Summary
פרוטוקול לניתוח nanoparticle מעקב (נ.ת. ע) והזרימה cytometry תפוקה גבוהה להעריך חלקיקים פולימריים גן משלוח מתואר. נת"ע מנוצל כדי לאפיין את התפלגות גודל חלקיקי nanoparticle והפצת החלקיקים לפלסמיד. cytometry זרימת תפוקה גבוהה מאפשר הערכת יעילות transfection כמוני לספרייה של biomaterials מסירת הגן.
Abstract
מסירת גן ללא ויראלי באמצעות חלקיקים פולימריים התפתחה כגישה אטרקטיבית לריפוי גנטי לטיפול במחלות גנטיות 1 וכטכנולוגיה לרפואת רגנרטיבית 2. בניגוד לוירוסים, אשר יש להם בעיות בטיחות משמעותיות, חלקיקים פולימריים ניתן תוכנן להיות רעיל, אינו immunogenic, הלא מוטגניות, קל לסנתז, כימי תכליתי, מסוגל לשאת מטען גדול יותר חומצות גרעין ומתכלה ו / או לסביבה מגיב. פולימרי קטיוני עצמי להרכיב עם DNA הטעון שלילי באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית ליצירת קומפלקסים על בסדר הגודל של 100 ננומטר, מכונות חלקיקים פולימריים נפוצים. דוגמאות לחומרים ביולוגיים המשמשים ליצירת חלקיקים ננומטריים משלוח polycationic גן כוללות, polyphosphoesters polylysine, פולי (amidoamines) של וpolyethylenimine (PEI), שהוא מהמדף את שאינם מתכלה, פולימר קטיוני הנפוץ למסירת חומצות גרעין 1,3. פולי (בטא אמיניתאסתר) של (PBAEs) הוא סוג חדש יותר של פולימרי 4 קטיוני שhydrolytically מתכלה 5,6 והוכחו כיעילים במשלוח גן לסוגי תאים קשים לtransfect כגון תאים אנושיים רשתית האנדותל (HRECs) 7, תאי עכבר חלב אפיתל 8, תאי אדם סרטני במוח 9 ו macrovascular (וריד טבור אנושי, HUVECs) תאי אנדותל 10.
פרוטוקול חדש לאפיון חלקיקים פולימריים ניצול Nanoparticle מעקב וניתוח (נ.ת. ע) מתואר. בגישה זו, היא התפלגות גודל החלקיקים וההפצה של מספר פלסמידים לחלקיק מתקבלות 11. בנוסף, בדיקת תפוקה גבוהה 96 היטב צלחת transfection לסינון מהיר של יעילות transfection של חלקיקים פולימריים מוצגת. בפרוטוקול זה, (אסתר בטא אמינו) של פולי (PBAEs) משמשים כמודל פולימרים ותאי האנדותל רשתית אנושיים (HRECs) משמש כמותאים אנושיים דלים. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות להעריך כל nanoparticle פולימרים וכל סוג תא של עניין בפורמט צלחת רבה כן.
Introduction
קביעת מספר פלסמידים והמורכבים לnanoparticle חשובה לתכנן אסטרטגיות יעילות nanoparticle מבוססות גני מסירה, במיוחד לשיתוף מסירה של פלסמידים מרובים לאותו יעד תא, לעתים קרובות יש צורך בתכנות מחדש של תאי גזע מחקרים 12. גישות אחדות כדי לחשב את מספר פלסמידים הקשורים nanoparticle אחת כבר תאר, וכל גישה יש חסרונות בטכניקות המשמשות להערכה 13-16. תיוג נקודה קוונטית (QD) בשילוב עם TEM נעשה שימוש כדי לאמוד פלסמידים לחלקיקי חלקיקי chitosan מבוססים. הערכה עם טכניקת QD זה היא מסובך בשל הצורך לתייג את ה-DNA, שעשוי לשנות את תכונותיו הרכבה עצמית: האפשרות שהדנ"א ללא תווית הכמוס הוא אינו מזוהה באופן ישיר; פלסמידים וQDs בתמונות TEM 2D של חלקיקי פוטנציאל חופפים; ו הנחות מפשטות אחרות 13. גישה חלופית שהיאpplicable כאשר microdomains הורה קיים בחלקיקים נעשה שימוש כדי ללמוד מתחמי Lipopolyamine-DNA באמצעות מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון הולכה (cryo-TEM), פיזור קרן ה-X, ופיזור אור דינמי (DLS) 14,15. למרבה הצער, חומרים כגון החלקיקים פולימריים נחקרו כאן אינם ישימים בשיטה זו. . במחקר אחר, קולינס ואח' השתמש בטכניקת זרימת חלקיקי תמונת ניתוח ללמוד (יס) 16 מתחמים המכיל פפטיד / דנ"א, אולם השיטה שלהם יכולה רק להעריך חלקיקים גדולים יותר, בגודל 16 מיקרון. לפיכך, לאחרונה פותח בדיקה חדשה וגמישה כדי לכמת את מספר פלסמידים לnanoparticle 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זריעת תאים
- אל תאפשרו לתאים לגדול ל overconfluency. השתמש בתאי מעבר מוקדמים כאשר transfecting תאים ראשוניים.
- עשרים וארבע שעות לפני transfection, trypsinize התאים, ספירת התאים באמצעות hemocytometer, ולדלל את השעית התא עם תקשורת כדי להשיג צפיפות התאים הרצויים (תאים / נפח). תאי זרע לתוך רקמה ברורה התרבות טופלו צלחות שטוחות תחתונות 96-כן באמצעות מאגר וpipettes הרב ערוציים. הצפיפות שנבחרה צריכה לתת 70-80% confluency ביום transfection. לדוגמה, כפי שמוצג בטבלת המס '1, התאים דוללו ל25-50 תאים / μl לנתוני transfection מוצגים כאן.
2. Transfection תא
- דילול של פולימר ומניות ה-DNA. הפשר פתרוני מניות DNA ופולימר בטמפרטורת חדר (RT). לדלל פתרון מניית DNA פתרון פולימר מניות ו, בנפרד בצלחות 96-כן ברורות באמצעות 12 ערוצי פיפטה, עם הממס המתאים לריכוזים הנדרשים כדי להשיג את משקל הפולימר הרצוי ליחסים שבין משקל DNA (wt / wt). במקרה זה, נבחר הממס הוא 25 מ"מ חיץ נתרן יצטט (pH = 5.2).
- דנ"א דילול. בדרך כלל, ה-DNA מאוחסנת ב1 מ"ג / מ"ל מדולל בחיץ נתרן יצטטו לריכוז של 0.03-0.06 מ"ג / מ"ל בצלחת ברורה שאינה רקמת תרבות מטופלים-96-היטב (אחד גם לניסוח אחת). לוח 2 מראה פרוטוקול ה-DNA האופייני לדילול ניסוח בודד המשמש לtransfect ארבע בארות לשכפל בצלחת 96 היטב נזרעה עם תאים מהשלב 1.
- דילול פולימר. פתרון 100 מ"ג / מיליליטר הפולימר / DMSO מדולל בחיץ נתרן יצטט פי הריכוז הנדרש כדי להשיג את הפולימר הרצוי ליחס ה-DNA wt / wt. טווח יחסי wt / wt משמשים בדרך כלל למסירת גן עם פולי s (אסתר בטא אמינית) (PBAEs) הוא 20 עד 100. פולימרי PBAE בדילול 1 עד 10 מ"ג / מ"ל, ואחרי הדילול עמrotocol כפי שמוצג בטבלה 3. את דילולי הפולימר ניתן לבצע בצלחת ברורה שאינה רקמת תרבות מטופלים-96-היטב שמתאימה לאורינטצית המדגם של צלחת הדילול-DNA.
- היווצרות nanoparticle. הוסף פתרון PBAE לנפח שווה של פתרון ה-DNA פלסמיד באמצעות 12 ערוצי פיפטה ומערבב נמרצות. תן לדגור בתערובת RT למשך 10 דקות על מנת לאפשר הרכבה עצמית.
- transfection nanoparticle. בעקבות הרכבה עצמית, 20 חלקיקי μl מתווספים לטוב לdropwise התרבות הבינונית באמצעות 12 ערוצי פיפטה. בארות לשכפל נותרות ללא טיפול או transfected עם חומרים כימיים מסחרי קיים כקבוצת ביקורת. תאי transfected מודגרת על 37 מעלות צלזיוס למשך שעות עד ארבעה שעות ולאחר מכן את הבארות מוחלפות בתקשורת טריה (100 μl / טוב). הבחירה בזמן הדגירה תהיה תלויה בקו הסלולרי, תנאי התרבות, ומערכת transfection. ההבדל בtransfectionיעילות ורעילה לתא, כתוצאה משינוי תקופת דגירה תהיה לכמת את פרוטוקול הניתוח המתואר בשלב 3.
3. ניתוח של יעילויות Transfection ורעיל לתא
יעילות transfection הוא נתח באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת באמצעות cytometer זרימה הארבעים ושמונה שעות שלאחר transfection. רעיל לתא הוא נתח באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת באמצעות 96 assay אחד המימי CellTiter עשרים וארבע שעות שלאחר transfection.
- מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חזותי לנתח את הבארות לביטוי של גן הכתב transfected (לדוגמה, EGFP או DsRed) באמצעות ערוץ פלואורסצנטי המתאים. לרכוש תמונות לכל באר, בחירת תחומי ההשקפה שמייצגים כראוי את יעילות transfection לניסוחים המסוימים (איור 1). רשום כל רעילות תא נצפתה חזותי.
- Cytometry זרימה.
- השתמש pipettes הרב ערוציים להכין צלחת 96-גם עבור cytometry זרימה. לשטוף עם PBS, trypsinize עם 30 μl / גם של טריפסין / EDTA, לנטרל עם חיץ FACS μl 170 (PBS + 2% FBS), פיפטה מעלה ומטה בכל באר, כולל בקצוות, ולהעביר את כל הנפח של 200-μl כל באר בקידוחים מקבילים בצלחת עגולה תחתונה או V-96-תחתית היטב.
- צנטריפוגה את הצלחת ב 130 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C.
- הסר 170 μl תקשורת מכל תאים וגם פיפטה לresuspend תוך הימנעות בועות. כדי להשתמש ביכולת קיום כתם כמו יודיד propidium (PI), להוסיף 10 μl של FACS חיץ + PI (50:1 FACS חיץ: PI דילול; ריכוז PI מניות 1 מ"ג / מ"ל) לכל באר. מייד מקום על קרח ולכסות מאור.
- התחל cytometer C6 Accuri הזרימה, HyperCyt המצורף 96-היטב, ותוכנת HyperView. השתמש עיצוב HyperView וכרטיסיות פרוטוקול לבחור עמ המתאיםסוג מאוחר, פריסת צלחת, והגדרות אחרות כגון רעידות / לגימה / לשטוף / לנער זמן. לפרוטוקול לעיל, את הפרמטרים הבאים שמשו, צלחת מראש ממשלה לרגע אחד, וטלטלת צלחת מראש למשך 30 שניות ב2400 סל"ד. זמן הלגימה נקבע ל15 שניות במהירות 15 סיבובים לדקה, בדיקה לשטוף היטב עבור כל 2 שניות, ובין היטב ללחוץ את כל 12 בארות ל12 שניות ב -2400 סל"ד. לנער היטב בין חשוב לשמור על התאים וכן פוזרו בתקשורת, לשיפור ביכולת לעבד את הנתונים על ידי לרבות הפסקות זמן בין קבוצות של בארות (במקרה זה 12 שניות).
- השתמש בכרטיסיית זיהוי ובכן HyperView לעבד את הנתונים והנפרדים לתוך היטב המתאים (איור 2). על מנת לזהות את הבארות הבודדות, זה יכול לעזור להשתמש במסנן של תוכנת הרעש, כמו גם כולל בסיס אפילו מסנן תחת ההגדרות המתקדמות.
- לכמת אחוז מתאי חי transfected חיובי על ידי gating המתאים להפריד הפופ שונהulations (איור 3). ראשון להציג את נתוני הזרימה בעלילת פיזור FSC לעומת SSC כדי תאים נפרדים מפסולת (איור 3 א). אם יודיד propidium (PI) שמש, שער אוכלוסיית התא הבודדה והשקפה שנתונים על עלילת FSC לעומת FL3 על מנת להפריד בין תאי חיים מתאים ואת שער תאי חיים מתים. על מנת לכמת את מספר תאי transfected, להציג את אוכלוסיית התא החייה בערוצים המתאימים, למשל, ניתן לראות בGFP FL1. שימוש באוכלוסייה לא המטופל, שער לתאים שלא טופל על מנת לזהות את אות הרקע (איור 3 ב '). תאי transfected חיובית אז יכולים להיות מבודדים באמצעות השער הזה ועל ידי הצגת אוכלוסיות transfected באמצעות שני פיזור וחלקות גובה (האיור 3C ו3D). אולי יש רצף של תאי transfected חיובי, כפי שtransfected תאים שונים בדרגות שונות של קרינה.
- CellTiter 96 assay מימי אחד
- Transfect צלחת אחרת בדיוק באותו אופן למדידות רעילות לתא.
- מיליליטר premix 1 לפתרון CellTiter 96 המימי אחד assay עם 10 תקשורת טריה מ"ל. הסר את המדיה מתאים ולהשתמש פיפטה רב להוסיף 110 μl של פתרון premixed + תקשורת לטובה.
- מדוד את הספיגה ב490 ננומטר כל מרווח שעה 1-4 שעות עד לספיגה מהיטב עם מצב מטופל היא בטווח יניארי של assay. כולל ארבע בארות בקרה עם תקשורת + פתרון היחידה לקריאת ספיגת רקע.
- ממוצע ספיגת ערכים מהארבע הבארות לשכפל למצב ולחסר ספיגת הרקע הממוצעת מכל ממוצע. לנרמל את הממוצע המתוקן לכל מצב טיפול לממוצע המתוקן של מצב המטופל כדי לקבוע את כדאיויות תא אחוזים.
- ראש מערכת fluidics של NS500 NanoSight ידי הפעלת משאבת diluent קדימה בכ 1/5th מהירות מרבית ומשאבת המדגם אחורה בכ 1/10th המהירות מרבית. המשך עד שמערכת fluidics סמוקה diluent.
- הכן את החלקיקים כדי להיות מנותחים. במקרה של PBAEs, בנפרד לדלל את מניות DNA פלסמיד (1 מ"ג / מ"ל) והמנייה PBAE (100 מ"ג / מ"ל) בחיץ נתרן יצטט (25 מ"מ, 5 pH) בצינורות Eppendorf.
- לדלל את ריכוז ה-DNA פלסמיד ל0.06 מ"ג / מ"ל. ריכוז פולימר יכול להשתנות בהתאם ליחס משקל משקל הנדרש של פולימר ל-DNA (לדוגמה, עבור 60 חלקיקים wt / wt, הפולימר מדולל ל -3.6 מ"ג / מ"ל).
- הוסף פולימר הפתרון לנפח שווה של פתרון ה-DNA פלסמיד ומערבב נמרצות. דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות כדי לאפשר להרכבה עצמית.
- דילאוטה פתרון nanoparticle 100-לקפל לתוך PBS על מנת שריכוז nanoparticle להיות בטווח המתאים לנ.ת. ע ולקבל נפח סופי של לפחות 500 μl.
- טען את הדגימה לNanoSight על ידי נחת צינור הטעינה לתוך מדגם אפנדורף הצינור (איור 4 א). הקפד לא להכניס בועות אוויר.
- במצב צילום, להגביר את רמת המצלמה עד שניתן לראות חלקיקים. התאם את המיקוד כך שהחלקיקים להיראות חלקים (איור 4 א ו -4 ב).
- בעוד שבמצב רגיל, להתאים את רמת המצלמה מעבר לנקודה שכל החלקיקים ניתן לראות על מסך. אז להקטין את רמת המצלמה לרמה הנמוכה ביותר כך שהחלקיקים יכולים כל עדיין לא אותרו. אם רמת מצלמת ביניים יש צורך, נכנס למצב מתקדם ולשנות את צמצם המצלמה ולזכות לרמות המתאימות.
- חזותי לבדוק כדי לוודא שיש בין 20-100 חלקיקים על היםקרין. מספר אידיאלי למעקב nanoparticle הוא כ 50 חלקיקים. אם יש יותר מדי או מעט מדי, שטוף NS500, להתאים לדילול PBS, ולטעון מחדש את המדגם.
- התאם את משך הכיבוש על פי הטבלה במצב הרגילה. בדרך כלל 30-60 שניות הן אורך ללכוד מתאים (איור 4 ב).
- כדי לטעון את הדוגמא הבאה, שטוף את המערכת, ואז המדגם החדש לטעון מחדש.
- לאחר קטעי וידאו שנתפסו, המשך שלב העיבוד על ידי פתיחת קובץ וידאו.
- יש מספר הפרמטרים שיכול להיות המכוון כדי טוב ביותר לעבד וידאו (האיור 4C). המטרה היא לבחור בפרמטרים בצורה הטובה ביותר ללכוד כל חלקיק על המסך, כפי שמצוין על ידי סימן צלב אדום על המסך מעל כל חלקיק (איור 5).
- הגדל את רווח המסך טוב יותר לראות את החלקיקים. תחת המצב הרגיל או מתקדם, בחר האוטומטי להתאים לפרמטרים ידי clickinגרם התיבות המתאימות. במקרה שההגדרות האוטומטיות איננו מספקות בחרו חלקיקים, unclick התיבה ולהגדיר באופן ידני את הפרמטרים (האיור 4C).
- ברגע שכל החלקיקים נאספים על מסך, לחץ על הלחצן התהליך של התוכנה לעיבוד קובץ וידאו (האיור 4C). זה מספק את התפלגות גודל חלקיקים, ממוצעי גודל, כמו גם ריכוז חלקיקים.
- כדי לוודא שריכוז החלקיקים הוא מדויק, לשנות דילול PBS, כגון על ידי הגדלת דילול על ידי 2x, וחזור על התהליך לעיל. מדידת דילולים מרובים של אותו המדגם מומלץ לוודא שמדידת הריכוז של המדגם היא מדויקת. מגוון טוב למדידה הוא 10 7 9 -10 חלקיקים / מ"ל.
- ודא שכל פלסמידים ישולבו חלקיקי ג'ל אלקטרופורזה על ידי ההפעלה של החלקיקים ולהעריך האם כל הדנ"א חופשי הוא הווה.אם לא כל פלסמידים כמוסים, להשתמש בטכניקות מקובלות למדידת ספיגת DNA כדי לכמת פלסמידים כמוסים בסך הכל.
- כדי לחשב את המספר הממוצע של פלסמידים לחלקיקים, לחלק את ריכוז פלסמיד המארז הכולל של ריכוז החלקיקים הנמדד נת"ע. על מנת לאמוד את התפלגות מדגם פלסמיד לחלקיקים, להשתמש תחילה היסטוגרמה גודל חלקיקי נת"ע כדי לחשב את החלק היחסי של כל סל הנפח 1-nm של חלקיקים. הכפל הפצת שבריר כרך זה על ידי הכמות הכוללת פלסמיד להשיג מספר פלסמידים בכל סל. מחלק את המספרים האלה במספר חלקיקים בכל סל כדי להשיג את מספר פלסמידים-החלקיק לחלקיק לכל גודל (איור 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של דוגמה של transfection המוצלח של HRECs עם EGFP פלסמיד. תמונת brightfield כדאי לוודא שתאים לשמור המורפולוגיה הרגילה שלהם. בנוסף, מבחני תא כדאיות, כגון MTS או מבחנים דומים, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את רעילויות nanoparticle 7. cytometry זרימה, כפי שתואר, יכול לשמש כדי לכמת את יעילות transfection. בעת שימוש בקובץ מצורף הצלחת רב גם HyperCyt, נתונים צריכים להיות מעובד בהתאמה על מנת לזהות בצורה נכונה את הבארות. כפי שניתן לראות בלוח הימני של איור 2, כאשר ספירת התאים טובה (אלף תאים לכל היטב), ואת fluidics פועל כראוי, הבארות הבודדות קלות יותר לבחור באופן ידני והן על ידי התוכנה. עם זאת, אם ספירת התאים נמוכה מדי או שיש בעיה עם fluidics, הוא הופך להיות הרבה יותר קשה לזיהוי individרע"מ בארות (פנל השמאלי של איור 2), וניסוי סבירים צריכות להיות חוזרות ונשנות. החלפת הצנרת של Hypercyt יכולה לעתים לתקן בעיות בזרימת המדגם. ברגע שהנתונים גם הבודדים מתקבלים, תוכנת cytometry זרימה הנפוצה ביותר ניתן להשתמש כדי לנתח את הקבצים. יוצאו FCS. באיור 3, FlowJo משמש לשער תאי transfected חיובי על ידי השוואה לבארות שלא טופלו.
חלקיקי PBAE הם בדרך כלל בין 100-200 ננומטר בגודל כפי שנמדדו על ידי NanoSight נת"ע. בעת ביצוע נ.ת. ע, חשוב שמספר החלקיקים על המסך יהיה בין 20 -. 100 כך שהתוכנה תוכל לעקוב במדויק את חלקיקי 5A האיור הוא דוגמה לחלקיקים רבים מדי, ואילו 5B האיור מציג דוגמה מספר מתאים. עיבוד וידאו שנתפס צריך להיעשות כך שהחלקיקים שנצפו על המסך נאספים על ידי softwar הדואר, מיוצג עם שערות של הצלב האדומות. דוגמה לכאשר הסף לאיסוף חלקיקים הוא נמוך מכדי שניתן לראות באיור 5 ג, ואילו דוגמה לרמת סף טובה יותר נראית באיור 5D. דילול שונה של המדגם ניתן לבצע כדי לוודא שהדגימה היא בטווח הריכוז הנכון. ריכוז החלקיקים החדשים שניתן על ידי NanoSight צריך להתאים דילול החדש. ברגע שהגודל וריכוז חלקיקים מתקבלים, פלסמיד הממוצע לחלקיקים וההפצה יכולים להיות מחושבת. תוצאות לדוגמה ניתן לראות באיור 6. ציר זמן הניסוי מוצג באיור 7.
| ולס / פלייט | נפח / טוב (μl) | תאים / טוב |
| 96 | 100 | 2500 ל -5000 |
| ולס / פלייט | נפח / טוב (μl) | נפח חלקיקים / טוב (μl) | דנ"א / טוב (מיקרוגרם) | DNA (מיקרוגרם / μl) | DNA מיקרוגרם / μl מניות 1 (μl) | NaAc (μl) |
| 96 | 100 | 20 | 0.6 | 0.06 | 3 | 47 |
טבלה 2. פרוטוקול ה-DNA אופייני לדילול פורמט צלחת 96-כן.
| פולימר: דנ"א (wt / wt) | נפח חלקיקים / טוב (μl) | # לשכפל ולס | דנ"א / ובכן(מיקרוגרם) | פולימר / טוב (מיקרוגרם) | פולימר / 10 מיקרוגרם / μl המניות (μl) | NaAc (μl) |
| 20 | 20 | 4 | 0.6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0.6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0.6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0.6 | 60 | 30 | 20 |
לוח 3. פרוטוקול טיפוסי פולימר דילול לפורמט צלחת 96-כן.
דמות1. הדמיה יחידה צבע פלואורסצנטי ערוץ של HRECs transfected עם PBAE (שמאל) GFP פלואורסצנטי, בצבע ירוק;. (מזרח) תמונת brightfield; (מימין) תמונה מורכבת.
איור 2. צעד Hypercyt היטב תוכנת זיהוי לאחר נתונים שנאספו (משמאל) דוגמה לנתונים בעייתיים בשל ספירות נמוכות או בעיה עם fluidics;.. (מימין) דוגמה של נתונים נקיים, עם בארות שזוהו בקלות לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. gating FlowJo לתאי transfected עם EGFP פלסמיד () FSC לעומת SSC לתאים שלא טופלו;. (ב) FL1 לעומת FL3 עבור uתאי ntreated; (C, D) FL1 לעומת FL3 לתאי transfected עם PBAE. שניהם צפיפות פסאודו צבע (C) ו( D) חלקות גובה היא שימושיים כדי לקבוע את המיקום לצייר שערים.
איור 4. צילום מסך של חלקים מתוכנת NanoSight nanoparticle מעקב הניתוח, גרסת 2.2 () שליטת fluidics;. (ב) מצב צילום, המשמש ללכידת וידאו של החלקיקים; (ג) מצב עיבוד זמין לאחר פתיחת וידאו שנתפס בעבר. אדומות פונקציות להדגיש תיבות שנדונו בפרוטוקול. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 5. . דוגמה ללכידה וידאו NanoSight וניתוח צילומי מסך של מדגם לפני לכידת וידאו למדגם שאינם מדוללים מספיק (), ובדילול מתאים (B); צילומי מסך של מצב ניתוח עם סף גילוי חלקיקים נמוכים מדי (C) ומוגדרים כהלכה (ד '), עם כוונת צלב אדומה זיהוי כל החלקיקים כראוי. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 6. התפלגות גודל ונתונים לפלסמיד חלקיקי הפצה של PBAE (B5S3E7, 60:1 פולימר לדנ"א wt / wt) מבוססי חלקיקים נותחו באמצעות טכניקת ניתוח מעקב NanoSight. Reprinted מ[ 14] קטנים, 8, Bhise, NS, שמואלי, RB, גונזלס ,ג'יי, וירוק, ג'יי ג'יי assay רומן לכימות מספר פלסמידים מקופלים על ידי חלקיקים פולימריים, 367-373, 2012 זכויות יוצרים, עם אישור מיילי-Vch. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 7. ציר זמן ניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקולים הנ"ל מתארים שיטות להערכת יעילות transfection של ניסוחי nanoparticle, כמו גם דרך לאפיון גודל החלקיקים וטעינת ה-DNA של החלקיקים. מספר פלסמידים לחלקיק הוא פרמטר חשוב שיכול לעזור לנבא את היעילות של החלקיקים ויכול לשמש גם לקביעת מינון. Nanoparticle מעקב וניתוח יכול להתבצע במגוון של תמיסות מימיות שונות, כגון אלה שונים בריכוז מלח. לעתים אפיון זה מתבצע בPBS, לחקות מלח פיסיולוגי. בעוד אומד ב PBS יכול לתת הערכה טובה של גודל החלקיקים בתקשורת או בתמיסת מלח פיזיולוגית, כמות ה סרום יכולה להשפיע על הגודל והיציבות של חלקיקים 17. לכן, אפיון חלקיקים בריכוזים שונים של סרום יכול להיות חשוב עבור יישומים מסוימים גם כן. כדי לאפיין את החלקיקים בסרום, additioצעד nal מומלץ בשל פיזור הרקע הגבוה של חלבונים בסרום. במקרה זה, את החלקיקים צריכים להיות מתויגים fluorescently, כך שעל ידי השימוש במסנן הקרינה, החלקיקים יכולים להיות במעקב באופן ספציפי מובהק מחלבונים בסרום.
כימות החלקיקים לפלסמיד הוא כללי מספיק כדי לשמש בניסוחי nanoparticle שונים, כולל מערכות חלקיקים פולימריים או אורגניות אחרות. בשל התנהגות פיזור האור השונה מחומרים שונים, לכידת וידאו ופרמטרי עיבוד ייתכן שיהיה הצורך לשנותה. בנוסף, הרגישות של נת"ע עשויה להשתנות בהתאם לסוג החומר. פרוטוקול החלקיקים לפלסמיד שתואר לעיל הוא שיטה מהירה ויעילה לאפיון חלקיקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים דיווחו שאין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
המחברים מודים TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) וNIH R21CA152473 לקבלת תמיכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
