Первичные культуры мыши кардиомиоцитов являются одним из ключевых инструментов для исследования миофибриллярного организации и функции. Следующий протокол описывает выделение и культуру первичных кардиомиоцитов из неонатальных мышиных сердцах. Полученные культуры кардиомиоцитов, может быть впоследствии использованы для различных биомеханических, биохимических и клеточных биологических анализов.
Искусственный неонатальные кардиомиоциты уже давно используются для изучения myofibrillogenesis и миофибриллярные функции. Искусственный кардиомиоциты позволяют легко расследования и манипуляции биохимических путей, и их влияние на биомеханических свойств спонтанно избиении кардиомиоцитов.
Следующий протокол уровня 2-дневного описывает выделение и культуру неонатальных кардиомиоцитов мыши. Мы покажем, как легко препарировать сердца от новорожденных, отделить сердечную ткань и обогатить кардиомиоциты от сердечной клетки-населения. Обсуждается использование различных ферментных смесей для клеток-диссоциации, и их влияние на клетки-жизнеспособности. Выделенные кардиомиоциты могут быть впоследствии использованы для различных морфологических, электрофизиологических, биохимических, клеточных биологических или-биомеханические анализов. Мы оптимизировали протокол для надежности и воспроизводимости, с помощью только имеющиеся в продаже решений и фермент смешивает, что шой немного партии к партии изменчивость. Мы также решения общих проблем, связанных с изоляцией и культуры кардиомиоцитов, и предлагают различные варианты для оптимизации выделения и культивирования условиях.
Самые ранние сообщения для успешного диссоциации и культуры клеток сердца грызунов восходит к 1960-х годов 1,2. Даже тогда, Харари и Фарли заметил, что культивируемые кардиомиоциты »вправе оказывать уникальную систему для изучения требований периодической сократительной [и может] обеспечивают средства определения вклада различных метаболических путей для [бьющегося] процесс". Хотя Харари и Фарли выделяют и культивируют кардиомиоциты от молодых крыс и оригинального протокола была адаптирована и изменение многими учеными на протяжении многих лет, общий порядок выделения и культивирования не сильно изменилась. Тем не менее, лучше ферменты 3, стандартизованные растворы 4,5, и добавление обратимого ингибитора канала и миозин АТФазы БДМ, чтобы защитить клетки во время процедуры выделения 6-9 значительно улучшилось сотовый выход и жизнеспособность.
Взрослый против новорожденных кардиомиоцитовциты
Кардиомиоциты выделяют и культивируют с новорожденных мышей или крыс имеют ряд преимуществ перед культур взрослых кардиомиоцитов. Прежде всего, процедура изоляции для новорожденных мыши или крысы сердца легче и дешевле, по сравнению с выделением кардиомиоцитов из взрослой мыши или крысы 10. Неонатальные кардиомиоциты гораздо менее чувствительны к реинтродукции в кальция среде, содержащей после диссоциации, что значительно увеличивает выход сотовый. Другим большим преимуществом является то, что неонатальные кардиомиоциты мыши подвергаются более быстрому дедифференцировки – повторной дифференцировки цикл, который обычно приводит к спонтанно бить элементов 20 час после посева, в то время как взрослые кардиомиоциты обычно требуют ходить, чтобы вызвать сокращение. Новорожденных кардиомиоцитов также более легко transfectable с методами липосомальный трансфекции, в то время как взрослые кардиомиоциты требуют вирусных векторов для успешной сдачи трансгенной ДНК. В отличие от новорожденных кардиомиоцитовс, культура взрослых грызунов кардиомиоцитов 11-13 позволяет для исследования миофибриллярного деградации и в конечном итоге восстановления сократительного аппарата. Эти характерные морфологические изменения у взрослых кардиомиоцитов происходить в течение периодов 1-2 недель. Дедифференцировка – цикл повторной дифференцировки сопровождается reexpression программы генной плода, тем самым имитируя патологические изменения, наблюдаемые в человека кардиомиопатии 14. Еще одним преимуществом взрослых кардиомиоцитов крыс через культуре неонатальных кардиомиоцитов является способность культуры эти клетки в течение длительных периодов времени.
Крыса против кардиомиоцитов мыши
Выделение и культура крыс неонатальных кардиомиоцитов имеет некоторые преимущества по сравнению с, что из мыши неонатальных кардиомиоцитов, в том числе более высокий выход жизнеспособных клеток и увеличение ставок трансфекции. Тем не менее, широкое использование генетически модифицированных моделях мыши для сердечных заболеваний (например, </ EM> мышца Ит белок нокаут мыши в качестве модели для дилатационной кардиомиопатией 15) привело к адаптации процедуры выделения для кардиомиоцитов, полученных из новорожденных мышей. Хотя протоколы, используемые для изоляции новорожденной крысы и мыши кардиомиоцитов почти идентичны, больше необходимо позаботиться в подборе подходящей смеси ферментов для последнего. Действительно, неонатальные кардиомиоциты мыши, как правило, более чувствительны к избытком, что приводит к снижению клеточной жизнеспособности и выходом. Кроме того, плотность покрытия должна быть скорректирована, так как кардиомиоциты, полученные из новорожденных мышей несколько меньше по сравнению с клетками, полученными от новорожденных сердцах крыс.
С многих применений для исследования морфологических, электрофизиологических, биохимических, клеточных биологических и биомеханических параметров, а также для процесса myofibrillogenesis, культивированный неонатальные кардиомиоциты стали одним из самых универсальных систем для изученияфункции клеток сердца в пробирке. Первый шаг к успешному анализе однако, зависит от простой и надежный методологии выделения неонатальных кардиомиоцитов мыши. Наш протокол рисует свою методологию из многих источников и была оптимизирована для воспроизводимости и надежности. Мы обсуждаем факторы, влияющие на кардиомиоциты выход и жизнеспособность, а также обеспечить различные варианты для оптимизации выделения и культивирования условиях.
Использование животных моделях для изучения сердечных заболеваний стала стандартом в сердечно-сосудистых исследований. Ближе биохимическая характеристика этих моделей (то есть изучения прямые ответы сердечных клеток в биохимических или биомеханических стимулы), как правило, т?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны проф почетный Жан-Клод Perriard и Эвелин Perriard (Швейцарский федеральный технологический институт, Швейцария) для вступления в методах изоляции для новорожденных крыс и кардиомиоцитов мыши. Мы хотели бы поблагодарить профессора Ju Чен и профессор Сильвия Эванс (UCSD, США) за их поддержку. Работа в лаборатории ЭЭ финансировалось в МРК Карьера Establishment Гранта. SL поддерживается K99/R00 путь к независимости награду от NIH / NHLBI (HL107744). ТММ поддержали докторантуру от Американской ассоциации сердца (11POST7310066).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|