初代マウス心筋細胞培養は、筋原線維組織や機能の調査のための極めて重要なツールの一つである。以下のプロトコルは、新生児マウスの心臓から初代心筋細胞の単離および培養について説明します。得られた心筋細胞培養物は、続いて、生体力学的、生化学的および細胞生物学の種々のアッセイに使用することができる。
培養された新生児の心筋細胞は、長いmyofibrillogenesisと筋原線維の機能を研究するために使用されてきた。培養心筋簡単な調査と操作生化学的経路の、そして自然に心筋細胞を破っての生体力学的特性に及ぼす影響を考慮。
次の2日間のプロトコルは、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養について説明します。我々は簡単に、新生児の心臓を解剖心臓組織を解離し、心臓の細胞集団から心筋細胞を豊かにする方法を示しています。我々は、細胞分離のために異なる酵素混合物の使用、および細胞生存性に与える影響を議論。孤立した心筋細胞は、その後、形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的または生体力学的検定のさまざまな目的で使用することができます。私たちは、商業的に利用可能なソリューションを使用することにより、堅牢性と再現性のためのプロトコルを最適化し、酵素がそのSHをミックスOW少しロット間変動。また、心筋細胞の単離および培養に関連する一般的な問題に対処し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供します。
げっ歯類の心臓細胞の正常な解離と文化のための最も初期の報告は、1960年の1,2にさかのぼります。それでも、ハラリィとファーリーは培養心筋細胞は「定期収縮の要件の研究のためのユニークなシステムを提供することができ、[、とあり] [鼓動]プロセスのための様々な代謝経路の寄与を決定する手段を提供する」ことに気づいた。幼若ラット、元のプロトコルからハラリィとファーリー単離し、培養心筋細胞は、長年にわたって適応し、多くの科学者によって変更されているが、一般的な単離·培養手順が大幅に変更されていません。しかし、より良い酵素3、標準化されたソリューションを4,5、および単離手順6-9の間に細胞を保護する可逆チャンネルとミオシンATPアーゼ阻害剤BDMの添加は、細胞収量及び生存率を改善した。
新生児cardiomyo対アダルトcytes
新生児マウスまたはラットから単離し、培養心筋細胞は、成人の心筋細胞の培養液に比べていくつかの利点がある。成体マウスまたはラット10から心筋細胞の単離と比較した場合、まず、新生仔マウスまたはラットの心臓の分離手順は、簡単かつ低コストである。新生児心筋細胞が大幅に細胞収量を増加させる、解離後のカルシウム含有培地中に再導入するためにはるかに敏感である。大人の心筋細胞は、通常、収縮を誘発するためにペーシングが必要ですが、一般的に、めっき後自発的に拍動細胞では20時間後に、その結果、再分化サイクル – もう一つの大きな利点は、新生児マウスの心筋細胞は、より迅速な脱分化を受けることである。新生児の心筋細胞は、成人の心筋細胞は、トランスジェニックDNAの正常な配信のためのウイルスベクターを必要とするのに対して、より容易に、リポソームトランスフェクション法でトランスフェでもある。新生児心筋細胞とは対照的にS、成人の齧歯類心筋細胞11〜13の文化は、筋原線維の劣化と収縮装置の最終的な再構築の検討が可能になります。成人の心筋細胞におけるこれらの特徴的な形態変化は、1〜2週間の期間にわたって発生する。脱分化-再分化サイクルは、それによって人間の心筋症14で観察された病理学的変化を模倣し、胎児の遺伝子プログラムの再発現を伴う。新生児の心筋細胞を培養上の大人のラットの心筋細胞のもう一つの利点は、長期間培養することができることは、これらの細胞である。
マウスの心筋細胞対ラット
ラット新生児心筋細胞の単離および培養は、生細胞のより高い収量の増加、トランスフェクション率を含むマウス新生児の心筋細胞のそれ以上のいくつかの利点があります。しかし、心疾患のため、遺伝子組み換えマウスモデルの幅広い使用方法( 例えば、</ em>は拡張型心筋症15のモデルとして筋肉LIMタンパク質ノックアウトマウス)は、新生児マウス由来の心筋細胞の分離手順の適応につながっている。新生ラットとマウスの心筋細胞を分離するために使用されるプロトコルは、ほとんど同じですが、より大きな注意が、後者のための適切な酵素ミックスの選択に注意する必要があります。実際、新生児マウスの心筋細胞は、減少した細胞収量および生存度で、その結果、一般的には過剰消化を受けやすい。新生仔マウス由来の心筋細胞が新生児ラット心臓由来の細胞と比較してやや小さいのでさらに、播種密度は、調整されるべきである。
形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的および生体力学的パラメータだけでなく、myofibrillogenesisのプロセスのための調査のための多くの用途で、培養された新生児心筋細胞の研究のための最も汎用的なシステムの一つとなっているin vitroでの心臓細胞の機能。成功した検定への第一歩は、しかし、新生児マウスの心筋細胞を分離するための簡単で信頼性の高い方法論に依存します。我々のプロトコルは、多くのソースから、その方法論を引き出し、再現性と堅牢性のために最適化された。我々は心筋細胞の収率および生存率に影響を与える要因について議論し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供しています。
心疾患を研究するための動物モデルを使用することは、心臓血管研究の標準となっている。クローサー( すなわち 、生化学的または生体力学的刺激に心臓細胞の直接の反応を研究する)これらのモデルの生化学的特徴は、一般的に、心臓組織または心筋細胞の単離を必要とする。心の生理学的反応を調査した研究は、生体外 ( 例えば 40をアセチルコリンに対す?…
The authors have nothing to disclose.
私たちは、新生ラットとマウスの心筋細胞の分離技術への導入のための名誉教授ジャン=クロード·PerriardとイヴリンPerriard(テクノロジー、スイスのスイス連邦工科大学)に感謝しています。我々は彼らのサポートのために教授チュ陳教授シルビア·エバンス(UCSD、米国)に感謝したいと思います。 EEの実験室での作業は、MRCキャリア設立助成金によって賄われていた。 SLは、NIH / NHLBI(HL107744)からの独立賞にK99/R00経路によってサポートされています。 TMMは、米国心臓協会(11POST7310066)からのポスドクでサポートされていました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
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