Cultures de cardiomyocytes de souris primaires sont un des outils les pivots de l'enquête de l'organisation et de la fonction myofibrillaire. Le protocole suivant décrit l'isolement et la culture des cardiomyocytes primaires de coeurs de souris néonatales. Les cultures de cardiomyocytes résultants peuvent être ensuite utilisés pour une variété de tests biomécaniques, biochimiques et cellulaires biologiques.
Cardiomyocytes néonataux en culture ont longtemps été utilisés pour étudier myofibrillogenesis et fonctions myofibrillaires. Cardiomyocytes cultivés permettent d'enquête facile et la manipulation des voies biochimiques, et leur effet sur les propriétés biomécaniques de battre cardiomyocytes spontanément.
Le protocole 2 jours suivant décrit l'isolement et la culture de cardiomyocytes de souris néonatales. Nous montrons comment disséquer facilement cœur de nouveau-nés, dissocier le tissu cardiaque et d'enrichir les cardiomyocytes de la cellule-population cardiaque. Nous discutons de l'utilisation de différents mélanges d'enzymes pour dissociation des cellules, et leurs effets sur les cellules-viabilité. Les cardiomyocytes isolés peuvent ensuite être utilisés pour une variété d'analyses morphologiques, biochimiques, électrophysiologiques de cellules biologiques ou biomécanique. Nous avons optimisé le protocole pour la robustesse et la reproductibilité, en utilisant des solutions seulement disponibles dans le commerce et l'enzyme mélanges que show peu de variabilité de lot à lot. Nous abordons également les problèmes courants liés à l'isolement et la culture des cardiomyocytes, et offrons une variété d'options pour l'optimisation des conditions d'isolement et de culture.
Les premiers rapports de la dissociation de succès et de la culture de cellules cardiaques de rongeurs remonte au 1960 1,2. Même alors, Harary et Farley ont remarqué que des cardiomyocytes cultivés "peuvent fournir un système unique pour l'étude des exigences de la contractilité périodique [, et peuvent] fournir un moyen de déterminer la contribution des différentes voies métaboliques pour la [battre] processus». Bien Harary et Farley cardiomyocytes isolés et cultivés de jeunes rats, et le protocole original a été adapté et modifié par de nombreux scientifiques au cours des années, l'isolement et la culture procédure générale n'a pas beaucoup changé. Cependant, l'amélioration des enzymes, des solutions standardisées 3 4,5, et l'addition de la chaîne et un inhibiteur réversible de la myosine ATPase BDM à protéger les cellules au cours de la procédure d'isolement 6-9 a considérablement amélioré le rendement de cellules et la viabilité.
Adulte vs cardiomyo néonatalecytes
Cardiomyocytes isolés et cultivés à partir de souris ou de rats nouveau-nés ont plusieurs avantages par rapport à des cultures de cardiomyocytes adultes. Tout d'abord, la procédure d'isolement de rat ou de souris néonatales coeurs est plus facile et moins coûteux, par rapport à l'isolement des cardiomyocytes à partir de souris ou de rat adulte 10. Cardiomyocytes néonataux sont beaucoup moins sensibles à la réintroduction dans un milieu contenant du calcium après dissociation, augmentant considérablement cellule rendement. Un autre grand avantage est que les cardiomyocytes de souris néonatales subissent une dédifférenciation plus rapide – cycle de redifférenciation qui se traduit généralement par battant spontanément cellules 20 heures après l'étalement, tout en cardiomyocytes adultes ont généralement besoin de stimulation pour induire la contraction. Cardiomyocytes néonataux sont également plus facilement transfectable avec des méthodes de transfection liposomale, alors que les cardiomyocytes adultes exigent des vecteurs viraux pour la livraison réussie de l'ADN transgénique. Contrairement aux cardiomyocytes néonatauxs, la culture de cardiomyocytes de rongeurs adultes de 11 à 13 permet à des investigations de la dégradation myofibrillaire et rétablissement éventuel de l'appareil contractile. Ces changements morphologiques caractéristiques de cardiomyocytes adultes se produisent sur des périodes de 1-2 semaines. La dédifférenciation – cycle de re-différenciation s'accompagne de réexpression du programme de gène foetal, mimant ainsi les changements pathologiques observées dans les cardiomyopathies humaines 14. Un autre avantage de cardiomyocytes de rats adultes de plus la culture de cardiomyocytes néonataux est la capacité de la culture de ces cellules pendant de longues périodes de temps.
Rat vs cardiomyocytes de souris
L'isolement et la culture des cardiomyocytes néonataux de rat a quelques avantages par rapport à celle des cardiomyocytes néonataux de souris, y compris des rendements plus élevés de cellules viables et une augmentation des taux de transfection. Cependant, la large utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées pour les maladies cardiaques (par exemple </ Em> la lim de protéines musculaires souris knock-out comme modèle pour la cardiomyopathie dilatée 15) a conduit à l'adaptation de la procédure d'isolement pour les cardiomyocytes dérivés de souris néonatales. Bien que les protocoles utilisés pour isoler des cardiomyocytes de rat et de souris néonatales sont presque identiques, plus il faut prendre soin dans le choix d'un mélange d'enzyme approprié pour celui-ci. En effet, les cardiomyocytes de souris néonatales sont généralement plus sensibles à une digestion excessive, résultant dans une cellule-rendement et la viabilité réduite. En outre, la densité de placage doit être ajusté, cardiomyocytes, car dérivées de souris néonatale sont un peu plus petite par rapport à des cellules dérivées de coeurs de rats nouveau-nés.
Avec beaucoup d'utilisations pour l'enquête de paramètres morphologiques, électrophysiologiques, biochimiques, cellulaires biologiques et biomécaniques ainsi que pour le processus de myofibrillogenesis, cardiomyocytes néonataux de culture sont devenus l'un des systèmes les plus polyvalents pour l'étude deles fonctions des cellules cardiaques in vitro. Toutefois, la première étape d'un essai réussi dépend d'une méthodologie simple et fiable pour isoler les cardiomyocytes de souris néonatales. Notre protocole tire sa méthodologie de nombreuses sources et a été optimisée pour la reproductibilité et la robustesse. Nous discutons des facteurs qui influent sur cardiomyocytes rendement et la viabilité, et offrons une variété d'options pour l'optimisation des conditions d'isolement et de culture.
L'utilisation de modèles animaux pour étudier les maladies cardiaques est devenu un standard dans la recherche cardiovasculaire. La caractérisation biochimique rapprocher de ces modèles (c.-à étudier les réponses directes des cellules cardiaques à des stimuli biochimiques ou biomécaniques) nécessite généralement l'isolement des tissus cardiaques ou cardiomyocytes. Les études portant sur les réactions physiologiques du cœur ex vivo (par exemple à l'acétylcholine 4…
The authors have nothing to disclose.
Nous sommes reconnaissants envers le professeur émérite Jean-Claude Perriard et Evelyn Perriard (Institut fédéral suisse de technologie, Suisse) pour l'introduction dans les techniques d'isolation pour rat nouveau-né et les cardiomyocytes de souris. Nous tenons à remercier le professeur Chen Ju et le professeur Sylvia Evans (UCSD, USA) pour leur soutien. Le travail dans le laboratoire de l'EE a été financé par une subvention d'établissement de la MRC de carrière. SL est soutenu par une voie K99/R00 à l'octroi de l'indépendance du NIH / NHLBI (HL107744). TMM a été soutenue par une bourse de recherche postdoctorale de l'American Heart Association (11POST7310066).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
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