Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.
Kultivierten neonatalen Kardiomyozyten seit langem verwendet, um Myofibrillogenese und myofibrillären Funktionen zu studieren. Kultivierte Kardiomyozyten ermöglichen eine einfache Untersuchung und Manipulation von biochemischen Wege, und ihre Wirkung auf die biomechanischen Eigenschaften des spontan schlagenden Herzmuskelzellen.
Die folgende 2-Tages-Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus. Wir zeigen, wie leicht zu sezieren Herzen von Neugeborenen, distanzieren das Herzgewebe und bereichern Kardiomyozyten aus dem Herz-Zell-Population. Wir diskutieren den Einsatz von verschiedenen Enzymmischungen für Zell-Dissoziation und ihre Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit. Die isolierten Herzmuskelzellen kann anschließend für eine Vielzahl von morphologischen, elektrophysiologischen, biochemischen und zellbiologischen biomechanische Tests verwendet werden. Wir optimieren das Protokoll für die Robustheit und Reproduzierbarkeit, indem nur kommerziell erhältlichen Lösungen und Enzymmischungen, dass show wenig viel-zu-viel Variabilität. Wir wenden uns auch gemeinsame Probleme mit der Isolierung und Kultivierung von Herzmuskelzellen verbunden und bieten eine Vielzahl von Optionen für die Optimierung der Isolation und der Kulturbedingungen.
Die frühesten Berichte für die erfolgreiche Dissoziation und Kultur von Nagetier Herzzellen stammt aus dem 1960 1,2. Selbst dann Harary und Farley bemerkt, dass kultivierte Kardiomyozyten "kann eine einzigartige System für die Untersuchung von den Anforderungen des Perioden Kontraktilität [und kann] ein Mittel zur Bestimmung des Beitrages der verschiedenen Stoffwechselwege für die [Schlagen] Prozess". Obwohl Harary und Farley isolierten und kultivierten Kardiomyozyten aus jungen Ratten, und der ursprüngliche Protokoll wurde angepasst, und über die Jahre von vielen Wissenschaftlern geändert, hat die allgemeine Isolation und Kultivierung Verfahren nicht wesentlich verändert. Allerdings hat bessere Enzyme 3, standardisierte Lösungen 4,5, und die Zugabe des reversiblen Kanal-und Myosin-ATPase-Inhibitor BDM Zellen während der Isolationsverfahren 9.6 Schutz deutlich verbessert Zell-Ertrag und Rentabilität.
Erwachsene vs Neugeborenen-Kardiomyozytenzyten
Kardiomyozyten isolierten und kultivierten neonatalen Mäusen oder Ratten haben mehrere Vorteile gegenüber Kulturen von adulten Kardiomyozyten. Vor allem ist das Isolierungsverfahren für neonatale Maus oder Rattenherzen einfacher und kostengünstiger im Vergleich zu der Isolierung von Kardiomyozyten aus adulten Maus oder Ratte 10. Neonatale Kardiomyozyten sind weit weniger empfindlich auf in eine Calcium-haltigem Medium nach der Dissoziation Wiedereinführung, Zellausbeute stark erhöht. Ein weiterer großer Vorteil ist, dass neonatale Kardiomyozyten der Maus durchlaufen eine schnellere Entdifferenzierung – Redifferenzierung Zyklus, führt in der Regel spontan nach der Plattierung schlagen Zellen 20 Stunden, während adulte Kardiomyozyten erfordern in der Regel Tempo der Kontraktion induzieren. Neonatale Kardiomyozyten sind auch leichter transfizierbar mit liposomalen Transfektion Methoden, während adulte Kardiomyozyten erfordern virale Vektoren für die erfolgreiche Umsetzung der transgenen DNA. Im Gegensatz zur neonatalen Kardiomyozytens, die Kultur der erwachsenen Nagetieren Kardiomyozyten 11-13 ermöglicht Untersuchungen von myofibrillären Abbau und späteren Wiederherstellung der kontraktilen Apparates. Diese charakteristischen morphologischen Veränderungen in adulten Kardiomyozyten treten über einen Zeitraum von ca. 1-2 Wochen. Die Entdifferenzierung – Redifferenzierung Zyklus wird durch Reexpression des fetalen Gen Programm begleitet, was in der menschlichen Kardiomyopathien 14 beobachteten pathologischen Veränderungen imitiert. Ein weiterer Vorteil des adulten Rattenherzmuskelzellen auf die Kultur von neonatalen Kardiomyozyten ist die Fähigkeit, diese Zellen Kultur für lange Zeiträume.
Ratten-Herzmuskelzellen gegen Maus
Die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Ratten-Herzmuskelzellen hat einige Vorteile gegenüber der von der Maus neonatalen Kardiomyozyten, darunter höhere Ausbeuten an lebenden Zellen und erhöhte Transfektionsraten. Doch die breite Verwendung von genetisch veränderten Mausmodellen für Herzerkrankungen (zB </ Em> der Muskel lim Protein-Knockout-Maus als Modell für die dilatative Kardiomyopathie 15) wurde auf die Anpassung der Verfahren für die Isolation von Kardiomyozyten neugeborenen Mäusen abgeleitet geführt. Obwohl die zur neonatalen Ratte und Maus Kardiomyozyten isolieren Protokolle sind nahezu identisch, müssen größere Sorgfalt bei der Auswahl eines geeigneten Enzymmischung für die letztere eingenommen werden. Tatsächlich sind neonatalen Maus Kardiomyozyten im allgemeinen anfälliger für overdigestion, was zu einer verringerten Zell Ausbeute und Lebensfähigkeit. Außerdem sollte die Beschichtung Dichte eingestellt werden, weil Kardiomyozyten aus neugeborenen Mäusen abgeleitet Vergleich zu Zellen von neugeborenen Rattenherzen abgeleitet sind etwas kleiner.
Bei vielen Anwendungen für die Untersuchung der morphologischen, elektrochemische, biochemische, zellbiologische und biomechanische Parameter als auch für das Verfahren der Myofibrillogenese haben kultivierten neonatalen Herzmuskelzellen zu einem der vielseitigsten Systeme für das Studium derHerzzellfunktionen in vitro. Der erste Schritt zu einem erfolgreichen Test hängt jedoch auf eine einfache und zuverlässige Methode zur neonatalen Kardiomyozyten der Maus zu isolieren. Unser Protokoll bezieht seine Methodik aus vielen Quellen und wurde für die Reproduzierbarkeit und Robustheit optimiert. Wir diskutieren Faktoren, die Kardiomyozyten-Ertrag und Rentabilität zu beeinflussen, und bieten eine Vielzahl von Optionen für die Optimierung der Isolation und der Kulturbedingungen.
Die Verwendung von Tiermodellen, um Herzerkrankungen zu untersuchen hat sich in der kardiovaskulären Forschung Standard. Closer biochemische Charakterisierung dieser Modelle (dh Studium direkte Antworten von Herzzellen zu biochemischen oder biomechanischen Reize) erfordert in der Regel die Isolierung von Herzgewebe oder Herzmuskelzellen. Studien, die physiologischen Reaktionen des Herzens ex vivo (z. B. Acetylcholin 40 oder in Ischämie-Reperfusion Szenarien 41) in der Regel nutz…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Prof. emeritus Jean-Claude Perriard und Evelyn Perriard (Swiss Federal Institute of Technology, Schweiz) für die Einführung in die Isolation Techniken zur neonatalen Ratten-und Maus-Kardiomyozyten. Wir möchten Prof. Ju Chen und Prof. Sylvia Evans (UCSD, USA) für ihre Unterstützung danken. Arbeit im Labor von EE wurde von einem MRC Karriere Gründung Zuschuss finanziert. SL wird von einem K99/R00 Weg in die Unabhängigkeit Auszeichnung von der NIH / NHLBI (HL107744) unterstützt. TMM wurde durch ein Postdoc-Stipendium der American Heart Association (11POST7310066) unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|