Isolasjon og kultur av Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Summary

Primære mus cardiomyocyte kulturer er et av de viktigste verktøyene for etterforskning av myofibrillære organisasjon og funksjon. Den følgende protokoll beskriver isolering og kultur av primære kardiomyocytter fra neonatale mus hjerter. De resulterende cardiomyocyte kulturene kan deretter bli benyttet for en rekke biomekaniske, biokjemiske og biologiske celle-analyser.

Abstract

Dyrkede neonatal cardiomyocytes har lenge blitt brukt til å studere myofibrillogenesis og myofibrillære funksjoner. Dyrkede cardiomyocytes gir enkel undersøkelse og manipulasjon av biokjemiske mekanismer, og deres effekt på biomekaniske egenskaper spontant slo cardiomyocytes.

Følgende to-dagers protokollen beskriver isolasjon og kultur av neonatale mus kardiomyocytter. Vi viser hvordan du enkelt kan dissekere hjerter fra nyfødte, distansere hjertevevet og berike cardiomyocytes fra hjerte celle-befolkningen. Vi diskuterer bruk av forskjellige enzymblandinger for celle-dissosiasjon, og deres virkninger på celle-levedyktighet. De isolerte cardiomyocytes kan senere brukes til en rekke ulike morfologiske, elektrofysiologiske, biokjemiske, cellebiologiske og biomekanisk analyse. Vi optimalisert protokollen for robusthet og reproduserbarhet, ved bare å bruke kommersielt tilgjengelige løsninger og enzym blander at show litt mye til lot variasjon. Vi tar også vanlige problemer knyttet til isolasjon og kultur av cardiomyocytes, og tilbyr en rekke alternativer for optimalisering av isolasjon og kulturforhold.

Introduction

De tidligste rapporter for den vellykkede dissosiasjon og kultur av gnager hjerte celler dateres tilbake til 1960-tallet ^1,2. Selv da, Harary og Farley lagt merke til at kultur cardiomyocytes "kan gi et unikt system for studier av kravene i den periodiske contractility [, og kan] gi grunnlag for fastsettelse av bidrag fra ulike metabolske veier for [juling] prosess". Selv Harary og Farley isolerte og kultur cardiomyocytes fra unge rotter, og den opprinnelige protokollen har blitt tilpasset og modifisert av mange forskere i løpet av årene, har den generelle isolasjon og dyrking prosedyren ikke sterkt forandret. Imidlertid har bedre enzymer ^3, standardiserte løsninger ^4,5, og tilsetning av den reversible kanal og myosin ATPase inhibitor BDM for å beskytte celler under isoleringsprosedyren ^6-9 vesentlig forbedret celle-utbytte og levedyktighet.

Voksen vs neonatal cardiomyocytes

Cardiomyocytes isolerte og dyrket fra nyfødte mus eller rotter har flere fordeler i forhold til kulturer av voksne cardiomyocytes. Fremst, er isolasjonsmetoden for neonatale mus-eller rottehjerter enklere og mindre kostbare, sammenlignet med isolering av kardiomyocytter fra voksne mus eller rotter ^10. Neonatal cardiomyocytes er langt mindre følsom overfor gjeninnføringen inn i en kalsium-inneholdende medium etter dissosiasjon, i stor grad øke celle-utbytte. En annen stor fordel er at neonatale mus kardiomyocytter gjennomgå en raskere dedifferentiation – redifferentiation syklus som vanligvis resulterer i spontant slo celler 20 timer etter plating, mens voksne cardiomyocytes vanligvis krever pacing å indusere sammentrekning. Neonatal cardiomyocytes er også lettere transfectable med liposomal transfeksjonsmetoder, mens voksne cardiomyocytes krever virale vektorer for vellykket levering av transgen DNA. I motsetning til neonatal cardiomyocytes, kultur av voksne gnager kardiomyocytter ^11-13 åpner for undersøkelser av myofibrillære fornedrelse og eventuell reetablering av kontraktile apparatet. Disse karakteristiske morfologiske forandringer hos voksne cardiomyocytes oppstår over perioder på 1-2 uker. Den dedifferentiation – redifferentiation syklus er ledsaget av reexpression av fosterets genet programmet, dermed etterligne patologiske forandringer observert i menneske cardiomyopathies ^14. En annen fordel av voksne rotte cardiomyocytes over kultur av neonatal cardiomyocytes er evnen til kulturen disse cellene i lange perioder av gangen.

Rat vs mus cardiomyocytes

Isolasjon og kultur av rotte neonatal cardiomyocytes har noen fordeler over at muse neonatal cardiomyocytes, inkludert høyere avkastning av levedyktige celler og økt transfeksjon priser. Men den brede bruken av genmodifiserte mus modeller for hjertesykdommer (f.eks </ Em> muskel lim protein knockout mus som modell for dilatert kardiomyopati ¹⁵⁾ har ført til tilpasning av isolasjonsmetoden for cardiomyocytes avledet fra neonatale mus. Selv om protokollene som brukes for å isolere neonatale rotter og mus cardiomyocytes er nesten identiske, må større forsiktighet tas ved valg av en passende enzym blanding for sistnevnte. Faktisk, neonatale mus cardiomyocytes er generelt mer utsatt for overdigestion, noe som resulterer i en redusert celle-utbyttet og levedyktighet. Videre bør plette densitet justeres, fordi kardiomyocytter avledet fra neonatale mus er noe mindre i forhold til celler avledet fra neonatale rotte-hjerter.

Med mange bruksområder for etterforskningen av morfologiske, elektrofysiologiske, biokjemiske, cellebiologisk og biomekaniske parametere samt for prosessen med myofibrillogenesis, har kultur neonatal cardiomyocytes blitt en av de mest allsidige systemer for studiet avhjertecellefunksjoner in vitro. Det første skrittet til en vellykket analyse avhenger imidlertid av en enkel og pålitelig metode for å isolere neonatale mus kardiomyocytter. Vår protokoll trekker sin metodikk fra mange kilder og er optimalisert for reproduserbarhet og robusthet. Vi diskuterer faktorer som påvirker cardiomyocyte-yield og levedyktighet, og gir en rekke alternativer for optimalisering av isolasjon og kulturforhold.

Protocol

Følgende prosedyre beskriver en to-dagers protokollen 16,17 for isolering og kultur av neonatale mus kardiomyocytter. Alle løsninger er sterile eller sterile filtrert. Alle verktøy er sterilisert ved overflaten sterilisering med 75% etanol. Bortsett fra den innledende vev ekstraksjon, blir alle trinnene utføres i en steril laminær cellekultur hette. Denne protokollen er beregnet for isolering av neonatale mus hjerter 1-2 kull (e) – omtrent 5-14 pups, men kan tilpasses for større kullstørrelse og neonat…

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen, vi isolert hjerter fra åtte én dag gammel neonatal mus (figur 1A, 1B, Supplemental Movie S1). Etter vasking og hakking hjerter med saksen (figurene 1C-1F), ble vev fragmenter predigested isolert medium over natten ved 4 ° C med forsiktig omrøring. Etter predigestion (fig. 1G), vi overført vev fragmenter inn i nylaget fordøyelse medium, og inkubert vevet fragmenter i 20 min ved 37 ° C med forsiktig omrøring. Den resulterende celles…

Discussion

Bruken av dyremodeller for å undersøke hjertesykdommer er blitt standard i hjerte-forskning. Nærmere biokjemiske karakterisering av disse modellene (dvs. å studere direkte responsene til hjerteceller for biokjemiske eller biomekaniske stimuli) krever typisk isolering av hjerte-vev eller kardiomyocytter. Studier som undersøker fysiologiske responser av hjertet ex vivo (f.eks til acetylkolin ^40, eller i iskemi-reperfusjon scenarier ⁴¹⁾ generelt utnytte Langendorff-perfundert he…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.