Culture del mouse cardiomiociti primari sono uno degli strumenti cardine per l'indagine di organizzazione e la funzione miofibrillare. Il protocollo che segue descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti primari di cuori neonatali mouse. Le risultanti colture di cardiomiociti possono successivamente essere utilizzati per una varietà di biomeccanici, saggi biochimici e cellule biologiche.
Cardiomiociti neonatali in coltura sono stati a lungo utilizzati per studiare myofibrillogenesis e le funzioni miofibrillari. Cardiomiociti in coltura consentono una facile ricerca e manipolazione di vie biochimiche, e il loro effetto sulle proprietà biomeccaniche di battere spontaneamente cardiomiociti.
Il protocollo 2-giorno seguente descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti neonatali di topo. Mostriamo come sezionare facilmente cuore da neonati, dissociare il tessuto cardiaco e arricchire cardiomiociti dalle cellule popolazione cardiaca. Discutiamo l'utilizzo di diversi mix di enzimi per la cella-dissociazione, e dei loro effetti sulla cellula-vitalità. I cardiomiociti isolati possono essere successivamente utilizzati per una varietà di,,, saggi di cellule biologiche o biomeccanica biochimici elettrofisiologici morfologiche. Abbiamo ottimizzato il protocollo per robustezza e riproducibilità, utilizzando solo soluzioni disponibili in commercio e l'enzima mix che shpoca variabilità ow lotto a lotto. Ci rivolgiamo anche a problemi comuni associati con l'isolamento e la coltura di cardiomiociti, e di offrire una varietà di opzioni per l'ottimizzazione delle condizioni di isolamento e coltura.
Le prime relazioni per la dissociazione di successo e coltura di cellule cardiache del roditore risale al 1960 1,2. Anche allora, Harary e Farley notato che cardiomiociti in coltura "possono fornire un sistema unico per lo studio dei requisiti della contrattilità periodica [e possono] fornire un mezzo per determinare il contributo dei vari percorsi metabolici per la [battito] processo". Anche se Harary e Farley cardiomiociti isolati e coltivati da giovani ratti, e il protocollo originale è stato adattato e modificato da molti scienziati nel corso degli anni, la procedura generale isolamento e la coltura non è molto cambiata. Tuttavia, enzimi migliori 3, soluzioni standardizzate 4,5, e l'aggiunta del canale reversibile e miosina ATPasi inibitore BDM per proteggere le cellule durante la procedura di isolamento 6-9 è migliorata significativamente cellula-resa e la fattibilità.
Adulto vs cardiomiopatia neonataleciti
Cardiomiociti isolati e coltivati da topi o ratti neonati hanno diversi vantaggi rispetto colture di cardiomiociti adulti. Primo, la procedura di isolamento di topo o ratto cuori neonatali è più semplice e meno costosa, rispetto all'isolamento di cardiomiociti di topo adulto o ratto 10. Cardiomiociti neonatali sono molto meno sensibili alle reintroduzione in un mezzo contenente calcio dopo dissociazione, aumentando notevolmente cella rendimento. Un altro grande vantaggio è che i cardiomiociti neonatali di topo subiscono una più rapida de-differenziazione – ciclo ridifferenziazione che di solito si traduce in modo spontaneo battere cellule 20 ore dopo la placcatura, mentre cardiomiociti adulti in genere richiedono stimolazione per indurre la contrazione. Cardiomiociti neonatali sono anche più facilmente transfectable con i metodi liposomiale trasfezione, considerando che i cardiomiociti adulti necessitano di vettori virali per la consegna di successo di DNA transgenico. In contrasto con cardiomiociti neonatalis, la cultura dei cardiomiociti roditori adulti 11-13 consente di ricerche di degradazione miofibrillare ed eventuale ripristino dell'apparato contrattile. Questi cambiamenti morfologici caratteristici cardiomiociti adulti avvengono su periodi di 1-2 settimane. Il dedifferentiation – ciclo ridifferenziazione è accompagnata da reexpression del programma gene fetale, imitando in tal modo i cambiamenti patologici osservati in cardiomiopatie umani 14. Un altro vantaggio di cardiomiociti di ratto adulto di coltura di cardiomiociti neonatali è la capacità di coltura queste cellule per lunghi periodi di tempo.
Rat vs cardiomiociti di topo
L'isolamento e la coltura di cardiomiociti neonatali di ratto ha alcuni vantaggi rispetto quella del topo cardiomiociti neonatali, compresi rendimenti più elevati di cellule vitali e un aumento dei tassi di trasfezione. Tuttavia, l'ampio utilizzo di modelli murini geneticamente modificati per le malattie cardiache (es. </ Em> il lim muscolo topo knockout proteine come modello per la cardiomiopatia dilatativa 15) ha portato alla adeguamento della procedura di isolamento di cardiomiociti derivati da topi neonati. Sebbene i protocolli utilizzati per isolare neonatali di ratto e di topo cardiomiociti sono quasi identiche, una maggiore attenzione deve essere posta nella scelta di un mix enzima appropriato per quest'ultimo. Infatti, cardiomiociti neonatali di topo sono generalmente più suscettibili a overdigestion, risultante in una cella rendimento e ridotta vitalità. Inoltre, la densità di placcatura deve essere regolata, perché cardiomiociti derivati da topi neonati sono più piccole rispetto alle cellule derivate da cuori di ratto neonatale.
Con molti usi per le indagini, parametri morfologici, elettrofisiologici, biochimici cellulari-biologica e biomeccanica nonché per il processo di myofibrillogenesis, cardiomiociti neonatali coltivate sono diventati uno dei sistemi più versatili per lo studio difunzioni delle cellule cardiache in vitro. Il primo passo per un saggio di successo però, dipende da una metodologia semplice e affidabile per isolare i cardiomiociti neonatali di topo. Il nostro protocollo trae metodologia da molte fonti e stato ottimizzato per la riproducibilità e robustezza. Discutiamo fattori che influenzano cardiomyocyte rendimento e la redditività, e di fornire una varietà di opzioni per l'ottimizzazione delle condizioni di isolamento e coltura.
L'uso di modelli animali per studiare le malattie cardiache è diventato standard nella ricerca cardiovascolare. Caratterizzazione Closer biochimica di questi modelli (ovvero studiando risposte dirette su cellule cardiache a stimoli biochimici e biomeccanici) richiede in genere l'isolamento dei tessuti cardiaci o cardiomiociti. Gli studi che indagano risposte fisiologiche del cuore ex vivo (ad esempio dell'acetilcolina 40, o in scenari ischemia-riperfusione 41) general…
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati al Prof. emerito Jean-Claude Perriard e Evelyn Perriard (Istituto Federale Svizzero di Tecnologia, Svizzera) per l'introduzione di tecniche di isolamento per ratto neonato e cardiomiociti di topo. Vorremmo ringraziare il Prof. Ju Chen e il Prof. Sylvia Evans (UCSD, USA) per il loro supporto. Il lavoro nel laboratorio di EE è stato finanziato da un MRC Career Istituzione Grant. SL è supportato da un K99/R00 percorso di aggiudicazione indipendenza dal NIH / NHLBI (HL107744). TMM è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dalla American Heart Association (11POST7310066).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
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