Summary

Isolasjon og kultur av Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Published: September 06, 2013
doi:

Summary

Primære mus cardiomyocyte kulturer er et av de viktigste verktøyene for etterforskning av myofibrillære organisasjon og funksjon. Den følgende protokoll beskriver isolering og kultur av primære kardiomyocytter fra neonatale mus hjerter. De resulterende cardiomyocyte kulturene kan deretter bli benyttet for en rekke biomekaniske, biokjemiske og biologiske celle-analyser.

Abstract

Dyrkede neonatal cardiomyocytes har lenge blitt brukt til å studere myofibrillogenesis og myofibrillære funksjoner. Dyrkede cardiomyocytes gir enkel undersøkelse og manipulasjon av biokjemiske mekanismer, og deres effekt på biomekaniske egenskaper spontant slo cardiomyocytes.

Følgende to-dagers protokollen beskriver isolasjon og kultur av neonatale mus kardiomyocytter. Vi viser hvordan du enkelt kan dissekere hjerter fra nyfødte, distansere hjertevevet og berike cardiomyocytes fra hjerte celle-befolkningen. Vi diskuterer bruk av forskjellige enzymblandinger for celle-dissosiasjon, og deres virkninger på celle-levedyktighet. De isolerte cardiomyocytes kan senere brukes til en rekke ulike morfologiske, elektrofysiologiske, biokjemiske, cellebiologiske og biomekanisk analyse. Vi optimalisert protokollen for robusthet og reproduserbarhet, ved bare å bruke kommersielt tilgjengelige løsninger og enzym blander at show litt mye til lot variasjon. Vi tar også vanlige problemer knyttet til isolasjon og kultur av cardiomyocytes, og tilbyr en rekke alternativer for optimalisering av isolasjon og kulturforhold.

Introduction

De tidligste rapporter for den vellykkede dissosiasjon og kultur av gnager hjerte celler dateres tilbake til 1960-tallet 1,2. Selv da, Harary og Farley lagt merke til at kultur cardiomyocytes "kan gi et unikt system for studier av kravene i den periodiske contractility [, og kan] gi grunnlag for fastsettelse av bidrag fra ulike metabolske veier for [juling] prosess". Selv Harary og Farley isolerte og kultur cardiomyocytes fra unge rotter, og den opprinnelige protokollen har blitt tilpasset og modifisert av mange forskere i løpet av årene, har den generelle isolasjon og dyrking prosedyren ikke sterkt forandret. Imidlertid har bedre enzymer 3, standardiserte løsninger 4,5, og tilsetning av den reversible kanal og myosin ATPase inhibitor BDM for å beskytte celler under isoleringsprosedyren 6-9 vesentlig forbedret celle-utbytte og levedyktighet.

Voksen vs neonatal cardiomyocytes

Cardiomyocytes isolerte og dyrket fra nyfødte mus eller rotter har flere fordeler i forhold til kulturer av voksne cardiomyocytes. Fremst, er isolasjonsmetoden for neonatale mus-eller rottehjerter enklere og mindre kostbare, sammenlignet med isolering av kardiomyocytter fra voksne mus eller rotter 10. Neonatal cardiomyocytes er langt mindre følsom overfor gjeninnføringen inn i en kalsium-inneholdende medium etter dissosiasjon, i stor grad øke celle-utbytte. En annen stor fordel er at neonatale mus kardiomyocytter gjennomgå en raskere dedifferentiation – redifferentiation syklus som vanligvis resulterer i spontant slo celler 20 timer etter plating, mens voksne cardiomyocytes vanligvis krever pacing å indusere sammentrekning. Neonatal cardiomyocytes er også lettere transfectable med liposomal transfeksjonsmetoder, mens voksne cardiomyocytes krever virale vektorer for vellykket levering av transgen DNA. I motsetning til neonatal cardiomyocytes, kultur av voksne gnager kardiomyocytter 11-13 åpner for undersøkelser av myofibrillære fornedrelse og eventuell reetablering av kontraktile apparatet. Disse karakteristiske morfologiske forandringer hos voksne cardiomyocytes oppstår over perioder på 1-2 uker. Den dedifferentiation – redifferentiation syklus er ledsaget av reexpression av fosterets genet programmet, dermed etterligne patologiske forandringer observert i menneske cardiomyopathies 14. En annen fordel av voksne rotte cardiomyocytes over kultur av neonatal cardiomyocytes er evnen til kulturen disse cellene i lange perioder av gangen.

Rat vs mus cardiomyocytes

Isolasjon og kultur av rotte neonatal cardiomyocytes har noen fordeler over at muse neonatal cardiomyocytes, inkludert høyere avkastning av levedyktige celler og økt transfeksjon priser. Men den brede bruken av genmodifiserte mus modeller for hjertesykdommer (f.eks </ Em> muskel lim protein knockout mus som modell for dilatert kardiomyopati 15) har ført til tilpasning av isolasjonsmetoden for cardiomyocytes avledet fra neonatale mus. Selv om protokollene som brukes for å isolere neonatale rotter og mus cardiomyocytes er nesten identiske, må større forsiktighet tas ved valg av en passende enzym blanding for sistnevnte. Faktisk, neonatale mus cardiomyocytes er generelt mer utsatt for overdigestion, noe som resulterer i en redusert celle-utbyttet og levedyktighet. Videre bør plette densitet justeres, fordi kardiomyocytter avledet fra neonatale mus er noe mindre i forhold til celler avledet fra neonatale rotte-hjerter.

Med mange bruksområder for etterforskningen av morfologiske, elektrofysiologiske, biokjemiske, cellebiologisk og biomekaniske parametere samt for prosessen med myofibrillogenesis, har kultur neonatal cardiomyocytes blitt en av de mest allsidige systemer for studiet avhjertecellefunksjoner in vitro. Det første skrittet til en vellykket analyse avhenger imidlertid av en enkel og pålitelig metode for å isolere neonatale mus kardiomyocytter. Vår protokoll trekker sin metodikk fra mange kilder og er optimalisert for reproduserbarhet og robusthet. Vi diskuterer faktorer som påvirker cardiomyocyte-yield og levedyktighet, og gir en rekke alternativer for optimalisering av isolasjon og kulturforhold.

Protocol

Følgende prosedyre beskriver en to-dagers protokollen 16,17 for isolering og kultur av neonatale mus kardiomyocytter. Alle løsninger er sterile eller sterile filtrert. Alle verktøy er sterilisert ved overflaten sterilisering med 75% etanol. Bortsett fra den innledende vev ekstraksjon, blir alle trinnene utføres i en steril laminær cellekultur hette. Denne protokollen er beregnet for isolering av neonatale mus hjerter 1-2 kull (e) – omtrent 5-14 pups, men kan tilpasses for større kullstørrelse og neonat…

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen, vi isolert hjerter fra åtte én dag gammel neonatal mus (figur 1A, 1B, Supplemental Movie S1). Etter vasking og hakking hjerter med saksen (figurene 1C-1F), ble vev fragmenter predigested isolert medium over natten ved 4 ° C med forsiktig omrøring. Etter predigestion (fig. 1G), vi overført vev fragmenter inn i nylaget fordøyelse medium, og inkubert vevet fragmenter i 20 min ved 37 ° C med forsiktig omrøring. Den resulterende celles…

Discussion

Bruken av dyremodeller for å undersøke hjertesykdommer er blitt standard i hjerte-forskning. Nærmere biokjemiske karakterisering av disse modellene (dvs. å studere direkte responsene til hjerteceller for biokjemiske eller biomekaniske stimuli) krever typisk isolering av hjerte-vev eller kardiomyocytter. Studier som undersøker fysiologiske responser av hjertet ex vivo (f.eks til acetylkolin 40, eller i iskemi-reperfusjon scenarier 41) generelt utnytte Langendorff-perfundert he…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er takknemlige til professor emeritus Jean-Claude Perriard og Evelyn Perriard (Swiss Federal Institute of Technology, Sveits) for innføring i isolasjon teknikker for neonatal rotte og mus kardiomyocytter. Vi vil gjerne takke Prof Ju Chen og professor Sylvia Evans (UCSD, USA) for deres støtte. Arbeidet i laboratoriet av EE ble finansiert av en MRC Career Etablering Grant. SL er støttet av en K99/R00 vei til uavhengighet award fra NIH / NHLBI (HL107744). TMM ble støttet av en postdoktorstilling fra American Heart Association (11POST7310066).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 Sigma B-0753 prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase Roche 10269638001 can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3 Worthington CLS-2 substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA e.g. cellgro 25-053-CI  
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS e.g. cellgro 30-002-Cl  
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) e,g, cellgro 21-040-CV  
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 e.g. cellgro 21-022-CV  
DMEM high glucose e.g. cellgro 10-013-CV  
M-199 e.g. cellgro 10-060-CV  
fetal bovine serum e.g. cellgro 35-011-CV cell-culture grade
horse serum e.g. cellgro 35-030-CV cell-culture grade
Leibovitz L-155 e.g. cellgro 10-045-CV  
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) Sigma C-6645 proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine Sigma P-6126 chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride Sigma I-6501 chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution Sigma C-8919 extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution Advanced BioMatrix 5005-B alternative to Sigma collagen solution
cell strainer e.g. Fisherbrand 22363548 appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm e.g. Fisherbrand 09-719C for sterile filtration of digestion medium
straight scissors e.g. Fine Sciences Tools 91460-11  
curved scissors e.g. Fine Science Tools 91461-11  
Dumont No. 7 forceps e.g. Fine Science Tools 91197-00  
perforated spoon e.g. Fine Science Tools 10370-19 optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue e.g. Gibco 15250-061 live cell staining
Neubauer hemocytometer e.g. Prosource Scientific 3500 alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes e.g. Fisherbrand 14-432-23  
15 ml Falcon tubes e.g. Fisherbrand 05-527-90  
20 ml syringe e.g. BD Medical 14-820-19  
10 ml serological pipette e.g. Falcon 357551  
30 mm cell culture dish e.g. Nunc 153066 for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom MatTek P35G-0-10-C for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish e.g. Nunc 172958 for preplating
Escort III Sigma L3037 for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000 Life Technologies, Invitrogen 52887 substitute for Escort III
      Buffers and media:
  • Isolation medium (filter sterilize)
    20 mM BDM
    0.0125% trypsin
    in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)
  • Digestion medium (filter sterilize)
    20 mM BDM
    1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix
    in L15 medium
  • Plating medium
    65% DMEM high glucose
    19% M-199
    10% horse serum
    5% fetal calf serum
    1% penicillin/streptomycin
  • Maintenance medium
    78% DMEM high glucose
    17% M-199
    4% horse serum
    1% penicillin/streptomycin
    optional:
    1 μM AraC
    1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine
The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.

References

  1. Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131, 1674-1675 (1960).
  2. Harary, I., Farley, B. In vitro studies on single beating rat heart cells. I. Growth and organization. Exp. Cell Res. 29, 451-465 (1963).
  3. Worthington Biochemical Corp. . Worthington Enzyme Manual. , (2012).
  4. Hanks, J. H., Wallace, R. E. Relation of oxygen and temperature in the preservation of tissues by refrigeration. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71, 196-200 (1949).
  5. Leibovitz, A. The Growth and Maintenance of Tissue-Cell Cultures in Free Gas Exchange with the Atmosphere. Am. J. Hyg. 78, 173-180 (1963).
  6. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ. Res. 65, 1441-1449 (1989).
  7. Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1, 61-72 (2001).
  8. Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. 272, 875-885 (1997).
  9. Allen, T. J., Chapman, R. A. The effect of a chemical phosphatase on single calcium channels and the inactivation of whole-cell calcium current from isolated guinea-pig ventricular myocytes. Pflugers Arch. 430, 68-80 (1995).
  10. Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Cultured adult cardiac myocytes: future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties. Cardiovasc. Res. 39, 280-300 (1998).
  11. Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 14, 397-412 (1982).
  12. Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev. Biol. 80, 466-482 (1980).
  13. Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130, 1-15 (1988).
  14. Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends Cardiovasc Med. 4, 187-193 (1994).
  15. Arber, S., et al. MLP-deficient mice exhibit a disruption of cardiac cytoarchitectural organization, dilated cardiomyopathy, and heart failure. Cell. 88, 393-403 (1997).
  16. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  17. Worthington Biochemical Corp. . Worthington Tissue Dissection Guide. , (2012).
  18. Bashor, M. M. Dispersion and disruption of tissues. Methods Enzymol. 58, 119-131 (1979).
  19. Speicher, D. W., McCarl, R. L. Pancreatic enzyme requirements for the dissociation of rat hearts for culture. In Vitro. 10, 30-41 (1974).
  20. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Exp Cell Res. 53, 1-10 (1968).
  21. Freshney, R. I. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , (2010).
  22. Lange, S., Perera, S., Teh, P., Chen, J. Obscurin and KCTD6 regulate cullin-dependent small ankyrin-1 (sAnk1.5) protein turnover. Mol Biol Cell. , (2012).
  23. Sen, A., Dunnmon, P., Henderson, S. A., Gerard, R. D., Chien, K. R. Terminally differentiated neonatal rat myocardial cells proliferate and maintain specific differentiated functions following expression of SV40 large T antigen. J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 (1988).
  24. Evans, H. J., Goodwin, R. L. Western array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Mol. Cell Biochem. 303, 189-199 (2007).
  25. Bakunts, K., Gillum, N., Karabekian, Z., Sarvazyan, N. Formation of cardiac fibers in Matrigel matrix. Biotechniques. 44, 341-348 (2008).
  26. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, 669-679 (2000).
  27. Nawroth, J. C., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat. Biotechnol. 30, 792-797 (2012).
  28. Das, M., et al. Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on an organosilane surface in a serum-free medium. Biomaterials. 25, 5643-5647 (2004).
  29. DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PLoS One. 5, e13039 (2010).
  30. VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiogel: a biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 32, 478-485 (1996).
  31. Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128, 376-382 (1985).
  32. Steinhelper, M. E., et al. Proliferation in vivo and in culture of differentiated adult atrial cardiomyocytes from transgenic mice. Am. J. Physiol. 259, H1826-H1834 (1990).
  33. Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J. Cell Sci. 117, 3295-3306 (2004).
  34. Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E., Chien, K. R. Alpha- beta-adrenergic stimulation induces distinct patterns of immediate early gene expression in neonatal rat myocardial cells. fos/jun expression is associated with sarcomere assembly; Egr-1 induction is primarily an alpha 1-mediated response. J. Biol. Chem. 265, 13809-13817 (1990).
  35. Kirshenbaum, L. A., MacLellan, W. R., Mazur, W., French, B. A., Schneider, M. D. Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus. J. Clin. Invest. 92, 381-387 (1993).
  36. Maeda, Y., et al. Adeno-associated virus-mediated transfer of endothelial nitric oxide synthase gene inhibits protein synthesis of rat ventricular cardiomyocytes. Cardiovasc Drugs Ther. 15, 19-24 (2001).
  37. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic Res. Cardiol. 97, 348-358 (2002).
  38. Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Mol. Biotechnol. 28, 21-32 (2004).
  39. van Bever, L., et al. Pore loop-mutated rat KIR6.1 and KIR6.2 suppress KATP current in rat cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, 850-859 (2004).
  40. Sakai, K., Akima, M., Tsuyama, K. Evaluation of the isolated perfused heart of mice, with special reference to vasoconstriction caused by intracoronary acetylcholine. J. Pharmacol Methods. 10, 263-270 (1983).
  41. Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94, 54-70 (2009).
  42. Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. J. Vis. Exp. (42), e2069 (2010).
  43. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
  44. Zakharova, L., Nural-Guvener, H., Gaballa, M. A. Cardiac explant-derived cells are regulated by Notch-modulated mesenchymal transition. PLoS One. 7, e37800 (2012).
  45. Rudy, D. E., Yatskievych, T. A., Antin, P. B., Gregorio, C. C. Assembly of thick, thin, and titin filaments in chick precardiac explants. Dev. Dyn. 221, 61-71 (2001).
  46. Thum, T., Borlak, J. Reprogramming of gene expression in cultured cardiomyocytes and in explanted hearts by the myosin ATPase inhibitor butanedione monoxime. Transplantation. 71, 543-552 (2001).
  47. Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 294, H1667-H1674 (2008).

Play Video

Cite This Article
Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (79), e50154, doi:10.3791/50154 (2013).

View Video