Los cultivos primarios de cardiomiocitos de ratón son una de las herramientas fundamentales para la investigación de la organización miofibrilar y la función. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos primarios de corazones de ratón neonatales. Los cultivos de cardiomiocitos resultantes pueden usarse posteriormente para una variedad de ensayos biomecánicos, bioquímicos y de células biológica.
Cardiomiocitos neonatales cultivadas han sido utilizados para estudiar myofibrillogenesis y funciones miofibrilares. Cardiomiocitos cultivados permiten una fácil investigación y manipulación de las vías bioquímicas, y su efecto sobre las propiedades biomecánicas de latido espontáneo cardiomiocitos.
El siguiente protocolo 2-día describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón. Mostramos cómo diseccionar fácilmente corazones de los recién nacidos, se disocia el tejido cardíaco y enriquecer los cardiomiocitos de la población celular cardiaca. Se discute el uso de diferentes mezclas de enzima para disociación celular, y sus efectos sobre la viabilidad celular. Los cardiomiocitos aislados se pueden utilizar posteriormente para una variedad de ensayos morfológicos, bioquímicos, electrofisiológicos, de células biológica o biomecánico. Hemos optimizado el protocolo para la robustez y reproducibilidad, mediante el uso de soluciones disponibles en el mercado único y la enzima se mezcla que shpoca variabilidad ujo de lote a lote. También nos ocupamos de los problemas más comunes asociados con el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos, y ofrecemos una variedad de opciones para la optimización de las condiciones de aislamiento y cultivo.
Los primeros informes de la disociación de éxito y la cultura de las células del corazón de roedores se remonta a la década de 1960 1,2. Incluso entonces, Harary y Farley notaron que los cardiomiocitos en cultivo "pueden proporcionar un sistema único para el estudio de los requisitos de la contractilidad periódica [, y pueden] proporcionar un medio de determinar la contribución de las diversas vías metabólicas para el proceso [golpes]". Aunque Harary y Farley cardiomiocitos aislados y cultivados de ratas jóvenes, y el protocolo original se ha adaptado y modificado por muchos científicos en los últimos años, el procedimiento de aislamiento y el cultivo en general no ha cambiado mucho. Sin embargo, mejores enzimas 3, soluciones normalizadas de 4,5, y la adición del canal reversible y la miosina ATPasa inhibidor de la BDM para proteger las células durante el procedimiento de aislamiento 6-9 ha mejorado significativamente celular rendimiento y la viabilidad.
Adultos vs miocardiopatía neonatalcitos
Cardiomiocitos aislados y cultivadas a partir de ratones o ratas neonatales tienen varias ventajas sobre los cultivos de cardiomiocitos adultos. Ante todo, el procedimiento de aislamiento para neonatales de ratón o rata corazones es más fácil y menos costoso, en comparación con el aislamiento de cardiomiocitos de rata o ratón adulto 10. Cardiomiocitos neonatales son mucho menos sensibles a la reintroducción en un medio que contiene calcio después de la disociación, aumentando enormemente de células-rendimiento. Otra gran ventaja es que los cardiomiocitos de ratones neonatales se someten a una desdiferenciación más rápido – ciclo de re-diferenciación que da lugar típicamente a latir espontáneamente células 20 horas después de la siembra, mientras que los cardiomiocitos adultos suelen requerir de estimulación para inducir la contracción. Cardiomiocitos neonatales son también más fácilmente transfectable con métodos de transfección liposomal, mientras que los cardiomiocitos adultos requieren vectores virales para la entrega exitosa de ADN transgénico. En contraste con los cardiomiocitos neonataless, la cultura de los cardiomiocitos de roedores adultos 11-13 permite para las investigaciones de la degradación miofibrilar y eventual restablecimiento del aparato contráctil. Estos cambios morfológicos característicos en cardiomiocitos adultos ocurren en períodos de 1 a 2 semanas. La desdiferenciación – ciclo de re-diferenciación está acompañado por la reexpresión del programa genético fetal, imitando así los cambios patológicos observados en las miocardiopatías humanos 14. Otra ventaja de los cardiomiocitos de ratas adultas sobre la cultura de los cardiomiocitos neonatales es la capacidad de estas células de cultivo durante largos períodos de tiempo.
Rata vs cardiomiocitos de ratón
El aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de rata tiene algunas ventajas sobre el de los cardiomiocitos neonatales de ratón, incluyendo mayores rendimientos de células viables y aumento de las tasas de transfección. Sin embargo, el amplio uso de los modelos de ratones genéticamente modificados para las enfermedades cardíacas (por ejemplo </ Em> la lim muscular nocaut proteína de ratón como modelo para la miocardiopatía dilatada 15) ha dado lugar a la adaptación del procedimiento de aislamiento de cardiomiocitos derivados de ratones recién nacidos. Aunque los protocolos utilizados para aislar de rata y ratón cardiomiocitos neonatales son casi idénticos, mayor se debe tener cuidado en la selección de una mezcla de enzima apropiado para este último. De hecho, los cardiomiocitos neonatales de ratón son generalmente más susceptibles a overdigestion, resultando en una célula rendimiento y la viabilidad reducida. Por otra parte, la densidad de placas se debe ajustar, ya que los cardiomiocitos derivados de ratones recién nacidos son algo más pequeñas en comparación con las células derivadas de corazones de ratas neonatales.
Con muchas aplicaciones para la investigación de los parámetros morfológicos, electrofisiológicos, bioquímicos, de células biológicas y biomecánicas, así como para el proceso de myofibrillogenesis, cardiomiocitos neonatales cultivados se han convertido en uno de los sistemas más versátiles para el estudio defunciones de las células cardíacas in vitro. El primer paso para un ensayo de éxito, sin embargo, depende de una metodología sencilla y fiable para aislar los cardiomiocitos de ratones neonatales. Nuestro protocolo se basa su metodología de muchas fuentes y se ha optimizado para la reproducibilidad y robustez. Se discuten los factores que influyen en los cardiomiocitos rendimiento y viabilidad, y ofrecemos una variedad de opciones para la optimización de las condiciones de aislamiento y cultivo.
El uso de modelos animales para estudiar las enfermedades cardíacas se ha convertido en estándar en la investigación cardiovascular. Más cerca de la caracterización bioquímica de estos modelos (es decir, el estudio de respuestas directas de las células cardíacas a los estímulos bioquímicos o biomecánicos) típicamente requiere el aislamiento de los tejidos del corazón o los cardiomiocitos. Los estudios que investigan las respuestas fisiológicas del corazón ex vivo (por ejemplo, a la aceti…
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos con el profesor emérito Jean-Claude Perriard y Evelyn Perriard (Instituto Federal de Tecnología de Suiza, Suiza) para la introducción en las técnicas de aislamiento de rata neonatal y cardiomiocitos de ratón. Nos gustaría dar las gracias al profesor Ju Chen y el Prof. Sylvia Evans (UCSD, EE.UU.) por su apoyo. El trabajo en el laboratorio de EE fue financiado por un MRC Carrera Establishment Grant. SL es apoyado por una vía K99/R00 otorgar independencia de la NIH / NHLBI (HL107744). TMM fue apoyado por una beca postdoctoral de la American Heart Association (11POST7310066).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|