Summary
Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ve polimerik gen teslimat nanopartiküller değerlendirmek için high-throughput Akım sitometri için bir protokol tanımlanmıştır. NTA nanoparçacık parçacık büyüklüğü dağılımı ve plazmid başına parçacık dağılımını karakterize etmek için kullanılmaktadır. Yüksek throughput flow sitometri gen teslimat biyomalzemelerin bir kütüphane için nicel transfeksiyon etkinliği değerlendirilmesini sağlar.
Abstract
Polimerik nano partiküller kullanarak Sigara viral gen teslimat genetik hastalıklar 1. tedavisinde gen tedavisi için cazip bir yaklaşım olarak ve rejeneratif tıp 2 için bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Önemli güvenlik sorunları var virüsler, aksine, polimerik nano partiküller büyük nükleik asit kargo ve biyolojik olarak parçalanabilen ve / veya çevreye duyarlı taşıma kapasitesine sahip, kimyasal olarak çok yönlü, sentezlemek için non-toksik, non-immünojen olmayan mutajenik, daha kolay olması için dizayn edilebilir. Katyonik polimerler yaygın polimerik nano partiküller olarak adlandırılır 100 nm sırasına komplekslerini oluşturmak için elektrostatik etkileşim yoluyla negatif yüklü DNA ile kendi kendine monte. Nano ölçekli polikatyonik gen aktarımı nanopartikülleri oluşturmak için kullanılan biyomateryaller örnekleri arasında bir non-parçalanabilir off-the-shelf bir polilisin, polyphosphoesters, poli (amidoamines) s ve polietilenimin (PEI), yaygın olarak bulunur nükleik asit aktarımı ile 1,3 kullanılan katyonik polimer. Poli (beta-Aminoester) s (PBAEs), 5,6 hidrolitik olarak parçalanabilir olan ve bu tür insan retina endotel hücreleri (HRECs) 7 gibi sert-transfekte hücre tipleri için gen aktarımının etkili olduğu gösterilmiş olan katyonik polimerler 4 yeni bir sınıfıdır fare meme epitel hücreleri 8, insan beyninin kanser hücreleri 9 ve 10 makrovasküler (insan umbilikal ven, HUVEC'lere) endotel hücreleri.
Nanoparçacık izleme analizi (NTA) kullanılarak polimer nanopartikülleri karakterize etmek için yeni bir protokol tarif edilmektedir. Bu yaklaşıma göre, partikül büyüklük dağılımı ve parçacık başına plazmid sayısı dağılım hem de 11 elde edilir. Buna ek olarak, polimer nanopartikülleri ile transfeksiyon etkinliğinin hızlı taranması için olan bir yüksek verimli 96-plaka transfeksiyon deneyinde sunulmuştur. Bu protokol, poli (beta-amino ester) s (PBAEs) model polimerler ve insan retina endotel hücreleri (HRECs) olarak kullanılır mo olarak kullanılmaktadırdel insan hücreleri. Bu protokol, kolayca herhangi bir polimerik nanoparçacık ve bir multi-plaka biçiminde ilgi herhangi bir hücre tipi değerlendirmek için adapte edilebilir.
Introduction
Nanoparçacık başına komplekslenmiş plazmid sayısının belirlenmesi, özellikle de aynı hedef hücre için birden çok plazmit ortak dağıtımı için etkili nanoparçacık tabanlı bir gen aktarım stratejilere tasarlamak için önemli olan, sıklıkta çalışmaları 12 yeniden programlanması kök hücre gereklidir. Tek bir nanoparçacık ile ilişkili plazmid sayısını hesaplamak için birkaç yaklaşım tarif edilmiştir ve her bir yaklaşım tahmin 13-16 için kullanılan teknikler de dezavantajları vardır edilmiştir. TEM ile birlikte Kuantum nokta (QD) etiketleme kitosan tabanlı nanopartiküller parçacık başına plazmidler tahmin etmek için kullanılır olmuştur. Kapsüllü etiketsiz DNA doğrudan tespit edilememesi olasılığı;; potansiyel örtüşen plazmidler ve parçacıkların 2D TEM görüntülerde QDS; Bu QD teknik ile Kestirimi nedeniyle kendinden montaj özelliklerini değiştirebilir DNA, etiketlemek için ihtiyaç karmaşık ve Diğer basitleştirici kabuller 13. Bir alternatif bir yaklaşımpplicable sipariş microdomains parçacıklar mevcut olduğunda kriyo-transmisyon elektron mikroskobu (kriyo-TEM), X-ışını saçılması ve dinamik ışık saçılımı (DLS) 14,15 aracılığıyla Lipopolyamine-DNA kompleksleri incelemek için kullanılır olmuştur. Ne yazık ki, bu tür araştırmak burada polimer nanopartikülleri gibi malzemeler bu yöntem ile uygulanabilir değildir. . Ancak, kendi yöntemi sadece büyük, mikron boyutlu parçacıklar 16 değerlendirebilir; başka bir çalışmada, Collins ve ark çalışmak için bir akış parçacık görüntü analizi tekniği (Lys) 16-içeren peptid / DNA kompleksleri kullanılır. Böylece, son zamanlarda nanoparçacık 11 başına plazmit sayısı ölçmek için bir roman ve esnek analiz geliştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Seeding
- Hücreleri overconfluency büyümeye izin vermeyin. Birincil hücreler transfekte erken ne zaman geçiş hücreleri kullanın.
- Transfeksiyon öncesi Yirmi dört saat, hücrelerin Trypsinize bir hemositometre kullanılarak hücrelerin sayısı, ve arzu edilen hücre yoğunluğu (hücre / hacim) elde etmek için ortam ile hücre süspansiyonu seyreltin. Net doku içine Tohum hücrelerinin bir rezervuar ve çok kanallı pipetler kullanarak düz alt 96-kuyucuğu kültür-tedavi. Seçilen yoğunluk transfeksiyon gününde confluency% 70-80 vermelidir. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, örneğin, hücre burada gösterilen veri transfeksiyon için 25-50 hücre / ml' ye seyreltilir edildi.
2. Hücre Transfeksiyon
- Polimer ve DNA stokların seyreltilmesi. Oda sıcaklığında (RT) az polimer ve DNA stok çözeltileri, çözülme. On iki kanallı pipet kullanarak net 96-kuyucuğu ayrı polimer stok solüsyonu ve DNA stok solüsyonu, sulandırınız, DNA ağırlık oranı (ağırlık / ağırlık) için arzu edilen polimer ağırlığı elde etmek için gereken konsantrasyon ile uygun bir solvent ile. Bu durumda, seçilen çözücü, 25 mM sodyum asetat tamponu (pH = 5.2) 'dir.
- DNA seyreltme. Tipik olarak, 1 mg / ml 'de saklanan DNA olmayan bir doku kültürü ile tedavi edilen berrak 96-kuyulu plaka (tek bir formülasyon için iyi bir) 0,03-0,06 mg / ml' lik bir konsantrasyon ile sodyum asetat tamponu içinde seyreltilir. Tablo 2 Adım 1 hücreleri ile tohumlanan 96 çukurlu bir plaka içinde dört tekrarlanan kuyu transfekte etmek için kullanılan tek bir formülasyon için tipik seyreltme DNA protokolü.
- Polimer seyreltme. 100 mg / ml polimer / DMSO çözeltisi DNA ağırlık / ağırlık oranı arzu edilen polimer elde etmek için gerekli olan konsantrasyon göre sodyum asetat tamponu içinde seyreltilir. Genellikle poli (beta-amino ester) s (PBAEs) ile gen dağıtımı için kullanılan ağırlık / ağırlık oranları aralığı 20 ila 100 'dür. PBAE polimerler ilk seyreltme s, ardından 10 mg / ml 'ye seyreltilirotokol, Tablo 3'te gösterilmiştir. Polimer seyreltmeler DNA seyreltme plaka yönlendirme örnek uygun olmayan bir doku kültürü ile tedavi edilen berrak 96-kuyulu plaka içinde gerçekleştirilebilir.
- Nanoparçacık oluşumu. On iki kanallı pipet kullanarak plazmid DNA çözeltisi eşit hacmi PBAE çözümü eklenir ve şiddetle karıştırın. Kendi montaj izin vermek için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışım izin verin.
- Nanoparçacık transfeksiyon. Kendi montaj sonrasında, 20 ul nanopartiküller on iki-kanallı bir pipet kullanılarak kültür ortamı ile damla damla başına de eklendi. Replicate kuyu tedavi edilmeyen kontroller olarak veya ticari olarak mevcut reajanlardır ile transfekte edilir. Transfekte hücreler, 37 ° inkübe edilir 2-4 saat sonra kuyular için C taze ortam (100 ul / çukur) ile değiştirilir. İnkübasyon süresi seçimi hücre hattı, kültür koşulları ve transfeksiyon sisteminize bağlıdır. Transfeksiyon farklılıkKuluçka süresi değişen bir sonucu olarak verim ve hücre toksisitesinin Aşama 3'te tarif edildiği gibi analiz protokol ile ölçülür.
3. Transfeksiyon Verimlilik ve Hücre Toksisitesi Analizi
Transfeksiyon etkililiği, flöresanlı bir mikroskop ile görsel olarak incelendi ve bir akış sitometresinde kırk sekiz saat post-transfeksiyon kullanılarak ölçülür. Hücre toksisite, flöresanlı bir mikroskop ile görsel olarak incelendi ve CellTiter 96 sulu bir tahlil yirmi-dört saat post-transfeksiyon kullanılarak ölçülür.
- Floresan mikroskobu. Görsel olarak uygun floresan kanalı kullanılarak transfekte edilen raportör gen (örneğin, EGFP veya DsRed) ifadesi için analiz kuyu. Uygun özel formülasyon (Şekil 1) için transfeksiyon verimliliği temsil görüş alanları seçerken, her sıra için görüntüleri edinin. Görsel gözlemlenen herhangi hücre toksisite bir yere not edin.
- Akış sitometrisi.
- Akım sitometri için 96-plaka hazırlamak için çok kanallı pipetler kullanın. PBS ile yıkayın, ul / kuyu tripsin / EDTA 30, kenarlarda da dahil olmak üzere, her bir kuyuya, 170 ul FACS tampon (PBS +% 2 FBS) ile pipet kadar nötralize ve aşağı Trypsinize, ve tüm 200-ul hacim transferi Bir yuvarlak tabanlı veya V-alt 96-plaka karşılık gelen kuyulara her iyi.
- 4, 5 dakika boyunca 130 xg'de levha santrifüje ° C.
- Kabarcıklar kaçınarak her süspansiyonu iyi ve pipet hücrelerden 170 ul ortamı çıkarın. Her bir kuyucuğa, a canlılığı propidyum iyodür (PI) gibi leke kullanmak için, FACS tamponu + PI (PI stok konsantrasyonu 1 mg / ml 'PI seyreltme 50:1 FACS tampon) 10 ul ekle. Hemen buz üzerine yerleştirin ve ışıktan kapsamaktadır.
- C6 Accuri akış sitometresi, 96-eki HyperCyt ve HyperView yazılımını başlatın. Uygun p seçmek HyperView Tasarım ve Protokol sekmeleri kullanınGeç tipi, plaka düzeni ve bu tür sallamak / yudum gibi diğer ayarlar / / durulama zamanı sallayın. Yukarıdaki protokol için, aşağıdaki parametreler bir dakika ve 2400 rpm'de 30 saniye boyunca bir ön plaka sallamak için, bir ön plaka asal kullanılmıştır. Sip süresi 15 rpm'de 15 sn için kuruldu, bir prob 2 sn de her durulayın ve bir inter-de 2,400 rpm'de 12 saniye boyunca her 12 kuyuda sallayın. Inter-de sarsıntı hücrelerin kuyu grupları arasında zamanlanmış sonları (bu durumda 12 saniye içinde) ekleyerek verileri işlemek için gelişmiş yeteneği yanı sıra, medyada dağınık tutmak için önemlidir.
- Uygun zamanda (Şekil 2) içine veri ve ayrı işleme HyperView Peki Kimlik sekmesini kullanın. Bireysel kuyular tespit etmek için, bu yazılım gürültü filtresi yanı sıra gelişmiş ayarları altında bile filtre bir baz dahil olmak üzere kullanmak için yardımcı olabilir.
- Farklı açılır ayırmak için uygun yolluk tarafından olumlu transfekte canlı hücrelerin yüzdesi sayısalulations (Şekil 3). İlk enkaz (Şekil 3A) ayrı hücreleri için bir FSC vs SSC dağılım arsa üzerinde akış verileri görüntülemek. Propidium iyodür (PI) kullanılmışsa, kapı bireysel hücre popülasyonu ve görünümü bir FSC vs FL3 arsa üzerinde veri ölü hücreleri ve kapı canlı hücrelerin canlı hücreleri ayırmak için. Transfekte edilmiş hücrelerin sayısı ölçmek için, uygun kanal üzerinde bir canlı hücre nüfusunun görünüm, örneğin GFP FL1 görülebilir. Kapısı arka plan sinyali (Şekil 3B) tespit etmek için, tedavi edilmeyen nüfus işlenmemiş hücreler kullanılması. Olumlu transfekte hücreler daha sonra bu kapı kullanılarak izole ve scatter ve kontur grafikleri (Şekil 3C ve 3D) her ikisini de kullanarak transfekte nüfus görüntüleyerek. Edilebilir Farklı hücre floresan farklı derecelerde transfekte edileceği gibi, pozitif olarak transfekte edilmiş hücrelerin bir süreklilik içinde olabilir.
- CellTiter 96 sulu bir tahlil
- Hücre toksisite ölçümleri için tam olarak aynı şekilde başka bir plaka transfekte.
- 10 ml taze medya ile CellTiter 96 sulu bir test solüsyonu Premiks 1 ml. Hücreleri bulunan ortamı çıkarın ve premix çözüm 110 ul + kuyu başına medya eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın.
- Işlenmemiş koşulu ile kuyudan absorbans testin lineer aralığında kadar 490 nm 1 ila 4 saat için her bir saat arayla absorbansı ölçülür. Bir arka plan absorbans okuma için tek çözüm + medya ile dört kontrol kuyuları ekleyin.
- Ortalama absorbans koşulu başına dört tekrarında kuyulardan değerleri ve her ortalama ortalama plan absorbans çıkarın. Yüzde hücre yaşayabilirliği belirlemek için, tedavi edilmeyen durumun düzeltilmesi için ortalama her bir tedavi edilen durum için düzeltilmiş ortalama normalize edilir.
- Yaklaşık 1/5th maksimum hız ve maksimum hız yaklaşık 1/10th de geriye örnek pompa ileri seyreltici pompa çalıştırarak Nanosight NS500 Prime Sıvıların sistemi. Sıvıların sistemi seyreltici ile temizlendi kadar devam edin.
- Analiz edilecek nanoparçacıklar hazırlayın. PBAEs durumunda, ayrı ayrı stok plasmid DNA (1 mg / ml) ve Eppendorf tüpleri içinde sodyum asetat tampon içinde stok PBAE (100 mg / ml) (25 mM, pH 5) seyreltin.
- 0.06 mg / ml 'ye plazmid DNA konsantrasyonu seyreltilir. Polimer konsantrasyonu DNA polimer için gerekli ağırlık-ağırlık oranına bağlı olarak değişebilir (60 ağ / ağ parçacık için, örneğin, polimer 3.6 mg / ml 'ye seyreltilir).
- Plazmid DNA çözeltisinin eşit bir hacmi ile polimer solüsyonu eklenir ve güçlü bir şekilde karıştırılır. Kendi montaj izin vermek için 10 dakika için oda sıcaklığında karışım inkübe edin.
- DiUd nanoparçacık konsantrasyon için sırayla 100 kat PBS içine nanoparçacık çözelti NTA için uygun bir aralık içinde olması ve en azından 500 ul nihai hacim elde etmek için.
- Örnek Eppendorf tüpü (Şekil 4A), yükleme borusu içine yerleştirerek Nanosight içine örnek yerleştirin. Hava kabarcıkları tanıtmak için değil emin olun.
- Parçacıklar görülebilir kadar yakalama modunda, kamerayı düzeyini artırmak. Partikülleri (Şekil 4A ve 4B) düzgün bakmak böylece odak ayarlayın.
- Standart modda iken, tüm parçacıkların ekranda görülebilir noktadan kamera düzeyini ayarlayın. Ardından parçacıklar hâlâ görülebilir böyle düşük seviyeye kamera seviyesini azaltmak. Bir ara kamera seviyesinde gerekli ise, gelişmiş moduna geçer ve kamera deklanşör değiştirmek ve uygun düzeylere kazanmak.
- Görme 20 arasında olmadığından emin olmak için kontrol edin - s 100 partiküllerkontrastını ve parlaklığını. Nanoparçacık izleme için ideal sayı yaklaşık 50 parçacıklardır. Çok fazla veya çok az varsa, NS500 floş PBS içine seyreltme ayarlayın ve örnek yeniden yükleyin.
- Standart mod tabloya göre yakalama süresini ayarlayın. Genellikle 30 - 60 saniye uygun bir yakalama uzunluğu (Şekil 4B) 'dir.
- Sonraki örnek yüklemek için, yeniden yüklemek yeni bir örnek daha sonra, sistem yıkayın.
- Bir kez videoları yakalanır, bir video dosyasını açarak işlem aşamasına geçin.
- Iyi (Şekil 4C) bir video işlemek için ayarlanabilir parametreleri vardır. Amaç en iyi şekilde her parçacık (Şekil 5) üzerindeki ekranda kırmızı bir çarpı işareti ile belirtilir ekrandaki her parçacık, yakalama parametrelerini seçmektir.
- Iyi partikülleri görmek için ekrana kazanç artırın. Standart veya gelişmiş modu altında, otomatik üzerine tıklayarak tarafından parametrelerini ayarlamak seçing uygun kutuları. Otomatik ayarlar yeterli parçacıklar seçmemeniz durumunda, unclick kutusu ve parametreleri manuel olarak (Şekil 4C) ayarlayın.
- Bir zamanlar tüm parçacıkların ekranda toplanır, video dosyası (Şekil 4C) işlemek için yazılım süreci düğmesini tıklatın. Bu, parçacık boyutu dağılımı, ortalama boyutu, hem de partikül konsantrasyonu sağlar.
- Partikül konsantrasyonu doğru olduğundan emin olmak için, 2x seyreltme artırarak PBS seyreltme gibi değiştirin ve yukarıdaki işlemi tekrarlayın. Aynı örnek çoklu dilüsyonları ölçülmesi örnek konsantrasyon ölçüm doğru olduğundan emin olmak için tavsiye edilir. Ölçümü için iyi bir dizi 10 7 -10 9 parçacıklar / ml 'dir.
- Tüm plazmidler nanopartiküller jel elektroforezi çalışan ve herhangi bir serbest DNA mevcut olup olmadığını değerlendirerek nanopartiküller dahil olduğunu doğrulayın.Tüm plazmid kapsüllü ise, toplam kapsüllü plazmidler ölçmek amacıyla DNA absorbans ölçmek için standart teknikleri kullanın.
- Parçacık başına plazmidlerin ortalama sayısını hesaplamak için, NTA ölçülen partikül konsantrasyonu ile toplam kapsüllü plazmid konsantrasyonu bölün. Plazmid başına parçacık örnek dağılımını tahmin etmek için, ilk olarak partikül her bir 1-nm kabın hacim fraksiyonu hesaplamak için NTA parçacık boyutu histogram kullanır. Her bin plazmid sayısını elde etmek için toplam plazmid miktarı ile bu hacim fraksiyonu dağıtım çarpın. Her parçacık boyutu (Şekil 6) plazmidler başına partikül sayısını elde etmek için, her bin parçacıkların sayısı bu sayıyı böler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, plazmid EGFP HRECs ile başarılı bir şekilde aktarılmasının bir örnek olarak, flöresanlı bir mikroskop görüntüsü gösterilmektedir. Aydınlık görüntü hücreleri normal morfoloji korumalarını sağlamak için yardımcı olur. Ayrıca, bu tür MTS ya da benzer deneyler gibi hücre canlılığı deneyleri, nanoparçacık toksisite 7 değerlendirmek için de kullanılabilir. Akış sitometrisi, tarif edildiği gibi, transfeksiyon etkinliği ölçmek için kullanılabilir. HyperCyt çoklu-plaka ek kullanırken, veriler düzgün şekilde kuyu tanımlanması için uygun bir şekilde işlenmesi gerekir. Hücre sayısı (kuyu başına binlerce hücreleri) ile iyi, ve akışkanlar düzgün çalışıp zaman Şekil 2, sağ panel de görülebileceği gibi, her bir kuyu hem manuel ve yazılım tarafından ortaya çıkarmak için daha kolaydır. Hücre sayısı çok düşük veya akışkanlar ile ilgili bir sorun varsa Ancak, çok daha zor münferit tanımlamak için olurKitabında haznesi (Şekil 2'nin sol panel) ve deney muhtemel tekrarlanması gerekir. Hypercyt ve boru değiştirilmesi genellikle numune akışı ile sorunları çözebilirsiniz. Bireysel iyi veriler elde edildikten sonra, en yaygın akış sitometrisi yazılım ihraç etmiştir. FCS dosyaları analiz etmek için de kullanılabilir. Şekil 3'te, FlowJo tedavi edilmemiş kuyulara karşılaştırarak kapı pozitif olarak transfekte edilmiş hücrelerin için kullanılır.
Nanosight NTA ile ölçülen boyut olarak 200 nm - 100 arasında PBAE nanopartiküller genellikle. NTA yaparken, ekranda nanoparçacıkların sayısı 20 arasında olması önemlidir -. Yazılım doğru parçacıkların izlemek mümkün olacak, böylece 100 Şekil 5B, bir örneğini gösterir iken Şekil 5A, çok fazla parçacık bir örnektir Uygun bir sayı. Çekilen videoyu İşleme ekrandaki gözlenen parçacıkları softwar tarafından alınıyor böyle yapılmalı kırmızı çapraz kıllar ile temsil e. Daha iyi bir eşik düzeyinin bir örneği Şekil 5D görülürken partikülleri toplamak için eşik çok düşük olduğunda bir örneği, Şekil 5C de görülebilir. Örnek farklı bir seyreltme örnek doğru konsantrasyon aralığı içinde olduğundan emin olmak için gerçekleştirilebilir. Nanosight tarafından verilen yeni parçacık konsantrasyonu yeni seyreltme eşleşmesi gerekir. Parçacık boyut ve konsantrasyonu elde edildikten sonra, plazmid başına ortalama parçacık ve dağıtım hesaplanabilir. Örnek sonuçlar Şekil 6 da görülmektedir. Deneysel çizelgesi Şekil 7 'de gösterilmiştir.
| Wells / Tabak | Cilt / Kuyu (ul) | Hücreler / Kuyu |
| 96 | 100 | 2.500 5.000 |
| Wells / Tabak | Cilt / Kuyu (ul) | Peki Partikül Hacim / (ul) | DNA / Şey (mikrogram) | DNA (mikrogram / ul) | DNA 1 mikrogram / ul stok (ul) | NAAC (ul) |
| 96 | 100 | 20 | 0.6 | 0.06 | 3 | 47 |
Tablo 2. 96-plaka biçimi için tipik DNA seyreltme protokolü.
| Polimer: DNA (ağırlık / ağırlık) | Peki Partikül Hacim / (ul) | # Wells Çoğalt | DNA / Kuyu(Mikrogram) | Polimer / Şey (mikrogram) | Polimer / 10 mg / ul stok (ul) | NAAC (ul) |
| 20 | 20 | 4 | 0.6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0.6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0.6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0.6 | 60 | 30 | 20 |
Tablo 3. 96-plaka biçimi için tipik polimer seyreltme protokolü.
Şekil1. PBAE ile transfekte HRECs Tek renk kanalı floresan görüntüleme (Sol) GFP floresan, yeşil renkli,. (Orta) aydınlık görüntü; (Sağ) Kompozit görüntü.
Şekil 2. Toplanan verilerin ardından Hypercyt yazılımı iyi tanımlama adım (Sol) Sıvıların düşük sayar veya sorunu nedeniyle sorunlu verilerin Örnek;.. (Sağ) temiz veri örneği, kolayca tespit kuyuları ile büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. EGFP plazmid ile transfekte edilmiş hücreler için FlowJo gating (A) karşılık tedavi edilmeyen hücrelere FSC için SSC;. (B) için FL1 vs FL3 untreated hücreleri, (C, D) PBAE ile transfekte edilmiş hücreler için FL1 FL3 vs. Sahte renk yoğunluğu (C) ve (D) kontur araziler Hem kapıları çizmek için konumunu belirlemek için yararlıdır.
Şekil 4. Nanosight nanoparçacık izleme analiz yazılımı, sürüm 2.2 parçaları Screenshot (A) Sıvıların kontrol edilmesi;. (B) nanopartiküller video yakalamak için kullanılan Yakalama modu; önceden çekilen video açtıktan sonra kullanılabilir (C) İşleme modu. Protokolü ele Kırmızı kutuları vurgulamak fonksiyonları. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5,. . Örnek için video yakalama öncesi numune Nanosight video yakalama ve analiz Örnek Ekran (A) yeterince seyreltilir ve uygun seyreltme (B) olmadığını; parçacık algılama eşik analizi modunun Ekran (C) çok düşük olarak belirlenmiş ve gereken şekilde ayarlayın (D) ile uygun tüm partikülleri tespit kırmızı çapraz kıllar. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 6. Tabanlı nanopartiküller nanosight izleme analizi tekniği kullanılarak analiz Boyut dağılımı ve PBAE plazmid başına tanecik dağılımı verileri (B5S3E7, DNA ağırlık / ağırlık için 60:1 polimer). Küçük [14], 8, Bhise, NS, Shmueli, RB, Gonzalez 'den yeniden basılmıştır ,J., ve Yeşil, JJ Wiley-VCH izni ile polimer nanopartiküller, 367-373, Copyright 2012, tarafından kapsüllenmiş plazmidler sayısını hesaplamak için bir roman denemesi. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 7. Deneysel zaman çizelgesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki protokol nanoparçacık formülasyonların transfeksiyon etkinliği gibi parçacık boyutu ve nanoparçacıkların DNA yükleme karakterize etmek için bir yöntem değerlendirme yöntemleri açıklanmaktadır. Parçacık başına plazmit sayısı parçacık etkisini tahmin yardımcı olabilir önemli bir parametre olan ve aynı zamanda doz tayini için kullanılabilir. Nanopartikül izleme analizi, tuz konsantrasyonunun farklı olanlar gibi çeşitli sulu çözeltiler, bir dizi içinde gerçekleştirilebilir. Genellikle bu tanımlama fizyolojik tuzlu taklit etmek için, PBS içinde gerçekleştirilir. PBS içinde boyutlandırma medya ya da fizyolojik tuzlu su içinde nanoparçacıkların boyut iyi bir tahmin vermek mümkün olmakla birlikte, serum miktannda nanoparçacıkların 17 boyutu ve kararlılık etkileyebilir. Bu nedenle, serum çeşitli konsantrasyonlarda parçacık karakterizasyonu de bazı uygulamalar için önemli olabilir. Serum, bir additio içinde parçacıkların karakterize etmek içinNal adım serum proteinleri yüksek arka plan yayıldığı için tavsiye edilir. Bu durumda, parçacıklar floresan floresan filtre kullanımı yoluyla, parçacıklar, özellikle serum proteinleri olarak belirgin biçimde takip edilebilir, böylece etiketli gerekir.
Plazmid başına partikül miktarının diğer polimerik veya inorganik partikül sistemleri gibi farklı nanoparçacık formülasyonları ile kullanılabilecek kadar geneldir. Farklı malzemeler, görüntü yakalama ve işlem parametrelerinin ışık saçılımı davranışından dolayı modifiye edilmesi gerekebilir. Ayrıca, NTA duyarlılığı malzemeye bağlı olarak değişebilir. Yukarıda tanımlanan plazmid başına parçacık protokol nanopartikülleri tanımlamak için hızlı ve kullanışlı bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması rapor.
Acknowledgments
Yazarlar destek için TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) ve NIH R21CA152473 ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
