Primära mus cardiomyocyte kulturer är en av de centrala verktygen för att utreda myofibrillar organisation och funktion. Följande protokoll beskriver isolering och odling av primära kardiomyocyter från neonatal mouse hearts. De resulte cardiomyocyte kulturer kan därefter användas för en mångfald av biomekaniska, biokemiska och cellbiologiska analyser.
Odlade neonatala hjärtmuskelceller har länge använts för att studera myofibrillogenesis och myofibrillära funktioner. Odlade hjärtmuskelceller möjliggör enkel utredning och hantering av biokemiska vägar, och deras effekt på de biomekaniska egenskaperna av spontant slående hjärtmuskelceller.
Följande 2-dagars protokoll beskriver isolering och odling av nyfödda mus cardiomyocytes. Vi visar hur du enkelt dissekera hjärtan från nyfödda, dissociera hjärtvävnad och berika cardiomyocytes från hjärt-cell-populationen. Vi diskuterar användningen av olika enzymblandningar för cell-dissociation, och deras effekter på cell-livskraft. De isolerade kardiomyocyter därefter kan användas för en variation av morfologiska, elektrofysiologiska, biokemiska, cellbiologiska eller biomekaniska analyser. Vi optimerat protokoll för robusthet och reproducerbarhet, genom att endast använda kommersiellt tillgängliga lösningar och enzym blandar att show litet parti till parti variabilitet. Vi vänder oss också vanliga problem i samband med isolering och odling av hjärtmuskelceller, och erbjuder en mängd olika alternativ för optimering av isolerings-och odlingsförhållanden.
De tidigaste rapporterna för den framgångsrika dissociation och kultur av gnagare hjärtceller går tillbaka till 1960-talet 1,2. Även då Harary och Farley märkt att odlade hjärtmuskelceller "kan ge ett unikt system för studier av kraven i den periodiska kontraktilitet [och kan] ge ett sätt att fastställa bidraget av olika metaboliska vägar för [stryk] process". Även Harary och Farley isolerade och odlade hjärtmuskelceller från unga råttor, och det ursprungliga protokollet har anpassats och modifierats av många forskare genom åren, har den allmänna isolering och odling förfarandet inte mycket förändrats. Dock har bättre enzymer 3, standardiserade lösningar 4,5, och tillsats av den reversibla kanal och myosin ATPase inhibitor BDM att skydda celler under isoleringsförfarandet 6-9 signifikant förbättrad cellutbyte och viabilitet.
Vuxen vs neonatal cardiomyocyter
Cardiomyocytes isolerade och odlade från neonatala möss eller råttor har flera fördelar jämfört med kulturer av vuxna hjärtmuskelceller. Främst, är isoleringsförfarandet för neonatal mus-eller råtthjärtan enklare och billigare, jämfört med isolering av kardiomyocyter från vuxen mus eller råtta 10. Neonatal cardiomyocytes är mycket mindre känsliga för återinförande till en kalciuminnehållande mediet efter dissociation, kraftigt ökar cell-avkastning. En annan stor fördel är att neonatal mus cardiomyocytes genomgå en snabbare dedifferentiering – redifferentiering cykel som oftast resulterar i spontant slående celler 20 timmar efter plätering, medan vuxna cardiomyocytes kräver normalt pacing att inducera kontraktion. Neonatal cardiomyocytes är också lättare transfekterbara med liposomalt transfektion metoder, medan vuxna cardiomyocytes kräver virala vektorer för framgångsrik leverans av transgent DNA. I motsats till neonatal cardiomyocytes, kultur av vuxna gnagare cardiomyocytes 11-13 möjliggör undersökningar av myofibrillar nedbrytning och slutligen återupprättande av den kontraktila apparaten. Dessa karakteristiska morfologiska förändringar hos vuxna hjärtmuskelceller uppstår under perioder om 1-2 veckor. Den dedifferentiering – redifferentiering cykeln åtföljs av reexpression av fostrets genen programmet och därigenom härma sjukliga förändringar som observerats i humana kardiomyopati 14. En annan fördel av vuxna råttkardiomyocyter under odlingen av neonatala kardiomyocyter är förmågan att odla dessa celler under längre tidsperioder.
Rat vs mouse kardiomyocyter
Isolering och odling av råttneonatala kardiomyocyter har vissa fördelar jämfört med den hos mus-neonatala kardiomyocyter, inklusive högre utbyten av viabla celler och ökade transfektion hastigheter. Men den breda användningen av genetiskt modifierade musmodeller för hjärtsjukdomar (t ex </ Em> muskel lim protein knockout-mus som modell för dilaterad kardiomyopati 15) har lett till en anpassning av isoleringsförfarandet för cardiomyocytes härrör från neonatala möss. Trots att de protokoll som används för att isolera neonatal råtta och mus kardiomyocyter är nästan identiska bör större försiktighet iakttas vid val av en lämplig enzymblandning för den senare. Indeed, neonatal mouse kardiomyocyter i allmänhet är mer mottagliga för overdigestion, vilket resulterar i en reducerad cellavkastning och viabilitet. Dessutom bör pläteringen densitet justeras, eftersom kardiomyocyter härledda från neonatala möss är något mindre jämfört med celler som härrör från neonatala råtthjärtan.
Med många användningsområden för utredningen av morfologiska, elektrofysiologiska, biokemiska, cellbiologiska och biomekaniska parametrar samt för arbetet med myofibrillogenesis har odlade neonatala hjärtmuskelceller blivit en av de mest mångsidiga system för att studerahjärtcellfunktioner in vitro. Det första steget till en framgångsrik analys dock, beroende på en enkel och tillförlitlig metod för att isolera neonatal mus cardiomyocytes. Vår protokoll drar sin metodik från många källor och var optimerad för reproducerbarhet och robusthet. Vi diskuterar faktorer som påverkar cardiomyocyte-avkastning och lönsamhet, och ger en mängd olika alternativ för optimering av isolerings-och odlingsförhållanden.
Användningen av djurmodeller för att studera hjärtsjukdomar har blivit standard i kardiovaskulär forskning. Närmare biokemisk karakterisering av dessa modeller (dvs. studerar direkta svar av hjärtceller till biokemiska och biomekaniska stimuli) kräver vanligen isolering av hjärt vävnader eller hjärtmuskelceller. Studier som undersöker fysiologiska reaktioner i hjärtat ex vivo (t.ex. för att acetylkolin 40, eller i ischemi-reperfusion scenarier 41) i allmänhet utnyttj…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma till professor emeritus Jean-Claude Perriard och Evelyn Perriard (Swiss Federal Institute of Technology, Schweiz) att föra in isoleringstekniker för neonatal råtta och mus cardiomyocytes. Vi vill tacka professor Ju Chen och professor Sylvia Evans (UCSD, USA) för deras stöd. Arbetet i laboratoriet av EE har finansierats av en MRC Career Establishment Grant. SL stöds av en K99/R00 väg till självständighet utmärkelse från NIH / NHLBI (HL107744). TMM fick stöd av ett postdoktorsstipendium från American Heart Association (11POST7310066).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|