D.
- تتناول الدماغ بواسطة الحشرات غمد رقيقة عازلة التي تحتاج إلى إزالة قبل التجارب. لdesheath الدماغ، وانتشار بلطف كمية صغيرة من انزيم (0،3-0،4 ملغ البروتيني، سيغما الدريتش) على سطح الدماغ باستخدام ملقط غرامة 9. بعد ق ~ 5-10 من تطبيق الانزيم، وشطف الدماغ تماما مع المياه المالحة. باستخدام ملقط غرامة فائقة بلطف جدا قرصة وسحب صعودا وغمد المسيل للدموع بعد ذلك فتح مواقع على تسجيل (AL MB و؛ هو مبين في الشكل 4E، F).
5. تسجيلات متعددة الوحدات من الفص Antennal ووفطر الجسم
- وضع إعداد الجراد (الشكل 5A) تحت stereomicroscope علقت من موقف الازدهار وضعت على طاولة الاهتزاز العزلة.
- الحفاظ على معدل ثابت نضح المياه المالحة (نحو 0.04 لتر / ساعة) في كافة مراحل التجربة. استخدام سلك الفضة chlorided مغمورة في كأس الشمع المالحة مليئة والقطب الأرض.
- للتسجيلات PN، استخدم 16-قناة السيليكون التحقيق (NeuroNexus تكنولوجيز، البند رقم A2x2-تيت-3MM-150-150-121-A16، 5B الشكل). قبل كل تجربة، بالكهرباء الأقطاب مع الذهب لتحقيق المعاوقات الكهربائية في مجموعة أوم 200-300. استخدام الدائرة هو موضح في الشكل 7 لالكهربائي.
- وضع القطب الكهربائي على مقربة من سطح الفص antennal وضعه برفق في الأنسجة باستخدام دليل مياداة مجهرية (WPI، M3301R) (الشكل 5D).
- تقدم القطب في الخطوات 10 ~ ميكرومتر. الانتظار 2-3 دقائق في كل خطوة وتقييم اكتسابد إشارة الجودة. في موقع مثالي تسجيل، سيتم التقطت إشارات خارج الخلية من قبل قنوات متعددة تسجيل وسيكون لها عالية إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR> 3-5 مرات الضوضاء SDS).
- للتسجيلات KC، استخدم حسب الطلب tetrode الأسلاك الملتوية (الشكل 5C؛ خطوة بخطوة الإجراء تلفيق المعروضة في القسم 6). هذه الأقطاب بالكهرباء كما نوقش في الخطوة 5.3. وضع tetrode على سطح MB (الشكل 5E) كما يتم تقييد KC somata إلى الطبقة السطحية للMB 8.
- ويمكن إجراء كل PN والتسجيلات KC في وقت واحد من الجراد إعداد نفسه كما هو موضح في الشكل 5A تخطيطي.
- الانتظار على الأقل 15 دقيقة بعد العثور على موقع التسجيل للسماح استقرار الأقطاب.
- الحصول على جميع الإشارات خارج الخلية في 15 كيلوهرتز، فلتر بين 0،3-6 كيلو هيرتز، وتضخيم (10،000 مرات) باستخدام مكبر للصوت AC 16 قناة (علم الأحياء إلكترونيات تسوق؛ معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا في باسادينا، كاليفورنيا) (الرقم 6A، B).
6. إجراءات لجعل ملتوية الكهربائي أسلاك للتسجيلات KC
- لتصميم القطب متعددة الوحدات للتسجيلات KC، استخدم سلك معزول الكروم والنيكل (RO800، 0،0005 "خيوط) 8.
- إذا المطلوب ثمانية أقطاب ثم لف السلك حول قطعة طويلة من 10-15 سم 4 مرات من الورق المقوى. ويمكن تغطية نهايات الورق المقوى مع أنابيب بلاستيكية لمنع حواف قطع من السلك. في حين التفاف، تأكد من وجود الركود قليلا، ولكن تأكد من أن السلك ليس مشدود. التعامل مع الأسلاك بعناية لأنه يكسر بسهولة.
- مجموعة الأسلاك معا في الجزء العلوي من الورق المقوى واستخدام قطعة من الشريط (الشريط الزمن، T-534-RP) لتحميلهم معا. قطع فروع في الطرف الآخر. إزالة الأسلاك والخيوط مجموعة الأسلاك في نهاية قص وكذلك باستخدام قطعة أخرى من الشريط.
- باستخدام لوحة عيار شاكر (الحرارية العلمية، النموذج 4625Q)، الريح جدائل معا (~ 72 لفة / دقيقة لمدة 3دقيقة) لتشكيل سلك واحد الملتوية. ويمكن قص الجزء السفلي من خيوط ملصقة على لوحة عيار الدوار ويمكن قص الجزء العلوي الى وقفة الازدهار. خلال تصفية، ينبغي أن يكون السلك الركود قليلا، ولكن لا يكون مشدود.
- إذابة العزل مع بندقية الحرارة (يلر 6966C) التمسك فروع الفردية معا وتشكيل سلك واحد. يجب أن يمر بطيئا 3-4 (3-4 ثانية لكل منهما) على طول السلك يكون كافيا لتسخين وصهر خيوط معا. ثم حرر السلك من أسفل والسماح له للاسترخاء. تقليم الأسلاك بالقرب من طرفي لإزالة الشريط.
- إدراج واحدة من نهاية السلك من خلال أنبوب 5-6 سم طويلة الزجاج، الشعرية (OD 1.0 ملم، ID 0،58 ملم). ندف بصرف النظر عن الأسلاك الملتوية في نهاية واحدة باستخدام الملقط غرامة وإزالة الطلاء من إحراق لفترة وجيزة جدا نهاية باستخدام اللهب. ويجب أن يتم هذه الخطوة بعناية؛ تعريض السلك إلى اللهب لفترة طويلة جدا سوف تتسبب في فروع متشابكة لإذابة و.
- فصل بلطف فروع 8 على نهاية ملتهب علىالثانية جندى كل على حدة حبلا إلى مأخذ IC 8-دبوس. معطف أعلى مأخذ IC مع الايبوكسي لعقد الخيوط والزجاج الشعرية في المكان. أيضا وضع قطرة صغيرة من الايبوكسي في الطرف الآخر من شعري لعقد الأسلاك في مكانها (الشكل 5C).
- وأخيرا، وقطع طرف السلك بزاوية 45 درجة مع مقص كربيد حوالي 0.5 سم من الحافة الشعرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد ردود رائحة أثار واحدة من ORN لاثنين من الكحول مختلفة في الشكل 3D. اعتمادا على موقع التسجيل لا يمكن أن يتحقق (sensilla النوع، وضع القطب الكهربائي) متعددة الوحدات التسجيلات.
ويرد الموجي الخام خارج الخلية من تسجيل AL في الشكل 6A. ويمكن ملاحظة إمكانات العمل أو طفرات من سعة متفاوتة القادمة من السندات الإذنية مختلفة تتبع في هذا الجهد. على الرغم من أن الفص الجراد antennal لديه الخلايا العصبية والخلايا العصبية مثير الإسقاط المحلية المثبطة، السندات الإذنية فقط توليد المسامير الصوديوم التي يمكن أن يتم الكشف عن خارج الخلية 3. هذه الملاحظة تشير إلى أنه يمكن استخدام تقنيات التسجيل متعددة الوحدات المعروضة هنا بشكل انتقائي لمراقبة إخراج دوائر الفص antennal، مما يجعل الجراد نموذجا جذابا لدراسة اللافقاريات الترميز حاسة الشم.
ويرد مثال على تسجيل الجسم الفطر في
لعزل الردود حدة واحدة من هذه التسجيلات متعددة الوحدات، أجرينا خارج الخط ارتفاع الفرز (مع قنوات أفضل أربعة) باستخدام البرمجيات التي نشرت في تنفيذ برو IGOR (Wavemetrics) 12. وترد أمثلة على الفرز وارتفاع PN KC في الشكل 6C، وD، على التوالي.
الشكل 1. التحفيز رائحة. (A) يتم عرض جميع العناصر اللازمة لإعداد زجاجة رائحة. (B) وترد اتصال من مدخل مضخة بيكو والاتصال منفذ من الزجاجة إلى رائحة رائحة أنبوب التسليم. ويستخدم تيار مستمر من الهواء المجفف باعتبارها الناقل تيار الغاز ويستهدف الهوائي أثناء التجارب.
الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. إعداد الهوائي الجراد للتسجيلات sensillum واحد. (A) يتم وضع الجراد في غرفة العرف مع القطب الأرض وضعها في القناة الهضمية. (B) ويرد طريقة لتحقيق الاستقرار هوائي باستخدام منصة الشمع.
الشكل 3. تسجيلات sensillum واحد. (A) A تسجيل نموذجية اقامة. يتم توفير خليط من الغازات وبخار رائحة الناقل من خلال أنبوب التسليم. وتسجل إمكانات العمل ORN باستخدام القطب الزجاج. تتم إزالة odorants تسليم باستخدام القمع فراغ تقع خلف الهوائي. (B) وضع القطب الكهربائي كما يتضح من خلال stereomicroscope. تشير الأسهم موضع الزجاج الكهربائي تلميح في قاعدة لsensillum. (C) A المخططعرة للنهج sensillum تسجيل واحد. (D) الخام آثار الجهد خارج الخلية تظهر الاستجابات من ORN لاثنين من الروائح المختلفة (2-الأوكتانول و 1 HEXANOL).
الشكل 4. الجراد إجراء تشريح. (A) A هو ضبط النفس والجراد المتمركزة في الإعداد تشريح مصمم خصيصا كما هو موضح. (B) عرض من رئيس الجراد من فوق. يمكن كلتا العينين وهوائيات مجمع رؤيتها بوضوح (C) تم بناء كوب الشمع حول موقع تشريح للسماح نضح المياه المالحة أثناء وبعد عملية التشريح. (D) ويرد الدماغ الجراد يتعرض (الأنسجة العصبية الصباغية أصفر). يتم وضع منصة تحت الدماغ كما هو موضح لتحقيق الاستقرار في المخ. ومرفق أنبوب نضح المياه المالحة إلى كأس الشمع. (E) A التخطيطي للدماغ الجراد. (F) صورة مكبرة من الدماغ الجراد بعد تشريح تظهر بوضوح المناطق ذات الاهتمام: ل tennal فصوص (AL) والهيئات الفطر (MB). العصب antennal (AN) يحتوي على حزم محور عصبي الذي ينقل إمكانات العمل ORN من الهوائي إلى الفص antennal.
الشكل 5. تسجيلات متعددة الوحدات من الفص antennal والجسم الفطر. (A) A التخطيطي تبين تكوين وتسجيل الإعداد تسليم الرائحة. (B) ويرد تسجيل NeuroNexus 16-قناة الكهربائي المستخدمة في التسجيلات PN. (C) لوحة من الزمن، أدلى مخصص 8-قناة يظهر الملتوية الكهربائي السلك. وتظهر اللوحة اليمنى، والطرف القطب الاتصالات من الأسلاك إلى مأخذ IC. (D) تنسيب القطب تسجيل 16-AL في قناة. يتم إدراج فقط صاحبة المراكز الاربعة الأقطاب في كل عرقوب في الأنسجة. (F) ويرد تنسيب القطب الأسلاك الملتوية في الطبقات السطحية للتسجيلات MB KC.
س: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 6. نتائج الممثل من الفص antennal (AL) وهيئة فطر (MB) التسجيل. (A) A تتبع الخام خارج الخلية من وحدة متعددة ويرد AL التسجيل. تم تطبيق نبض A 4 S رائحة خلال الفترة الزمنية المشار إليها بواسطة مربع رمادي. (B) مؤامرة مماثلة لكن تبين الخام الردود KC إلى رائحة. (C) مثال على الفرز ارتفاع PN. وترد الطول الموجي خارج الخلية من أربع قنوات مستقلة من قطب متعدد القنوات لجميع الأحداث ارتفاعه الناشئة عن PN واحد. أحداث فردية (أسود)، يعني (أحمر)، والانحرافات المعيارية (الأزرق) وتظهر لكل من الخلايا. المدرج الاحصائي تم الحصول عليها من خلال إبراز الأبعاد عالية تمثيل الحدث PN (180 ناقلات الأبعاد التي تم الحصول عليها بواسطة وصل 3 مللي إشارات من جميع أقطاب أربعة) على خط يربط إمكانياتها. أن ينظر جيدا إيزولاتيد حدة، كما في هذه الحالة، عن توزيع ثنائي مع المراكز العنقودية خمس مرات على الأقل في SD الضوضاء وبصرف النظر ومن المتوقع لكل زوج من الخلايا في وقت واحد سجلت 12. (D) ويرد مثال على الفرز ارتفاع KC.
الشكل 7 وانشاء الكهربائي: ويبين مخطط الرسم البياني يبين الصلات بين مختلف مكونات أعلاه صورة من الإعداد الفعلي. لفترة وجيزة، وتستخدم 3 هرتز البقول مربع (5V السعة) من مولد وظيفة (MCP، SG 1639A) لبوابة عازل التحفيز (WPI، A365) من شأنها أن توفر ميكروأمبير ثم 5 من التيار الكهربائي إلى اختبار مقاومة (BAK إلكترونيات، IMP- 2). يمكن تشغيل اختبار لاختبار مقاومة إما مقاومة القطب أو السماح البقول الحالية من المعزل التحفيز ليتم تطبيقها على القطب لتصفيح الذهب. في كلتا الحالتين، يتم الاحتفاظ القطب حدة متعددة ايمmersed في حل الكهربائي التي تحتوي على الذهب جيدا. A التبديل يسمح اختيار القناة لتكون القطب مطلية بالذهب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المحفزات الحسية الأكثر إثارة ردود اندماجي التي يتم توزيعها عبر مجموعات من الخلايا العصبية. وبالتالي، رصد في وقت واحد متعدد الخلايا العصبية النشاط ضروري لفهم كيفية تحفيز محددة يتم تمثيل المعلومات ومعالجتها بواسطة الدوائر العصبية في الدماغ. هنا، لقد أثبتنا خارج الخلية تقنيات التسجيل وحدة متعددة لوصف رائحة أثار ردود على المراكز الأولى على طول الطريق التكرير الثلاثة على حاسة الشم الحشرات. نلاحظ أنه تم استخدام تقنيات المقدمة هنا في عدد من الدراسات السابقة على الترميز حاسة الشم وأصبحت ممارسة معتادة في هذا المجال 3،6،13-17. الجمع بين التقنيات المقدمة هنا يمكن للمرء أن تطوير نهج النظام على التحقيق في مبادئ التصميم والحوسبة النظام الشمي اللافقارية. هنا، علينا أن ندرك المساهمات الأصيلة التي قدمها لوران جيل، Stopfer مارك، وزملائهم 2،3،8،9،13،16،18-21، الذي كان رائدا هذه approaالكولينستراز لكشف وتوضيح المبادئ الأساسية ترميز العديد من حاسة الشم.
وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن كما تم استخدام تقنيات بصرية بنجاح لدراسة النشاط الفرقة في دوائر الحشرات حاسة الشم 22-27. في حين أن هذه التقنيات البصرية هي مفيدة عندما يكون الهدف هو رصد النشاط العصبي في وقت واحد عبر عدد كبير من الخلايا العصبية، وتقنيات الكهربية لا تزال "المعيار الذهبي" عند الكشف المطلوب من إمكانات العمل الفردية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر التالية لتمويل هذا العمل: السخي بدء الأموال من قسم الهندسة الطبية الحيوية في جامعة واشنطن، وهو مركز العلوم العصبية ماكدونيل لأنظمة المنح، ومكتب بحوث البحرية منحة (المنح #: N000141210089) إلى BR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrophysiology Equipment | |||
| A.C. amplifier | GRASS | Model P55 | for single sensillum recordings |
| Audio monitor (model 3300) | A-M Systems | 940000 | |
| Custom-made 16 channel pre-amplifier and amplifier | Cal. Tech. Biology Electronics Shop | for AL and MB recordings | |
| Data acquisition unit | National Instruments | BNC-2090 | |
| Fiber optic light | WPI | SI-72-8 | |
| Light source 115 V | WPI | NOVA | |
| Manual micromanipulator | WPI | M3301R | for locust brain recordings |
| Stereomicroscope1 on boom stand | Leica | M80 | for locust brain recordings |
| Stereomicroscope2 | Leica | M205C | for single sensillum recordings |
| Vibration-isolation table | TMC | 63-500 series | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP285/T | |
| Oscilloscope | Tektronix | TD2014B | |
| Electrodes/Construction Tools | |||
| 16-channel electrode | NeuroNexus | A2x2-tet-3mm-150-121 | for antennal lobe recordings |
| Borosilicate capillary tubes with filament, ID 0.69 mm | Sutter Instruments | BF120-69-10 | for making glass electrodes |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Function generator | Multimeter Warehouse | SG1639A | for gold-plating electrodes |
| Gold plating solution (non cyanide) | SIFCO Industries | NC SPS 5355 | |
| Impedance tester | BAK Electronics Inc. | IMP-2 | for gold-plating electrodes |
| Switch rotary | Electroswitch | C7D0123N | for gold-plating electrodes |
| Pulse isolator | WPI | A365 | for gold-plating electrodes |
| Q series electrode holder | Warner Instruments | 64-1091 | |
| Silver wire 0.010" diameter | A-M Systems | 782500 | ground electrode |
| 8 pin DIP IC socket | Digikey | ED90032-ND | |
| Borosilicate capillary tubes with filament, ID 0.58 mm | Warner Instruments | 64-0787 | |
| Heat gun | Weller | 6966C | |
| Rediohm-800 wire | Kanthal Precision Technologies | PF002005 | |
| Titer plate shaker | Thermo Scientific | 4625Q | twisting wires |
| Carbide scissors, 4.5" | Biomedical Research Instr | 25-1000 | for cutting twisted tetrode wires |
| Fine point tweezers | HECO | 91-EF5-SA | for teasing tetrode wires apart |
| Odor Delivery | |||
| 6 ml syringe | Kendall | 1180600777 | for custom designed activated carbon filter |
| Brown odor bottles | Fisher | 08-912-165 | |
| Charcoal | BuyActivatedCharcoal.com | GAC-48C | |
| Desiccant | Drierite | 23005 | |
| Drierite gas drying jar | Fischer Scientific | 09-204 | |
| Heat shrink tubing | 3M | EPS-200 | odor filter preparation |
| Hypodermic needle aluminum hub, gauge 19 | Kendall | 8881-200136 | for providing inlet and outlet lines for odor bottles |
| Mineral oil | Mallinckrodt Chemicals | 6357-04 | for odor dilution |
| Nalgene plastic tubing, 890 FEP | Thermo Scientific | 8050-0310 | for carrier gas delivery |
| Pneumatic picopump | WPI | sys-pv820 | for odor delivery |
| Polyethylene tubing ID 0.86 mm | Intramedic | 427421 | for odor bottle outlet connections and saline profusion tubing |
| Stoppers | Lab Pure | 97041 | for sealing odor bottles |
| Time tape | PDC | T-534-RP | |
| Tubing luer | Cole-Parmer | 30600-66 | |
| Vacuum tube | McMaster-Carr | 5488K66 | |
| Preparation/Dissection | |||
| 100 x 15 mm petri dish | VWR International | 89000-304 | |
| 18 AWG copper stranded wire | Lapp Kabel | 4510013 | |
| 22 AWG stranded hookup wire | AlphaWire | 1551 | brain platform |
| Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
| Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | |
| Electrowaxer | Almore International | 66000 | |
| Epoxy, 5 min | Permatex | 84101 | |
| Hypodermic needle aluminum hub | Kendall | 8881-200136 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | for desheathing locust brain |
| Suture thread non-sterile | Fisher | NC9087024 | for tying the abdomen after gut removal |
| Vetbond | 3M | 1469SB | for sealing amputation sites |
| Dumont #1 forceps (coarse) | WPI | 500335 | |
| Dumont #5 titanium forceps (fine) | WPI | 14096 | |
| Dumont #5SF forceps (super-fine) | WPI | 500085 | desheathing locust brain |
| 10 cm dissecting scissors | WPI | 14393 | for removing legs and wings |
| Vannas scissors (fine) | WPI | 500086 | for removing cuticle, cutting the foregut |
| Saline Profusion | |||
| Extension set with rate flow regulator | Moore Medical | 69136 | for regulating saline flow |
| IV administration set with Y injection site | Moore Medical | 73190 | for regulating saline flow |
References
- Ache, B. W., Young, J. M. Olfaction: diverse species, conserved principles. Neuron. 48, 417-430 (2005).
- Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. Journal of Neuroscience. 16, 3837-3847 (1996).
- Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
- Steven de Belle, J., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263, 692-695 (1994).
- Cassenaer, S., Laurent, G. Conditional modulation of spike-timing-dependent plasticity for olfactory learning. Nature. 482, 47-52 (2012).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Raman, B., Joseph, J., Tang, J., Stopfer, M. Temporally diverse firing patterns in olfactory receptor neurons underlie spatiotemporal neural codes for odors. Journal of Neuroscience. 30, 1994-2006 (2010).
- Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
- Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. The Journal of Neuroscience. 14, 2993-3004 (1994).
- Ochieng, S. A., Hallberg, E., Hansson, B. S. Fine structure and distribution of antennal sensilla of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). Cell and Tissue Research. 291, 525-536 (1998).
- Burrows, M., Laurent, G. Synaptic Potentials in the Central Terminals of Locust Proprioceptive Afferents Generated by Other Afferents from the Same Sense Organ. Journal of Neuroscience. 13, 808-819 (1993).
- Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. Journal of Neuroscience Methods. 122, 43-57 (2002).
- Mazor, O., Laurent, G. Transient dynamics versus fixed points in odor representations by locust antennal lobe projection neurons. Neuron. 48, 661-673 (2005).
- Christensen, T. A., Pawlowski, V. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Multi-unit recordings reveal context dependent modulation of synchrony in odor-specific neural ensembles. Nature Neuroscience. 3, 927-931 (2000).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (36), e1725 (2010).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural Encoding of Rapidly Fluctuating Odors. Neuron. 61, 570-586 (2009).
- Ito, I., Ong, R. C., Raman, B., Stopfer, M. Sparse odor representation and olfactory learning. Nature Neuroscience. 11, 1177-1184 (2008).
- Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Review Neuroscience. 3, 884-895 (2002).
- Brown, S. L., Joseph, J., Stopfer, M. Encoding a temporally structured stimulus with a temporally structured neural representation. Nature Neuroscience. 8, 1568-1576 (2005).
- MacLeod, K., Laurent, G. Distinct mechanism for synchronization and temporal patterning of odor-encoding neural assemblies. Science. 274, 976-979 (1996).
- Wehr, M., Laurent, G. Relationship between afferent and central temporal patterns in the locust olfactory system. The Journal of Neuroscience. 19, 381-390 (1999).
- Moreaux, L., Laurent, G. Estimating firing rates from calcium signals in locust projection neurons in vivo. Frontiers in Neural Circuits. 1, 1-13 (2007).
- Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain. Journal of Neuroscience Methods. 76, 61-69 (1997).
- Galan, R. F., Sachse, S., Galizia, C. G., Hez, A. V. M. Odor-driven attractor dynamics in the antennal lobe allow for simple and rapid olfactory pattern classification. Neural Computation. 16, 999-1012 (2004).
- Kuebler, L. S., Schubert, M., Karpati, Z., Hansson, B. S., Olsson, S. B. Antennal Lobe Processing Correlates to Moth Olfactory Behavior. Journal of Neuroscience. 32, 5772-5782 (2012).
- Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (61), e2976 (2012).
- Skiri, H. T., Galizia, C. G., Mustaparta, H. Representation of Primary Plant Odorants in the Antennal Lobe of the Moth Heliothis virescens Using Calcium Imaging. Chemical Senses. 29, 253-267 (2004).
