Summary
Протокол для наночастиц отслеживания анализа (NTA) и высокой пропускной проточной цитометрии для оценки полимерных наночастиц доставки генов описано. НТА используется для характеристики размеров наночастиц распределения частиц и плазмиды в распределении частиц. Высокая пропускная способность проточной цитометрии позволяет количественной оценки эффективности трансфекции для библиотеки биоматериалов доставки генов.
Abstract
Non-вирусной доставки генов с использованием полимерных наночастиц стала привлекательной подход к генной терапии для лечения генетических заболеваний 1 и в качестве технологии для регенеративной медицины 2. В отличие от вирусов, которые имеют значительные проблемы безопасности, полимерные наночастицы могут быть разработаны, чтобы быть нетоксичным, неиммуногенных, не мутагенными, легче синтезировать химически универсальный, способный перевозить большие грузы нуклеиновых кислот и биологически и / или экологические требования. Катионные полимеры самостоятельно собираться с отрицательно заряженной ДНК с помощью электростатического взаимодействия образовывать комплексы порядка 100 нм, которые обычно называют полимерные наночастицы. Примеры биоматериалы используется для формирования наноразмерных поликатионный наночастиц доставки генов включают полилизин, polyphosphoesters, поли (амидоамины) с и полиэтиленимина (PEI), который является неразлагаемых вне-полки катионного полимера обычно используется для доставки нуклеиновых кислот 1,3. Поли (бета-аминоэфир) с (PBAEs) являются новым классом катионных полимеров 4, которые гидролитически разлагающиеся 5,6 и были показаны, чтобы быть эффективным при доставки генов в труднодоступных трансфекции типы клеток, такие как человеческие эндотелиальные клетки сетчатки (HRECs) 7, мышь эпителиальные клетки молочной железы 8, человеческий мозг раковых клеток 9 и макрососудистых (пупочной вены человека, HUVEC) эндотелиальных клеток 10.
Новый протокол для характеристики полимерных наночастиц использованием наночастиц отслеживания анализа (NTA) описано. При таком подходе, как распределение частиц по размерам и распределению число плазмид на одну частицу получены 11. Кроме того, высокую пропускную способность 96-луночный планшет для анализа трансфекции для быстрого скрининга трансфекции эффективности полимерных наночастиц представлены. В этом протоколе, поли (бета-амино эфир) с (PBAEs) используются в качестве модели полимеров и человеческие эндотелиальные клетки сетчатки (HRECs) используются в качестве движениядель клетки человека. Этот протокол может быть легко адаптирована для оценки любых полимерных наночастиц и любой тип клеток интересов в мульти-луночный планшет формата.
Introduction
Определение количества плазмид комплекс в наночастицы важно разработать эффективную основе наночастиц доставки генов стратегии, в частности, для совместного осуществления различных плазмид с тем же клетки-мишени, как это часто требуется в перепрограммировании стволовых клеток исследования 12. Несколько подходов к подсчитать число плазмид, связанные с одной наночастицы были описаны, и каждый подход имеет свои недостатки в методах, используемых для оценки 13-16. Квантовые точки (КТ) маркировка в сочетании с ТЕА была использована для оценки плазмид на одну частицу в основе хитозана наночастиц. Оценка этой QD техника сложна в связи с необходимостью для обозначения ДНК, который может изменить его самостоятельной сборки свойств; возможность того, что инкапсулированные немеченых ДНК непосредственно не обнаружено; потенциально перекрывающихся плазмид и КТ в 2D-изображений ПЭМ частиц, и другие упрощающие предположения 13. Альтернативный подход, которыйpplicable при заказе микродоменов существуют в частицы были использованы для изучения Lipopolyamine-комплексов ДНК с помощью крио-электронной микроскопии (крио-TEM), рассеяния рентгеновских лучей и динамического рассеяния света (DLS) 14,15. К сожалению, материалы, такие как полимерные наночастицы исследовали здесь не применимы с этим методом. . В другом исследовании, Collins и др. использовали изображения потока частиц методики анализа для изучения (Lys) 16-содержащий пептид / ДНК, однако их метод может оценить только большие, частиц микронного размера 16. Таким образом, мы недавно разработали новый и гибкий анализ для количественного определения количества плазмид в наночастицы 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сотовые Сеялки
- Не позволять клеткам расти в overconfluency. Используйте ранних клеток при прохождении трансфекции первичных клеток.
- Двадцать четыре часа до трансфекции trypsinize клеток, подсчет клеток с использованием гемоцитометр, и развести суспензию клеток со средствами массовой информации для достижения желаемой плотности клеток (клеток / объем). Семенной клеток в культуре ткани ясно обращению с плоским дном 96-луночный использованием водохранилища и многоканальных пипеток. Выбранная плотность должна дать 70-80% слияния в день трансфекции. Например, как показано в Таблице 1, клетки разводили от 25 до 50 клеток / мкл для трансфекции данные, представленные здесь.
2. Трансфекции клеток
- Разведение полимеров и ДНК запасов. Оттепель полимеров и растворов ДНК складе при комнатной температуре (RT). Разбавить раствор полимера акций и решением ДНК акции, отдельно в чистом 96-луночные использованием двенадцати-канальная пипетка, При соответствующем растворителе к концентрации, необходимые для получения желаемого полимера ДНК весовых соотношениях (вес / вес). В этом случае, выбранный растворитель 25 мМ ацетата натрия (рН = 5,2).
- ДНК разведения. Как правило, ДНК хранится в дозе 1 мг / мл разбавляют в буфере ацетата натрия в концентрации от 0,03 до 0,06 мг / мл в ясном не-культуры тканей обработанных 96-луночный планшет (один хорошо для одной формулировке). Таблица 2 показывает, Типичный протокол разведения ДНК для одной формулировки использовали для трансфекции четыре повторных скважин в 96-луночный планшет засевали клетки Шаг 1.
- Полимерные разведения. 100 мг / мл полимер / ДМСО раствор разбавляют в буфере ацетата натрия в зависимости от концентрации, необходимой для получения желаемого полимера ДНК вес / вес отношение. Диапазон вес / вес отношения обычно используются для доставки генов с поли (бета-амино эфир) с (PBAEs) составляет от 20 до 100. PBAE полимеров сначала разбавляют до 10 мг / мл, с последующим разбавлением рrotocol, как показано в таблице 3. Полимер разведения могут быть выполнены в четком не-культуры тканей обработанных 96-луночный планшет, который соответствует ориентации образца пластины разведения ДНК.
- Формирования наночастиц. Добавить PBAE решение равном объеме плазмиды решение ДНК с использованием двенадцати-канальная пипетка и смешать энергично. Пусть смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы позволить самостоятельной сборки.
- Наночастицы трансфекции. После самосборки, 20 мкл наночастицы добавлены в хорошо капле культуральной среды с использованием двенадцати-канальные пипетки. Повторить скважин лечить или трансфицируют с помощью коммерчески доступных реагентов в качестве контроля. Трансфицированные клетки инкубируют при 37 ° C в течение двух-четырех часов, а затем скважин заменяется свежим СМИ (100 мкл / лунку). Выбор времени инкубации будет зависеть от клеточной линии, условий культивирования, и трансфекции системы. Разница в трансфекцииЭффективность и клеточной токсичности в результате различных инкубационный период будет количественно путем анализа протоколов описано в пункте 3.
3. Анализ эффективности трансфекции и клеточная токсичность
Эффективность трансфекции анализируется визуально с помощью флуоресцентного микроскопа и количественно с помощью проточной цитометрии через сорок восемь часов после трансфекции. Сотовые токсичности проанализированы визуально с помощью флуоресцентного микроскопа и количественно, используя CellTiter 96 водную анализа двадцати четырех часов после трансфекции.
- Флуоресцентной микроскопии. Визуальный анализ скважин для выражения трансфицированных гена-репортера (например, EGFP или DsRed) при помощи соответствующих флуоресценции канала. Получение изображений для каждой скважины, выбирая поля зрения, надлежащим образом представлять эффективность трансфекции для конкретных составов (рис. 1). Запишите любую ячейку токсичность наблюдается визуально.
- Проточной цитометрии.
- Использование многоканальных пипеток для подготовки 96-луночный планшет для проточной цитометрии. Промыть PBS, trypsinize с 30 мкл / лунку трипсин / ЭДТА, нейтрализовать с 170 мкл буфера FACS (PBS + 2% FBS), пипетки вверх и вниз в каждую лунку, в том числе по краям, и передать весь 200-мкл объема каждой скважине в соответствующие скважины в с круглым дном или V-дно 96-луночный планшет.
- Центрифуга пластины при 130 мкг в течение 5 мин при 4 ° C.
- Удалить 170 мкл среды из каждой лунки и пипетки для ресуспендирования клеток, избегая при этом пузырьки. Для жизнеспособности пятно, как пропидия йодида (PI), добавить 10 мкл буфера FACS + PI (50:1 FACS буфера: PI разведения; PI складе концентрации 1 мг / мл) в каждую лунку. Немедленно поместите на льду и укрыть от света.
- Начать поток C6 Accuri цитометр, HyperCyt 96-а привязанность, и программное обеспечение HyperView. Используйте HyperView Дизайн и протокол вкладки, чтобы выбрать подходящий рпозднего типа, пластины расположение и другие параметры, такие как дрожание / SIP / полоскание / поколебать времени. Для приведенного выше протокола, использовались следующие параметры, предварительно пластину премьер течение одной минуты, и предварительно пластину встряхивают в течение 30 сек при 2400 оборотах в минуту. Sip время было назначено на 15 сек при 15 оборотах в минуту, зонд, промыть каждую лунку в течение 2 сек, а между хорошо встряхнуть каждые 12 скважин в течение 12 сек при 2400 оборотах в минуту. Межскважинной сотрясение важно, чтобы клетки рассеяны в средствах массовой информации, а также для улучшения способности обрабатывать данные, в том числе приурочен перерывах между группами скважин (в данном случае 12 сек).
- Используйте HyperView Ну вкладку Идентификация для обработки данных и отдельный в соответствующие скважины (рис. 2). Для того, чтобы определить индивидуальные скважины, с ее помощью можно использовать шума программного обеспечения фильтра, а также включающей в себя базовую даже фильтр под расширенные настройки.
- Количественно процент положительно трансфицировали живых клеток соответствующей стробирования для разделения различных поп-ulations (рис. 3). Первый просмотр потока данных на участке разброс FSC против SSC для того, чтобы отдельные клетки от мусора (рис. 3А). Если пропидия йодида (PI) был использован, воротах отдельные популяции клеток и мнение, что данные о заговоре против FSC FL3 того, чтобы отделить живые клетки от мертвых клеток и ворота живых клеток. Для того, чтобы количественно число трансфицированных клеток, просматривать живое клеточной популяции по соответствующим каналам, например, GFP можно увидеть в FL1. Использование необработанной населения, ворота необработанных клетках с целью определения фонового сигнала (рис. 3В). Положительно трансфицированные клетки могут быть выделены с помощью этой ворот и, просмотрев трансфицированных населения с использованием как разброс и контурные графики (рис. 3C и 3D). Там может быть континуум положительно трансфицированные клетки, так как различные клетки будут трансфицировали в разной степени флуоресценции.
- CellTiter 96 водную анализа
- Трансфекции другую тарелку точно таким же образом для измерения клеточной токсичности.
- Премикс 1 мл CellTiter 96 водную анализ решение с 10 мл свежей среды. Удалите носитель из клетки и использовать многоканальную пипетку, чтобы добавить 110 мкл предварительно смешанный раствор + СМИ на лунку.
- Измерить абсорбцию при 490 нм каждый час интервале от 1 до 4 часов, пока поглощение из скважины с необработанными условия в линейном диапазоне анализа. Включите четыре контрольных скважин с единственным решением + носитель для чтения поглощения фона.
- Среднее значение оптической плотности от четырех повторных скважин в состояние, и вычесть среднюю абсорбцию фоне друг от среднего. Нормализация исправлены среднем на каждого рассматриваются условия, чтобы исправить средней необработанной условия для определения жизнеспособности процентов клеток.
- Премьер-системы струйной из NanoSight NS500 путем запуска насоса разбавителя вперед примерно на 1/5th максимальная скорость и образец насоса в обратном направлении примерно на 1/10th максимальной скорости. Продолжайте, пока система струйной промывают растворителем.
- Подготовка наночастиц для анализа. В случае PBAEs, отдельно разбавить складе ДНК плазмиды (1 мг / мл) и фондовых PBAE (100 мг / мл) в буфере ацетата натрия (25 мМ, рН 5) в пробирках Эппендорф.
- Развести концентрации ДНК плазмиды до 0,06 мг / мл. Концентрация полимера может варьироваться в зависимости от требуемого веса веса полимера с ДНК (например, в течение 60 вес / вес частиц полимера разбавляют до 3,6 мг / мл).
- Добавить раствора полимера в равном объеме плазмиды решение ДНК и смешать энергично. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы позволить самостоятельной сборки.
- Diлютне наночастиц решение 100-кратного в PBS для того, чтобы концентрация наночастиц, чтобы быть в соответствующем диапазоне NTA и получить конечный объем не менее 500 мкл.
- Загрузка образца в NanoSight путем размещения загрузки трубы в образец Eppendorf трубки (рис. 4а). Убедитесь в том, чтобы не вводить пузырьки воздуха.
- В режиме захвата, увеличение камеры до уровня частицы могут быть видны. Отрегулируйте фокус, так что частицы выглядят гладкими (рис. 4а и 4б).
- В то время как в стандартном режиме, настроить камеру уровню прошлого точки, что все частицы можно увидеть на экране. Затем уменьшите камеру уровня до самого низкого уровня таким образом, что частицы могут все еще быть соблюдены. Если средний уровень требуется камера, перейдите в расширенный режим и изменить затвора камеры и получить на соответствующих уровнях.
- Визуально проверить, чтобы убедиться, есть между 20 - 100 частиц на сcreen. Идеальный номер для отслеживания наночастиц составляет около 50 частиц. Если есть слишком много или слишком мало, промойте NS500, отрегулируйте разведения в PBS, и вновь загрузить образца.
- Отрегулируйте захвата продолжительность в соответствии со стандартной таблицей режиме. Обычно 30 - 60 сек соответствующей длины захвата (рис. 4В).
- Для загрузки следующего образца, промыть систему, а затем вновь загрузить нового образца.
- Как только видео в плен, переходите к стадии обработки, открыв видео-файл.
- Есть ряд параметров, которые могут быть настроены для наилучшего обработки видео (рис. 4в). Цель состоит в том, чтобы выбрать параметры, которые наилучшим захватить каждую частицу на экране, как показано красным крестиком на экране над каждой частицей (рис. 5).
- Увеличение экрана усиления, чтобы лучше видеть частиц. В соответствии со стандартной или расширенный режим, выберите автоматической настройки для параметров clickinг соответствующие поля. В случае, если автоматические настройки не совсем адекватно выбрать частиц, повторно щелкните поле и вручную установить параметры (рис. 4в).
- После того как все частицы собираются на экране, нажмите кнопку процессе программного обеспечения для обработки видео файлов (рис. 4в). Это обеспечивает распределение частиц по размерам, размер средних, а также концентрация частиц.
- Для того, чтобы убедиться, что концентрация частиц является точной, изменить разведения PBS, например, путем увеличения разбавления 2x, и повторите описанную выше процедуру. Измерение нескольких разведений того же образца рекомендуется убедиться, что измерение концентрации образца является точной. Хороший диапазон измерения 10 7 -10 9 частиц / мл.
- Убедитесь, что все плазмиды были включены в наночастицы, запустив гель-электрофореза наночастиц и оценке ли свободной ДНК присутствует.Если не все плазмиды инкапсулированные, используя стандартные методы для измерения поглощения ДНК для того, чтобы количественно общего инкапсулированные плазмид.
- Для расчета среднего числа плазмид на одну частицу, разделить общее инкапсулированные плазмиды концентрации НТА измеренной концентрации частиц. Для того чтобы оценить плазмиды в распределении образца частицы, сначала использовать размер частиц НТА гистограммы для расчета объемной доли каждого 1-нм бен частиц. Умножьте это распределение объемной долей на общую сумму плазмиды, чтобы получить число плазмид в каждой корзины. Разделите эти цифры на количество частиц в каждом мусорное ведро, чтобы получить число плазмид за частицей для каждого размера частиц (рис. 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показано изображение флуоресценции микроскопии пример успешной трансфекции HRECs с EGFP плазмиды. Образ светлого полезно убедиться, что клетки сохраняют свою обычную морфологию. Кроме того, жизнеспособность клеток анализы, такие как МТС или аналогичные анализы, может быть использована для оценки токсичности наночастиц 7. Проточной цитометрии, как описано выше, может быть использована для количественной оценки эффективности трансфекции. При использовании HyperCyt мульти-и крепежную пластину, данные должны быть обработаны соответствующим образом для правильного определения скважин. Как можно видеть на правой панели рис 2, когда количество клеток хорошо (тысячи клеток на лунку) и струйной работают нормально, отдельные скважины легче выбрать как вручную, так и с помощью программного обеспечения. Однако, если количество клеток являются слишком низкими или есть проблема с струйной, он становится гораздо более трудно определить индивидуальноUAL скважин (левая панель рис. 2), и эксперимент вероятно, должна быть повторена. Замена трубки Hypercyt часто может исправить проблемы с потоком пробы. Как только человек также получены данные, наиболее распространенным программным обеспечением проточной цитометрии могут быть использованы для анализа экспорт. FCS файлов. На рисунке 3 FlowJo используется для ворот положительно трансфекции клеток по сравнению с необработанными скважин.
PBAE наночастиц, как правило, от 100 - 200 нм, как измеряется NanoSight НТА. При выполнении NTA, важно, что количество наночастиц на экране будет между 20 -. 100, так что программа сможет точно отслеживать частицы Рисунок 5А является примером слишком много частиц, в то время рисунке 5б показывает пример соответствующий номер. Обработка отснятого видео должно быть сделано таким образом, что наблюдаемые частицы экране подобраны Softwar е, представлены с красным крестом волос. Например, когда порог для сбора частиц слишком низко можно увидеть на рисунке 5C, в то время как пример лучше порогового уровня показано на рисунке 5D. Различные разведения образца могут быть выполнены, чтобы убедиться, что образец находится в правильном диапазоне концентраций. Новый концентрации частиц определяется NanoSight должны соответствовать новым разведения. После того размера и концентрации частиц получены, плазмиды в среднем частиц и распределение могут быть рассчитаны. Пример результаты можно увидеть на рисунке 6. Экспериментальные сроки показано на рисунке 7.
| Wells / Plate | Объем / ж (мкл) | Клеток / лунку |
| 96 | 100 | 2500 до 5000 |
| Wells / Plate | Объем / ж (мкл) | Объем частицы / ж (мкл) | ДНК / ж (мкг) | ДНК (мкг / мкл) | ДНК 1 мкг / мкл складе (мкл) | NaAc (мкл) |
| 96 | 100 | 20 | 0,6 | 0,06 | 3 | 47 |
Таблица 2. Типичный протокол разведения ДНК для 96-луночный планшет формата.
| Полимерные: ДНК (вес / вес) | Объем частицы / ж (мкл) | # Репликацию Wells | ДНК / ж(Мкг) | Полимер / ж (мкг) | Полимерные / 10 мкг / мкл складе (мкл) | NaAc (мкл) |
| 20 | 20 | 4 | 0,6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0,6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0,6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0,6 | 60 | 30 | 20 |
Таблица 3. Типичные разбавления полимера протокол для 96-луночный планшет формата.
Рисунок1. Один цвет канала флуоресценции из HRECs трансфицировали PBAE (слева) флуоресценции GFP, зеленого цвета;. (Middle) Светлое изображение; (Right) Композитный изображение.
Рисунок 2. Hypercyt программного обеспечения и шаг после идентификации данных, собранных (слева) Примеры проблемных данных в связи с малым количеством или проблема с струйной;.. (Справа) Пример чистой данных, с легко идентифицировать скважин Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. FlowJo стробирования для клеток, трансфицированных EGFP плазмиды () FSC против SSC для необработанных клетках;. (B) FL1 против FL3 для иntreated клеток; (C, D) FL1 против FL3 для клеток, трансфицированных PBAE. И псевдо-плотность цвета (C) и (D) участков контура полезно для определения местоположения обратить ворот.
Рисунок 4. Скриншот из частей NanoSight наночастиц отслеживания анализа программного обеспечения, версия 2,2 (A) струйной контроля;. (B) режиме съемки, используется для захвата видео наночастиц; (C) Режим обработки доступны после открытия ранее захваченного видео. Красные коробки выделить функции обсуждаются в протоколе. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 5. . Пример NanoSight видео захвата и анализа Скриншоты образца до захвата видео для образца, который не разбавляют достаточно (A), а также с соответствующего разбавления (B); Скриншоты анализ режима с частицей порога обнаружения установлен слишком низкий (C) и устанавливается соответствующим (D), с красным крестом волос выявления всех частиц соответственно. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 6. Распределение размера и плазмиды в распределении частиц данным PBAE (B5S3E7, 60:1 полимера ДНК вес / вес) наночастицы на основе проанализированы с помощью NanoSight отслеживание методики анализа. Перепечатано из [14] Маленькие, 8, Bhise, NS, Шмуэли, RB, Гонсалес ,J., и зеленый, JJ роман анализа для количественного определения количества плазмиды инкапсулированные наночастицы полимера, 367-373, Copyright 2012, с разрешения Wiley-VCH. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 7. Экспериментальные шкале.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протоколы выше, описывают методы оценки эффективности трансфекции наночастиц составов, а также способ охарактеризовать размер частицы и ДНК загрузки наночастиц. Количество плазмид на одну частицу является важным параметром, который может помочь предсказать эффективность частиц, а также может быть использован для определения дозы. Анализ наночастиц отслеживания могут быть выполнены в диапазоне различных водных растворов, таких как различные по концентрации соли. Часто эта характеристика выполняется в PBS, чтобы имитировать физиологический раствор. В то время как размеры в PBS может дать хорошую оценку размера наночастиц в средствах массовой информации или физиологического раствора, количество сыворотки настоящее может влиять на размер и стабильность наночастиц 17. Таким образом, частица характеристик в различных концентрациях сыворотки может быть важным для некоторых приложений, а также. Для того чтобы охарактеризовать частиц в сыворотке крови, дополвнутренней шаг рекомендуется из-за высокой рассеяния фоне сывороточных белков. В этом случае частицы должны быть флуоресцентно помечены, так что с помощью флуоресцентного фильтра, частицы могут быть специально гусеничных отдельно от белков сыворотки крови.
Плазмиды в количественном частицы достаточно общим, чтобы использоваться с различными составами наночастиц, в том числе других полимерных или неорганических систем частиц. В связи с различным поведением рассеяния света из различных материалов, захвата видео и обработки параметров, возможно, придется изменить. Кроме того, чувствительность НТА может меняться в зависимости от материала. Плазмиды в протоколе частицу описано выше это быстрый и удобный метод для характеристики наночастиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) и NIH R21CA152473 за поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
