תרבויות cardiomyocyte העכבר ראשיים הן אחד הכלים המרכזיים לחקירה של ארגון ותפקוד myofibrillar. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עיקרי מלב עכבר בילוד. תרבויות cardiomyocyte וכתוצאה מכך עשויות לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני ביומכנית, ביוכימי ותא ביולוגי.
שריר לב בילוד תרבותי כבר מזמן משמש ללמוד myofibrillogenesis ופונקציות myofibrillar. שריר לב בתרבית מאפשר חקירה קלה ומניפולציה של מסלולים ביוכימיים, וההשפעה שלהם על המאפיינים ביומכניים של ספונטני להכות שריר לב.
פרוטוקול 2 הימים הבאים מתאר את הבידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד. אנו מראים כיצד לנתח בקלות את לב מילודים, לנתק את רקמת הלב ולהעשיר את שריר לב מתאי אוכלוסיית לב. אנחנו דנים בשימוש בתערובות אנזים שונות לתא דיסוציאציה, וההשפעות שלהם על תא את יכולת הקיום. שריר הלב המבודד יכול לשמש בהמשך עבור מגוון רחב של מבחני מורפולוגיים, אלקטרו, ביוכימיות, תא ביולוגי או ביומכנית. אנו מותאמים הפרוטוקול לחוסן ושחזור, על ידי שימוש בפתרונות רק זמינים מסחרית ואנזים מתערבב שshהשתנות קטנות ow הרבה להרבה. אנחנו גם להתמודד עם בעיות נפוצות הקשורות לבידוד והתרבות של שריר לב, ומציעים מגוון רחב של אפשרויות לאופטימיזציה של תנאי בידוד והתרבות.
הדיווחים המוקדמים ביותר לניתוק והתרבות המוצלחים של תאי לב מכרסמים שתחילתה ב1960 של 1,2. גם אז, הררי ופארלי שמו לב ששריר לב בתרבית "עשוי לספק מערכת ייחודית ללימוד הדרישות של ההתכווצות התקופתית [ואולי] לספק אמצעי קביעת התרומה של מסלולי מטבוליים שונים ל[ מכות] התהליך". למרות ששריר לב מבודד ומתורבת הררי ופארלי מחולדות צעירות, והפרוטוקול המקורי הותאם והותאם על ידי מדענים רבים במשך השנים, הליך הבידוד וculturing הכללי לא השתנה באופן משמעותי. עם זאת, אנזימים טובים יותר 3, פתרונות סטנדרטיים 4,5, והתוספת של הערוץ הפיך וBDM מעכבי ATPase שרירן כדי להגן על תאים במהלך הליך בידוד 6-9 השתפרו באופן משמעותי תא תשואה וכדאיות.
מבוגרים לעומת cardiomyo בילודcytes
יש לי cardiomyocytes המבודד ומתורבת מעכברים או חולדות בילוד מספר יתרונות על פני תרבויות של שריר לב מבוגר. בראש ובראשונה, הליך הבידוד ללבם עכבר או עכברוש בילוד הוא קל יותר ויקר פחות, בהשוואה לבידוד של שריר לב מעכבר בוגר או חולדה 10. cardiomyocytes ילודים הם הרבה פחות רגיש להשבה לטבע לבינוני מכיל סידן לאחר ניתוק, מאוד להגדיל תא תשואה. יתרון גדול נוסף הוא ששריר לב עכבר בילוד עובר טשטוש הבדלים מהיר יותר – מחזור redifferentiation שבדרך כלל תוצאות באופן ספונטני להכות תאים 20 שעות לאחר ציפוי, בעוד שבדרך כלל שריר לב מבוגר דורש לצעוד כדי לגרום להתכווצות. cardiomyocytes ילודים הם גם יותר בקלות transfectable עם שיטות transfection liposomal, ואילו שריר לב מבוגר דורש וקטורים ויראליים למסירה מוצלחת של ה-DNA המהונדס. בניגוד לcardiomyocyte בילודים, התרבות של cardiomyocytes מכרסמים המבוגר 11-13 מאפשרת לחקירות של השפלה myofibrillar והקמתה מחדש סופו של דבר את מנגנון ההתכווצות. שינויים מורפולוגיים האופייניים אלה בשריר לב בוגרים מתרחשים על פני תקופות של 1-2 שבועות. טשטוש ההבדלים – מחזור redifferentiation מלווה reexpression של התכנית הגנטית של העובר, ובכך מחקה שינויים פתולוגיים שנצפו בcardiomyopathies אדם 14. יתרון נוסף של שריר לב חולדה בוגר מעל התרבות של שריר לב בילוד הוא יכולת תרבות תאים אלה לפרקי זמן ארוכים.
עכברוש לעומת cardiomyocytes עכבר
יש הבידוד והתרבות של שריר לב בילוד חולדה כמה יתרונות על פני זו של שריר לב בילוד עכבר, כוללים תשואות גבוהות יותר של תאי קיימא ושיעורי transfection מוגברים. עם זאת, השימוש הרחב של מודלים עכבר מהונדסים גנטי למחלות לב (כגון: </ Em> העכבר בנוקאאוט חלבון Lim השרירים כמודל לcardiomyopathy מורחב 15) הוביל לעיבוד של הליך הבידוד לשריר לב שנלקח מעכברים בילוד. למרות שהפרוטוקולים המשמשים לבודד את שריר לב חולדה ועכבר בילוד הם כמעט זהים, טיפול גדול יותר יש לקחת בבחירת תמהיל אנזים מתאים לאפשרות השנייה. אכן, שריר לב עכבר בילוד הוא בדרך כלל רגיש יותר לoverdigestion, וכתוצאה מכך תא תשואה וכדאיות מופחתים. יתר על כן, צפיפות ציפוי צריכה להיות מותאמת, כי שריר לב שנלקח מעכברי יילודים הם מעט קטן יותר בהשוואה לתאי שמקורם בלב חולדה בילוד.
עם שימושים רבים לחקירה של פרמטרים מורפולוגיים, אלקטרו, ביוכימיות, תא ביולוגי ויומכנית, כמו גם לתהליך של myofibrillogenesis, שריר לב בילוד בתרבית הפכו לאחד המערכות המגוונות ביותר ללימודפונקציות תא לב במבחנה. הצעד הראשון לassay מוצלח לעומת זאת, תלוי במתודולוגיה קלה ואמינה לבודד את שריר לב עכבר בילוד. הפרוטוקול שלנו שואב את המתודולוגיה שלה ממקורות רבים והיה מותאם לשחזור וחוסן. אנו דנים בגורמים המשפיעים על cardiomyocyte תשואה וכדאיות, ולספק מגוון רחב של אפשרויות לאופטימיזציה של תנאי בידוד והתרבות.
השימוש במודלים של בעלי חיים כדי ללמוד מחלות לב הפך סטנדרטיים במחקר לב וכלי דם. אפיון ביוכימי קרוב יותר של מודלים אלה (כלומר, לומדים את תגובות ישירות של תאי לב לגירויים ביוכימי או ביומכנית) בדרך כלל דורש הבידוד של רקמות לב או שריר לב. מחקרים חוקרים תגובות פיסיולוגי…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לפרופ 'אמריטוס ז'אן קלוד Perriard ואוולין Perriard (מכון שוויצרי פדרלי לטכנולוגיה, שוויץ) למבוא לטכניקות בידוד לעכברוש בילוד ושריר לב עכבר. ברצוננו להודות לפרופ 'ג'ו חן ופרופ' סילביה אוונס (UCSD, ארה"ב) על תמיכתם. עבודה במעבדה של EE מומנה על ידי MRC קריירה הקמת גרנט. SL נתמך על ידי מסלול K99/R00 להעניק עצמאות מ-NIH / NHLBI (HL107744). TMM נתמכה על ידי מלגה הבתר מאיגוד הלב האמריקאי (11POST7310066).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|