Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica.
Cardiomiócitos neonatais cultivadas têm sido muito utilizados para estudar myofibrillogenesis e funções miofibrilares. Cardiomiócitos cultivados permitir a fácil manipulação e investigação das vias bioquímicas, e seu efeito sobre as propriedades biomecânicas do batimento espontâneo cardiomiócitos.
O protocolo de 2 dias a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos neonatais do mouse. Mostramos como dissecar facilmente corações de recém-nascidos, dissociar o tecido cardíaco e enriquecer cardiomiócitos a partir da população de células cardíacas. Discute-se o uso de diferentes misturas de enzimas para a célula-dissociação, e seus efeitos sobre células-viabilidade. Os cardiomiócitos isolado pode ser posteriormente utilizado para uma variedade de,, ensaios com células-biológica ou bioquímica biomecânico electrofisiológicos morfológicas. Nós otimizamos o protocolo para a robustez e reprodutibilidade, usando soluções só comercialmente disponíveis e enzima mistura que show variabilidade pouco de lote para lote. Nós também tratar de problemas comuns associados com o isolamento e cultura de cardiomiócitos, e oferecem uma variedade de opções para a otimização das condições de isolamento e de cultura.
Os primeiros relatórios para a dissociação de sucesso e cultura de células cardíacas de roedores remonta à década de 1960 1,2. Mesmo então, Harary e Farley notado que os cardiomiócitos cultivados "pode fornecer um sistema único para o estudo dos requisitos da contractilidade periódica [, e podem] fornecem um meio para determinar a contribuição de diversas vias metabólicas para a [bater] processo". Embora Harary e Farley cardiomiócitos isolados e cultivados de ratos jovens, bem como o protocolo original foi adaptado e modificado por muitos cientistas ao longo dos anos, o procedimento de isolamento e cultura geral não mudou muito. No entanto, os melhores enzimas 3, soluções padronizadas de 4,5, e a adição do canal reversível e miosina ATPase BDM para proteger as células durante o procedimento de isolamento de 6-9 melhorou significativamente célula-produtividade e viabilidade.
Adulto miocardiopatia vs neonatalcitos
Cardiomiócitos isoladas e cultivadas a partir de murganhos ou ratos recém-nascidos têm várias vantagens sobre as culturas de cardiomiócitos adultos. Em primeiro lugar, o procedimento de isolamento para neonatais do rato ou do rato corações é mais fácil e menos dispendiosa, quando comparada com o isolamento de cardiomiócitos de rato ou um rato adulto 10. Cardiomiócitos neonatais são muito menos sensíveis a reintrodução de um meio contendo cálcio após dissociação, aumentando consideravelmente o rendimento celular. Outra grande vantagem é que os cardiomiócitos neonatais do mouse passar por uma desdiferenciação mais rápida – ciclo rediferenciaï que normalmente resulta em bater espontaneamente células 20 horas após o plaqueamento, enquanto cardiomiócitos adultos normalmente exigem estimulação para induzir contração. Cardiomiócitos neonatais também são mais facilmente transfectable com os métodos de transfecção lipossomal, enquanto cardiomiócitos adultos necessitam de vetores virais para a entrega bem sucedida de DNA transgênico. Em contraste com cardiomiócitos neonataiss, a cultura de cardiomiócitos de roedores adultos 11-13 permite investigações de degradação miofibrilar e eventual restabelecimento do aparelho contrátil. Estas alterações morfológicas características em cardiomiócitos adultos ocorrem em períodos de 1-2 semanas. A desdiferenciação – ciclo rediferenciaï é acompanhado por reexpressão do programa gene fetal, imitando assim alterações patológicas observadas em cardiomiopatias humanos 14. Outra vantagem de cardiomiócitos de rato adulto durante a cultura de cardiomiócitos neonatais é a capacidade de cultura destas células por longos períodos de tempo.
Rato vs cardiomiócitos de rato
O isolamento e cultura de cardiomiócitos de ratos recém-nascidos tem algumas vantagens sobre o de cardiomiócitos neonatais rato, incluindo rendimentos mais elevados de células viáveis e aumento das taxas de transfecção. No entanto, a ampla utilização de modelos de ratos geneticamente modificados para doenças cardíacas (por exemplo, </ Em> a lim muscular rato knockout proteína como modelo para cardiomiopatia dilatada 15) levou à adaptação do procedimento de isolamento de cardiomiócitos derivados de camundongos recém-nascidos. Embora os protocolos usados para isolar neonatais cardiomiócitos de ratos e camundongos são quase idênticas, maior cuidado deve ser tomado na seleção de uma mistura de enzimas apropriadas para o último. Com efeito, os cardiomiócitos neonatais de rato são geralmente mais susceptíveis a overdigestion, resultando numa redução de rendimento celular e viabilidade. Além disso, a densidade do revestimento deve ser ajustado, por cardiomiócitos derivados de ratinhos neonatais são um tanto menor em comparação com células derivadas a partir de corações de ratos recém-nascidos.
Com muitos usos para a investigação de parâmetros morfológicos, eletrofisiológicos, bioquímicos, celulares e biológicos e biomecânicos, bem como para o processo de myofibrillogenesis, cardiomiócitos neonatais cultivadas tornaram-se um dos sistemas mais versáteis para o estudo dafunções das células cardíacas in vitro. O primeiro passo para um ensaio bem sucedido no entanto, depende de uma metodologia simples e de confiança para isolar cardiomiócitos neonatais de rato. Nosso protocolo tira a sua metodologia de muitas fontes e foi otimizada para a reprodutibilidade e robustez. Discutimos fatores que influenciam cardiomiócitos-rendimento e viabilidade, e fornecer uma variedade de opções para a otimização de condições de isolamento e de cultura.
O uso de modelos animais para estudar doenças cardíacas se tornou padrão na pesquisa cardiovascular. Mais perto caracterização bioquímica desses modelos (ou seja, estudando as respostas diretas de células cardíacas a estímulos bioquímicos ou biomecânicos) normalmente requer o isolamento de tecidos cardíacos ou cardiomiócitos. Estudos que investigam as respostas fisiológicas do coração ex vivo (por exemplo, a acetilcolina 40, ou em cenários de isquemia-reperfusão 41)</s…
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos ao Prof emérito Jean-Claude Perriard e Evelyn Perriard (Instituto Federal Suíço de Tecnologia, Suíça) para a introdução de técnicas de isolamento para rato neonatal e cardiomiócitos de rato. Gostaríamos de agradecer ao Prof Ju Chen e Prof Sylvia Evans (UCSD, EUA) para o seu apoio. Trabalho no laboratório de EE foi financiado por um MRC Carreira Estabelecimento Grant. SL é apoiado por uma K99/R00 caminho para a independência do prêmio NIH / NHLBI (HL107744). TMM foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Heart Association (11POST7310066).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
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