Primære mus cardiomyocyte kulturer er et av de viktigste verktøyene for etterforskning av myofibrillære organisasjon og funksjon. Den følgende protokoll beskriver isolering og kultur av primære kardiomyocytter fra neonatale mus hjerter. De resulterende cardiomyocyte kulturene kan deretter bli benyttet for en rekke biomekaniske, biokjemiske og biologiske celle-analyser.
Dyrkede neonatal cardiomyocytes har lenge blitt brukt til å studere myofibrillogenesis og myofibrillære funksjoner. Dyrkede cardiomyocytes gir enkel undersøkelse og manipulasjon av biokjemiske mekanismer, og deres effekt på biomekaniske egenskaper spontant slo cardiomyocytes.
Følgende to-dagers protokollen beskriver isolasjon og kultur av neonatale mus kardiomyocytter. Vi viser hvordan du enkelt kan dissekere hjerter fra nyfødte, distansere hjertevevet og berike cardiomyocytes fra hjerte celle-befolkningen. Vi diskuterer bruk av forskjellige enzymblandinger for celle-dissosiasjon, og deres virkninger på celle-levedyktighet. De isolerte cardiomyocytes kan senere brukes til en rekke ulike morfologiske, elektrofysiologiske, biokjemiske, cellebiologiske og biomekanisk analyse. Vi optimalisert protokollen for robusthet og reproduserbarhet, ved bare å bruke kommersielt tilgjengelige løsninger og enzym blander at show litt mye til lot variasjon. Vi tar også vanlige problemer knyttet til isolasjon og kultur av cardiomyocytes, og tilbyr en rekke alternativer for optimalisering av isolasjon og kulturforhold.
De tidligste rapporter for den vellykkede dissosiasjon og kultur av gnager hjerte celler dateres tilbake til 1960-tallet 1,2. Selv da, Harary og Farley lagt merke til at kultur cardiomyocytes "kan gi et unikt system for studier av kravene i den periodiske contractility [, og kan] gi grunnlag for fastsettelse av bidrag fra ulike metabolske veier for [juling] prosess". Selv Harary og Farley isolerte og kultur cardiomyocytes fra unge rotter, og den opprinnelige protokollen har blitt tilpasset og modifisert av mange forskere i løpet av årene, har den generelle isolasjon og dyrking prosedyren ikke sterkt forandret. Imidlertid har bedre enzymer 3, standardiserte løsninger 4,5, og tilsetning av den reversible kanal og myosin ATPase inhibitor BDM for å beskytte celler under isoleringsprosedyren 6-9 vesentlig forbedret celle-utbytte og levedyktighet.
Voksen vs neonatal cardiomyocytes
Cardiomyocytes isolerte og dyrket fra nyfødte mus eller rotter har flere fordeler i forhold til kulturer av voksne cardiomyocytes. Fremst, er isolasjonsmetoden for neonatale mus-eller rottehjerter enklere og mindre kostbare, sammenlignet med isolering av kardiomyocytter fra voksne mus eller rotter 10. Neonatal cardiomyocytes er langt mindre følsom overfor gjeninnføringen inn i en kalsium-inneholdende medium etter dissosiasjon, i stor grad øke celle-utbytte. En annen stor fordel er at neonatale mus kardiomyocytter gjennomgå en raskere dedifferentiation – redifferentiation syklus som vanligvis resulterer i spontant slo celler 20 timer etter plating, mens voksne cardiomyocytes vanligvis krever pacing å indusere sammentrekning. Neonatal cardiomyocytes er også lettere transfectable med liposomal transfeksjonsmetoder, mens voksne cardiomyocytes krever virale vektorer for vellykket levering av transgen DNA. I motsetning til neonatal cardiomyocytes, kultur av voksne gnager kardiomyocytter 11-13 åpner for undersøkelser av myofibrillære fornedrelse og eventuell reetablering av kontraktile apparatet. Disse karakteristiske morfologiske forandringer hos voksne cardiomyocytes oppstår over perioder på 1-2 uker. Den dedifferentiation – redifferentiation syklus er ledsaget av reexpression av fosterets genet programmet, dermed etterligne patologiske forandringer observert i menneske cardiomyopathies 14. En annen fordel av voksne rotte cardiomyocytes over kultur av neonatal cardiomyocytes er evnen til kulturen disse cellene i lange perioder av gangen.
Rat vs mus cardiomyocytes
Isolasjon og kultur av rotte neonatal cardiomyocytes har noen fordeler over at muse neonatal cardiomyocytes, inkludert høyere avkastning av levedyktige celler og økt transfeksjon priser. Men den brede bruken av genmodifiserte mus modeller for hjertesykdommer (f.eks </ Em> muskel lim protein knockout mus som modell for dilatert kardiomyopati 15) har ført til tilpasning av isolasjonsmetoden for cardiomyocytes avledet fra neonatale mus. Selv om protokollene som brukes for å isolere neonatale rotter og mus cardiomyocytes er nesten identiske, må større forsiktighet tas ved valg av en passende enzym blanding for sistnevnte. Faktisk, neonatale mus cardiomyocytes er generelt mer utsatt for overdigestion, noe som resulterer i en redusert celle-utbyttet og levedyktighet. Videre bør plette densitet justeres, fordi kardiomyocytter avledet fra neonatale mus er noe mindre i forhold til celler avledet fra neonatale rotte-hjerter.
Med mange bruksområder for etterforskningen av morfologiske, elektrofysiologiske, biokjemiske, cellebiologisk og biomekaniske parametere samt for prosessen med myofibrillogenesis, har kultur neonatal cardiomyocytes blitt en av de mest allsidige systemer for studiet avhjertecellefunksjoner in vitro. Det første skrittet til en vellykket analyse avhenger imidlertid av en enkel og pålitelig metode for å isolere neonatale mus kardiomyocytter. Vår protokoll trekker sin metodikk fra mange kilder og er optimalisert for reproduserbarhet og robusthet. Vi diskuterer faktorer som påvirker cardiomyocyte-yield og levedyktighet, og gir en rekke alternativer for optimalisering av isolasjon og kulturforhold.
Bruken av dyremodeller for å undersøke hjertesykdommer er blitt standard i hjerte-forskning. Nærmere biokjemiske karakterisering av disse modellene (dvs. å studere direkte responsene til hjerteceller for biokjemiske eller biomekaniske stimuli) krever typisk isolering av hjerte-vev eller kardiomyocytter. Studier som undersøker fysiologiske responser av hjertet ex vivo (f.eks til acetylkolin 40, eller i iskemi-reperfusjon scenarier 41) generelt utnytte Langendorff-perfundert he…
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til professor emeritus Jean-Claude Perriard og Evelyn Perriard (Swiss Federal Institute of Technology, Sveits) for innføring i isolasjon teknikker for neonatal rotte og mus kardiomyocytter. Vi vil gjerne takke Prof Ju Chen og professor Sylvia Evans (UCSD, USA) for deres støtte. Arbeidet i laboratoriet av EE ble finansiert av en MRC Career Etablering Grant. SL er støttet av en K99/R00 vei til uavhengighet award fra NIH / NHLBI (HL107744). TMM ble støttet av en postdoktorstilling fra American Heart Association (11POST7310066).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|