Summary
nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.
Abstract
고분자 나노 입자를 사용하여 비 바이러스 성 유전자 전달은 유전 질환 1을 치료하는 유전자 치료에 대한 매력적인 접근 방식으로서 재생 의료 2 기술로 등장했다. 중요한 안전 문제가 바이러스, 달리, 고분자 나노 입자는 더 큰 핵산화물과 생분해 성 및 / 또는 환경 대응을 들고 할 수있는, 화학적으로 다양한, 합성 무독성, 비 immunogenic, 비 mutagenic, 쉽게 할 수 있도록 설계 할 수 있습니다. 양이온 폴리머는 일반적으로 고분자 나노 입자를 칭했다 아르 100 나노 미터의 순서에 복합체를 형성하기 위해 정전기 상호 작용을 통해 부정적인 요금이 부과 DNA와 자기 조립. nanoscale polycationic 유전자 전달 나노 입자를 형성하는 데 사용 biomaterials의 예로는 비 degradable 재고품입니다 polylysine, polyphosphoesters, 폴리 (amidoamines) s와 polyethylenimine (PEI)를 포함 일반적으로 핵산 전달 1,3에 사용되는 양이온 폴리머. 폴리 (베타 - 아미노에스테르) S (PBAEs)는 5,6 hydrolytically degradable이며, 인간의 망막 내피 세포 (HRECs) 7과 같은 어려운 transfect 세포 유형에 대한 유전자 전달에 효율적으로 표시되어 양이온 폴리머 4의 최신 수업 마우스 유방 상피 세포 8, 인간의 뇌 암 세포 9 및 10 macrovascular (인간 배꼽 정맥, HUVECs) 내피 세포.
nanoparticle 추적 분석 (NTA)를 활용 한 고분자 나노 입자를 특성화 할 수있는 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법에서 입자 크기 분포와 입자 당 plasmids의 수 분포 모두 11 얻을 수 있습니다. 또한, 고분자 나노 입자의 transfection 효율의 급속한 진단을위한 높은 처리량 96 - 웰 플레이트 transfection 분석이 제공됩니다. 이 프로토콜에서는 폴리 (베타 - 아미노 에스테르) S (PBAEs)이 모델 고분자와 인간 망막 내피 세포 (HRECs)로 사용되는은 MO로 사용됩니다델 인간의 세포. 이 프로토콜은 쉽게 고분자 nanoparticle 및 멀티뿐만 판 형식에 대한 관심의 세포 유형을 평가하도록 구성 할 수 있습니다.
Introduction
nanoparticle 당 complexed plasmids의 수의 결정은 특히 동일한 셀 대상에 대해 여러 plasmids의 공동 제공을위한 효과적인 nanoparticle 기반의 유전자 전달 전략을 설계,하는 것이 중요합니다, 등은 종종 연구 12 재 프로그래밍 줄기 세포에 필요합니다. 하나의 nanoparticle과 관련된 plasmids의 수를 계산하는 몇 가지 방법이 설명, 각 접근 방식은 추정 13-16에 사용되는 기술의 단점을 가지고있다되었습니다. TEM과 결합 양자 점 (QD) 라벨은 키토산 기반의 나노 입자에 입자 당 plasmids를 추정하는 데 사용되었습니다. 캡슐화 라벨이없는 DNA가 직접 감지되지 않는 가능성; 잠재적으로 중복 plasmids과 입자의 2D TEM 이미지에서 QDs,이 QD 기술을 추정 인해 그 자체 조립 속성을 변경할 수있는 DNA를 레이블 할 필요에 복잡하고 다른 단순화 가정 13. 이 대안 접근 방식pplicable 주문 microdomains의 입자에 존재하면 cryo - 전송 전자 현미경 (cryo-TEM), X-선 산란, 및 동적 광 분산 (DL을) 14,15을 통해 Lipopolyamine-DNA 단지를 연구하는 데 사용되었습니다. 불행하게도, 이러한 여기 조사 고분자 나노 입자 등의 자료는이 방법으로 적용되지 않습니다. . 그러나, 그들의 방법은 큰, 마이크론 크기의 입자 16 평가할 수 있습니다, 또 다른 연구에서, 콜린스 외 공부하는 흐름 입자 이미지 분석 기술 (LYS) 16 - 포함 펩타이드 / DNA 복합체를 사용했습니다. 따라서, 우리는 최근에 nanoparticle 11 당 plasmids의 수를 수량화 할 수있는 소설하고 유연한 분석을 개발했습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 셀 심는
- 세포가 overconfluency로 성장하는 것을 허용하지 않습니다. 기본 셀을 transfecting 때 초기 통로 세포를 사용합니다.
- transfection하기 전에 24 시간 정도, 세포를 trypsinize hemocytometer를 사용하여 세포 수를 계산하고, 원하는 세포 밀도 (세포 / 볼륨)를 달성하기위한 매체와 세포 현탁액을 희석. 명확한 조직에 종자 세포는 저수지와 다중 채널 피펫을 사용하여 평면 바닥 96 - 웰 플레이트 문화 취급. 선택한 밀도는 transfection 당일 confluency 70~80%를 제공해야합니다. 표 1에 표시로 예를 들어, 셀은 여기에 표시 transfection 데이터를 25-50 셀 / μl로 희석되었다.
2. 세포 Transfection
- 폴리머와 DNA 주식의 희석. 실온 (RT)에서 폴리머와 DNA 주식 솔루션을 해동. 12 채널 피펫을 사용하여 명확 96 - 웰 플레이트에서 별도로 폴리머 주식 솔루션과 DNA 주식 솔루션을 희석, DNA 중량 비율 (중량 / 중량)에 원하는 폴리머 무게를 얻기 위해 필요한 농도에 해당 용매를 갖추고 있습니다. 이 경우, 선택된 용매는 25 MM 나트륨 아세테이트 버퍼 (산도 = 5.2)입니다.
- DNA 희석. 일반적으로, 1 MG / ML에 저장된 DNA가 아닌 조직 문화 취급 분명 96 - 웰 플레이트 (단일 제제에 대한 잘 하나)의 0.03-0.06 MG / ML의 농도에 나트륨 아세테이트 버퍼에 희석되어 있습니다. 표 2 쇼 1 단계의 세포를 놓는 96 - 웰 플레이트에 모두 복제 우물을 transfect하는 데 사용되는 단일 제제에 대한 일반적인 DNA 희석 프로토콜.
- 폴리머 희석. 100 MG / ML 폴리머 / DMSO 솔루션은 DNA 중량 / 중량 비율로 원하는 폴리머를 얻기 위해 필요한 농도에 따라 아세트산 나트륨 버퍼에 희석되어 있습니다. 일반적으로 폴리 (베타 - 아미노 에스테르) S (PBAEs)와 유전자 전달에 사용되는 중량 / 중량 비율의 범위은 20 100입니다. PBAE의 폴리머 먼저 희석 P에 이어, 10 MG / ML에 희석 아르rotocol는 표 3에 표시. 폴리머 dilutions는 DNA 희석 판의 샘플 방향을 일치하지 않는 조직 문화 취급 분명 96 - 웰 플레이트에서 수행 할 수 있습니다.
- Nanoparticle 형성. 12 채널 피펫을 사용하여 플라스미드 DNA 솔루션의 동일한 볼륨에 PBAE 솔루션을 추가하고 힘차게 섞는다. 자기 조립을 허용하는 10 분 동안 RT에서 혼합 배양합시다.
- Nanoparticle의 transfection. 자기 조립 후, 20 μl 나노 입자는 12 채널 피펫을 사용하여 문화 매체 dropwise에 따라 잘 추가됩니다. 복제 우물이 치료 남아 있습니다 또는 컨트롤과 같은 상업적으로 이용 가능한 시약으로 transfected 수 있습니다. transfected 세포는 37 incubated 아르 ° 2-4시간 한 다음 우물에 대한 C는 신선한 미디어 (100 μl / 잘)로 대체됩니다. 부화 시간의 선택은 세포 라인, 문화 조건 및 transfection 시스템에 따라 달라집니다. transfection의 차이잠복기가 변화의 결과로 효율성과 세포 독성은 3 단계에 설명 된 분석 프로토콜에 의해 정량화 될 것입니다.
3. Transfection의 효율성 세포 독성 분석
Transfection 효율은 형광 현미경으로 시각적 분석과 흐름 cytometer 사십팔시간 후 transfection을 사용하여 정량하고 있습니다. 세포 독성은 형광 현미경으로 시각적으로 분석 CellTiter 96 수성 한 검정 이십사시간 후 transfection을 사용하여 정량하고 있습니다.
- 형광 현미경. 시각적으로 적절한 형광 채널을 사용하여 transfected 리포터 유전자 (예를 들어, EGFP 또는 DsRed)의 표현을위한 우물을 분석 할 수 있습니다. 적절하게 특정 공법 (그림 1)의 transfection 효율을 나타내는 뷰의 필드를 선택, 각도에 대한 이미지를 취득. 시각적으로 관찰하는 세포 독성을 적어 둡니다.
- 유동 세포 계측법.
- 유동 세포 계측법의 96 - 웰 플레이트를 준비하는 다중 채널 피펫을 사용합니다. PBS로 씻어, μl / 잘 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 30, 가장자리 등의 각 우물에, 170 μl FACS 버퍼 (PBS + 2% FBS)와 피펫을 중화 아래로 trypsinize, 그리고 전체 200 μl 볼륨을 전송 둥근 바닥이나 V-하단에 96도 판에 해당 우물에 각도.
- 4에서 5 분 130 XG에서 판을 원심 분리기 ° C.
- 거품을 피하면서 각 resuspend을 잘하고 피펫 세포로부터 170 μl 미디어를 제거합니다. 각도에; 가능성이 propidium의 요오드화물 (PI) 같은 얼룩을 사용하려면, FACS 버퍼 + PI (PI 주식 농도 1 MG / ML PI 희석 50:1 FACS 버퍼) 10 μl를 추가합니다. 즉시 얼음에 넣고 빛으로부터 다룹니다.
- C6 Accuri 흐름 cytometer, 96 - 웰 첨부 파일 HyperCyt하고 HyperView 소프트웨어를 시작합니다. 적절한 P를 선택합니다 HyperView 디자인 및 프로토콜 탭을 사용하여후반 유형, 판 레이아웃, 그리고 셰이크 / 한모금과 같은 다른 설정은 / 린스 / 시간을 잡아 봐요. 위의 프로토콜은 다음 매개 변수는 한 분, 2,400 rpm에서 30 초 동안 미리 판 흔들림에 대해 미리 판 프라임을 사용했다. 십 시간이 15 rpm으로 15 초에 설정 한 탐사선이 2 초에 잘 때마다 씻어, 그리고는 간뿐만 2,400 rpm으로 12 초 동안 매 12 우물을 흔들. 간 잘 흔들림은 세포가 우물 그룹 사이의 시간이 초과되었습니다 나누기를 (이 경우 12 초)을 포함하여 데이터를 처리 할 수있는 능력 향상을 위해뿐만 아니라, 미디어에 분산 보관하는 것이 중요합니다.
- 적절한 아니라 (그림 2)에 데이터를 별도의를 처리 할 HyperView 잘 확인 탭을 사용하십시오. 개인 우물을 식별하기 위해, 그것은 소프트웨어의 노이즈 필터뿐만 아니라 고급 설정에서도 필터 기준을 포함하여 사용하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 다른 팝업을 구분하기 위해 적절한 게이팅에 의해 긍정적으로 transfected 라이브 세포의 비율을 수량화ulations (그림 3). 첫 번째 파편 (그림 3A)에서 별도의 셀에 위해 FSC 대 SSC 분산 형 플롯에 흐름 데이터를 볼 수 있습니다. propidium의 요오드화물 (PI)가 사용 된 경우, 게이트 개별 세포 인구 전망이 FSC 대 FL3 플롯에 대한 데이터 죽은 세포 및 게이트 라이브 세포에서 라이브 세포를 분리하는 순서를 유지해야합니다. transfected 세포의 수를 수량화하기 위해, 해당 채널에서 라이브 셀 인구를 보려면 예를 들어, GFP는 FL1에서 볼 수 있습니다. 문은 배경 신호 (그림 3B)을 식별하기 위해 치료 인구를 치료 세포 사용합니다. 긍정적 transfected 세포는 다음이 게이트를 사용하여 분리 분산 및 윤곽 플롯 (그림 3C 및 3D)을 모두 사용하여 transfected 인구를 보면. 할 수 있습니다 다른 세포가 형광의 다른 도로 transfected 될 것 같은 긍정적 transfected 세포의 연속이있을 수 있습니다.
- CellTiter 96 수성 한 분석
- 세포 독성 측정이 정확히 같은 방식으로 다른 판을 Transfect.
- 10 ML 신선한 매체와 CellTiter 96 수성 한 분석 솔루션의 Premix 1 ML. 세포에서 미디어를 제거하고 premixed 솔루션의 110 μl + 잘 당 미디어를 추가 할 채널 피펫을 사용합니다.
- 치료 상태와 잘의 흡광도는 분석의 선형 범위에서 될 때까지 490 nm의 1에서 4 시간까지 1 시간 간격으로 흡광도를 측정합니다. 배경 흡광도 읽기에 대해서만 솔루션 + 미디어 4 개의 제어 우물을 포함합니다.
- 평균 흡광도 조건에 따라 네 개의 복제 우물의 값을 각각 평균에서 평균 배경 흡광도를 뺍니다. %의 세포 생존 능력을 결정하는 치료 조건의 수정 평균 각 처리 조건에 대한 수정 평균을 정상화.
- 약 1/5th의 최대 속도와 최대 속도 약 1/10th에서 뒤로 샘플 펌프에서 앞으로 희석제 펌프를 실행하여 Nanosight의 NS500의 주요 fluidics 시스템입니다. fluidics 시스템이 희석제로 플러시 될 때까지 계속합니다.
- 분석 할 수있는 나노 입자를 준비합니다. PBAEs의 경우, 별도로 주식 플라스미드 DNA (1 MG / ML)와 Eppendorf 튜브에 아세트산 나트륨 버퍼의 주식 PBAE를 (100 MG / ML) (25 MM, 산도 5) 희석.
- 0.06 MG / ML에 플라스미드 DNA 농도를 희석. 폴리머 농도가 DNA에 폴리머의 필요한 무게 중량 비율에 따라 달라질 수 (60 중량 / 중량 입자에 대한 예를 들어, 폴리머는 3.6 MG / ML에 희석합니다.)
- 플라스미드 DNA 솔루션의 동일한 볼륨에 폴리머 솔루션을 추가하고 힘차게 섞는다. 자기 조립을 허용하도록 10 분 동안 실온에서 혼합을 품다.
- 디류트 nanoparticle 농도 위해서는 100 배 PBS로 nanoparticle 솔루션은 NTA에 해당하는 범위에하고 적어도 500 μl의 최종 볼륨을 얻을 수 있습니다.
- 샘플 Eppendorf 튜브 (그림 4A)에로드 관을 배치하여 Nanosight에 샘플을로드합니다. 공기 거품을 소개하지 있는지 확인하십시오.
- 입자을 볼 수있을 때까지 캡처 모드에서 카메라 수준을 향상시킬 수 있습니다. 입자 (그림 4A 및 4B) 부드러운 볼 수 있도록 초점을 조정합니다.
- 일반 모드에서 모든 입자가 화면에 볼 수 있다는 점을 통과 카메라 수준을 조정합니다. 그런 다음 입자가 모든 여전히 관찰 할 수 있도록 가장 낮은 수준에 카메라 수준을 낮출 수 있습니다. 중간 카메라 수준이 필요한 경우, 고급 모드로 가서 카메라 셔터를 수정하고 적절한 수준으로 파악할 수 있습니다.
- 시각 20 사이에있을 것 확인 - s의 100 입자를creen. nanoparticle 추적을위한 이상적인 숫자는 약 50 입자입니다. 너무 많은 또는 너무 적은 경우, NS500를 플러시 PBS로 희석을 조정하고, 샘플을 다시로드합니다.
- 표준 모드 표에 따라 촬영 시간을 조정합니다. 일반적으로 30-60 초는 적절한 캡처 길이 (그림 4B)입니다.
- 다음 샘플을로드하려면 다시로드하여 새 샘플 다음, 시스템을 플러시.
- 일단 동영상을 캡처, 비디오 파일을 열어 처리 단계로 진행합니다.
- 가장 (그림 4C) 비디오를 처리하기 위해 조정 할 수 있습니다 매개 변수의 숫자가 있습니다. 목표는 최선의 각 입자 (그림 5)를 통해 화면에 적십자 마크가 표시된 화면에서 각 입자를 캡처하는 매개 변수를 선택하는 것입니다.
- 더 나은 입자를 보려면 화면 이득을 향상시킬 수 있습니다. 표준 또는 고급 모드에서 자동으로 clickin하여 매개 변수에 대한 조정을 선택g 해당 상자. 자동 설정이 적절하게 입자를 선택하지 않습니다 경우, unclick 상자 수동으로 매개 변수를 (그림 4C)을 설정합니다.
- 일단 모든 입자가 화면에 선택됩니다, 비디오 파일 (그림 4C)를 처리하는 소프트웨어의 프로세스 버튼을 클릭합니다. 이것은 입자 크기 분포, 크기의 평균뿐만 아니라, 입자 농도를 제공합니다.
- 입자 농도가 정확 특정하기 위해서, 배에 희석을 증가하여 PBS 희석 같은 변경하고, 위의 절차를 반복합니다. 동일한 샘플의 여러 dilutions을 측정하는 것은 샘플의 농도 측정이 정확한지 확인하는 것이 좋습니다. 측정을위한 좋은 범위는 10 7 -10 9 입자 / ML입니다.
- 모든 plasmids은 나노 입자의 젤 전기 영동을 실행하고 무료로 DNA가 존재 여부를 평가함으로써 나노 입자에 포함되어 있는지 확인합니다.모든 plasmids를 캡슐화하는 경우, 총 캡슐화 plasmids을 수량화하기 위해 DNA의 흡광도를 측정하는 표준 기술을 사용합니다.
- 입자 당 plasmids의 평균 수를 계산하려면 NTA 측정 입자 농도에 의한 총 캡슐화 플라스미드 농도를 나눕니다. 플라스미드 당 입자 샘플 분포를 추정하기 위해, 먼저 입자의 각 1 나노 미터 빈의 볼륨 분율을 계산하는 NTA 입자 크기 히스토그램을 사용합니다. 각 병원에 plasmids의 수를 얻기 위해 전체 플라스미드 금액하여이 볼륨 분율 분포를 곱합니다. 각 입자 크기 (그림 6)에 대한 plasmids 당 입자의 수를 얻기 위해 각 빈에있는 입자의 수가이 숫자를 나눕니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 1은 플라스미드 EGFP와 HRECs를 성공적으로 transfection의 예를 형광 현미경 이미지를 보여줍니다. brightfield 이미지는 세포가 자신의 일반적인 형태를 유지하도록 도움이됩니다. 또한, 이러한 MTS 또는 이와 유사한 assays 같은 세포 생존 능력의 assays은, nanoparticle 독성 7 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은 설명 된대로, transfection 효율을 수량화하는 데 사용할 수 있습니다. HyperCyt 멀티 잘 플레이트 첨부 파일을 사용하는 경우, 데이터가 제대로 우물을 식별하기 위해 적절하게 처리해야합니다. 셀 카운트가 (물론 당 세포의 수천) 좋은, 그리고 fluidics가 제대로 작동하는 경우 그림 2의 오른쪽 패널에서 볼 수 있듯이, 각각의 우물은 모두 수동 및 소프트웨어에 의해 선택하기 쉬워졌습니다. 셀 카운트가 너무 낮은 또는 fluidics에 문제가있을 경우에는, 그것은 훨씬 더 어려운 individ을 식별 할 수있게, 무슨 일 우물 (그림 2의 왼쪽 패널) 및 실험 가능성 반복해야합니다. Hypercyt의 튜브를 교체하는 것은 종종 샘플 흐름 문제를 해결할 수 있습니다. 개인도 데이터가 취득되면, 가장 일반적인 유동 세포 계측법 소프트웨어는 수출. FCS 파일을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 3에서 FlowJo은 치료 우물에 비교하여 게이트 긍정적 transfected 세포에 사용됩니다.
Nanosight NTA에 의해 측정으로 사이즈 200 nm의 - PBAE 나노 입자는 100 사이에 일반적입니다. NTA를 수행하면 화면에 나노 입자의 수가 20 사이에 있어야하는 것이 중요합니다 -. 소프트웨어가 정확하게 입자를 추적 할 수 있도록 100도 5B는의 예를 보여줍니다 동안도 5A는 너무 많은 입자의 예입니다 적절한 번호입니다. 캡처 된 비디오 처리하면 화면 관찰 된 입자가 softwar에 의해 포착되는 등 수행해야 빨간색 십자선을 표시 전자. 더 나은 임계 값 레벨의 예는 그림 5D에 표시되는 동안 입자를 감지에 대한 임계 값이 너무 낮 때의 예는 그림 5C에 볼 수 있습니다. 샘플의 다른 희석이 예제는 올바른 농도 범위에 있는지 확인하기 위해 수행 할 수 있습니다. Nanosight에 의해 주어진 새로운 입자 농도는 새로운 희석과 일치해야합니다. 크기와 입자 농도를 얻을되면 플라스미드 당 입자의 평균과 분포가 계산 될 수있다. 예를 들어 결과는 그림 6에서 볼 수 있습니다. 실험 타임 라인은 그림 7에 표시됩니다.
| 웰스 / 판 | 볼륨 / 음 (μl) | 셀 / 음 |
| 96 | 100 | 2500 5,000 |
| 웰스 / 판 | 볼륨 / 음 (μl) | 잘 입자 볼륨 / (μl) | DNA / 그럼 (μg) | DNA (μg / μl) | DNA 1 μg / μl 주식 (μl) | NaAc (μl) |
| 96 | 100 | 20 | 0.6 | 0.06 | 3 | 47 |
표 2. 96 - 웰 플레이트 형식에 대한 일반적인 DNA 희석 프로토콜.
| 폴리머 : DNA (중량 / 중량) | 잘 입자 볼륨 / (μl) | # 웰스를 복제 | DNA / 음(μg) | 고분자 / 그럼 (μg) | 고분자 / 10 μg / μl 주식 (μl) | NaAc (μl) |
| 20 | 20 | 4 | 0.6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0.6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0.6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0.6 | 60 | 30 | 20 |
표 3. 96 - 웰 플레이트 형식에 대한 일반적인 폴리머 희석 프로토콜.
그림1. PBAE와 transfected HRECs의 단일 색상 채널 형광 이미징 (왼쪽) GFP 형광, 색이 녹색,. (중앙) Brightfield 이미지 (오른쪽) 복합 이미지입니다.
그림 2. 데이터를 수집 한 후 Hypercyt 소프트웨어도 식별 단계 (왼쪽) fluidics로 낮은 수치이나 문제로 인해 문제가 데이터의 예,.. (오른쪽) 깨끗한 데이터의 예를 들어, 쉽게 식별 우물과는 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 플라스미드 EGFP와 transfected 세포에 대한 FlowJo의 게이팅 (A) FSC 대 치료 세포에 대한 SSC,. (B)의 FL1 대 FL3 Untreated 세포 (C, D) PBAE와 transfected 세포에 대한 FL1 대 FL3. 의사 색 밀도 (C)와 (D) 등고선 플롯 모두 문을 그릴 수있는 위치를 확인하는 데 유용합니다.
4 그림. Nanosight nanoparticle 추적 분석 소프트웨어, 버전 2.2의 일부의 스크린 샷 (A) fluidics 제어,. (B) 나노 입자의 비디오를 캡처하는 데 사용 캡처 모드, 이전에 캡처 된 비디오를 열고 후 사용할 수 (C) 처리 모드. 프로토콜에서 논의 레드 상자의 하이라이트 기능. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. . 샘플에 대한 비디오 캡처하기 전에 샘플의 Nanosight 비디오 캡처 및 분석의 예는 스크린 샷 (A) 정도로 희석하고, 적절한 희석 (B)가되지 않는, 입자 감지 임계 값과 분석 모드의 화면 캡처 (C) 너무 낮게 설정하고 적절하게 설정 (D)로 적절하게 모든 입자를 식별 빨간색 십자선이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
6 그림. 기반의 나노 입자가 nanosight 추적 분석 기술을 사용하여 분석 크기 분포와 PBAE의 플라스미드 당 입자 분포 데이터 (B5S3E7, DNA 중량 / 중량으로 60:1 폴리머)가. 작은 [14], 8, Bhise, NS, Shmueli, RB, 얼른에서 재 인쇄 ,J., 그리고 그린, JJ 와일리 - VCH의 허가와 폴리머 나노 입자, 367-373, 저작권 2012 년에서 캡슐화 plasmids의 수를 정량화에 대한 새로운 분석이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 7. 실험 타임 라인.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
위의 프로토콜 nanoparticle 공법의 transfection 효율뿐만 아니라 입자 크기와 나노 입자의 DNA 로딩을 특성화 할 수있는 방법을 평가하는 방법을 설명합니다. 입자 당 plasmids의 수는 입자의 효과를 예측 할 수 있습니다 중요한 매개 변수이며, 또한 용량 결정에 사용할 수 있습니다. Nanoparticle 추적 분석 등 소금 농도에 차이가있는 등 다양한 수성 솔루션의 범위에서 수행 할 수 있습니다. 종종이 특성은 생리 식염수을 모방하기 위해 PBS에 수행됩니다. PBS에서 크기 조정하는 미디어 또는 생리 식염수에있는 나노 입자의 크기의 좋은 견적을 줄 수 있지만, 혈청 현재의 양이 나노 입자 17의 크기와 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 혈청의 다양한 농도의 입자 특성도 특정 응용 프로그램에 중요 할 수 있습니다. 혈청, additio에서 입자를 특성화하기 위하여NAL 단계는 혈청 단백질의 높은 배경 산란으로 인해 권장합니다. 이 경우 입자 휘황 형광 필터의 사용을 통해, 입자가 구체적으로 혈청 단백질의 독특한 추적 할 수 있도록 태그를해야합니다.
플라스미드 당 입자 정량화은 다른 고분자 또는 무기 미립자 시스템 등 다양한 nanoparticle 공법과 함께 사용 될만큼 일반적입니다. 다른 자료, 비디오 캡처 및 처리 매개 변수의 서로 다른 빛의 분산 동작으로 인해 수정해야 할 수 있습니다. 또한, NTA의 감도는 소재에 따라 변경 될 수 있습니다. 위에서 설명한 플라스미드 당 입자 프로토콜은 나노 입자를 특성화를위한 신속하고 유용한 방법입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 관심의 충돌을보고하지 않습니다.
Acknowledgments
저자 지원 TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE - 0098-00)와 NIH R21CA152473 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
