Summary
Ett protokoll för nanopartiklar spårning analys (NTA) och hög genomströmning flödescytometri för att utvärdera polymera nanopartiklar gentillförsel beskrivs. NTA används för att karakterisera nanopartiklar partikelstorleksfördelningen och plasmiden per partikelfördelningen. Hög genomströmning flödescytometri möjliggör kvantitativ utvärdering transfektion effektivitet för ett bibliotek av biomaterial gentillförsel.
Abstract
Icke-viral gen leverans med polymera nanopartiklar har blivit en attraktiv metod för genterapi för att behandla genetiska sjukdomar 1 och som en teknik för regenerativ medicin 2. Till skillnad från virus, som har betydande säkerhetsfrågor, kan polymera nanopartiklar utformas för att vara icke-toxiska, icke-immunogena, icke-mutagena, lättare att syntetisera, kemiskt mångsidig, kan bära större nukleinsyra last och biologiskt nedbrytbart och / eller miljömässigt mottaglig. Katjoniska polymerer själv montera med negativt laddad DNA via elektrostatisk växelverkan att bilda komplex av storleksordningen 100 nm, som vanligen benämns polymera nanopartiklar. Exempel på biomaterial som används för att bilda nanonivå polykatjoniska nanopartiklar gentillförsel inkluderar polylysin, polyphosphoesters, poly (amidoaminer) s och polyetylenimin (PEI), som är en icke-nedbrytbar off-the-shelf katjoniska polymeren som vanligen används för nukleinsyra leverans 1,3. Poly (beta-amino-ester) s (PBAEs) är en nyare klass av katjoniska polymerer 4 som är hydrolytiskt nedbrytbara 5,6 och har visat sig vara effektiva vid genleverans till svåra att transfektera celltyper såsom humana retinala endotelceller (HRECs) 7, mus mammära epitelceller 8, mänskliga hjärnan cancerceller 9 och makrovaskulära (mänsklig navelven, HUVEC) endotelceller 10.
Ett nytt protokoll för att karakterisera polymera nanopartiklar använder nanopartiklar spårning analys (NTA) beskrivs. I detta tillvägagångssätt, är både partikelstorleksfördelningen och fördelningen av antalet plasmider per partikel erhållen 11. Dessutom är en hög genomströmning 96-brunnars platta transfektionsanalysen för snabb screening av transfektion effekten av polymera nanopartiklar presenteras. I detta protokoll är poly (beta-aminoester) s (PBAEs) som används som modell polymerer och mänskliga retinala endotelceller (HRECs) används som model humana celler. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att utvärdera eventuella polymera nanopartiklar och vilken celltyp som helst av intresse i en platta med flera brunnar formatet.
Introduction
Fastställandet av antalet plasmider komplexbundna per nanopartiklar är viktigt att utforma effektiva nanopartiklar baserade strategier gentillförsel, särskilt för samarbete leverans av flera plasmider i samma cell mål, ofta krävs i stamceller omprogrammering studier 12. Få metoder för att beräkna antalet plasmider som är förknippade med en enda nanopartikel har beskrivits, och varje metod har nackdelar i de tekniker som används för skattning 13-16. Quantum dot (QD) märkning i kombination med TEM har använts för att uppskatta plasmider per partikel i kitosan-baserade nanopartiklar. Skattning med denna QD teknik är komplicerat på grund av behovet att märka DNA, som kan förändra sina självorganisering egenskaper, möjligheten att inkapslade omärkt DNA inte direkt detekteras; potentiellt överlappande plasmider och QDs i 2D TEM-bilder av partiklar, och andra förenklande antaganden 13. Ett alternativt tillvägagångssätt som är enpplicable när beställda mikroområden finns i partiklarna har använts för att studera lipopolyamin-DNA-komplex via kryo-transmissionselektronmikroskopi (kryo-TEM), X-ray scattering, och dynamisk ljusspridning (DLS) 14,15. Tyvärr, material såsom de polymera nanopartiklar undersökta här är inte tillämpliga med denna metod. I en annan studie använde Collins et al ett flöde partikel teknik bildanalys för att studera (Lys) 16-innehållande peptid / DNA-komplex,. Kan dock deras metod endast utvärdera större, mikrometerstorlek partiklar 16. Därför utvecklade vi nyligen en ny och flexibel analys för att kvantifiera antalet plasmider per nanopartiklar 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellsådd
- Låt inte cellerna att växa till overconfluency. Använd tidig passage celler när transfektering primära celler.
- Tjugofyra timmar före transfektion, Trypsinisera cellerna, räkna cellerna med användning av en hemocytometer, och späd cellsuspensionen med media för att uppnå den önskade celltätheten (celler / volym). Seed celler in tydlig vävnadskultur-behandlade flatbottnade 96-brunnars plattor med användning av en reservoar och pipetter flerkanaliga. Den valda densiteten bör ge 70-80% konfluens på dagen för transfektion. Till exempel, såsom visas i tabell 1, cellerna späddes till 25 till 50 celler / | il för transfektionen data som visas här.
2. Cell Transfektion
- Utspädning av polymer och lager DNA. Tina polymer och DNA stamlösningar vid rumstemperatur (RT). Utspädd polymer-stamlösning och DNA-stamlösning, separat i klara 96-brunnars plattor med användning av en tolv-kanals pipett, Med lämpligt lösningsmedel till koncentrationer som krävs för att erhålla den önskade polymervikten till förhållanden DNA vikt (vikt / vikt). I detta fall är det valda lösningsmedlet 25 mM natriumacetatbuffert (pH = 5,2).
- DNA-utspädning. Typiskt är DNA lagras vid 1 mg / ml utspädd i natriumacetatbuffert till en koncentration av 0,03 till 0,06 mg / ml i en klar icke-vävnadskultur-behandlade 96-brunnars platta (en brunn för en enda formulering). Tabell 2 visar den typiska DNA-utspädning protokoll för en enda formulering som används för att transfektera fyra replikatbrunnar i en 96-brunnars platta ympas med celler från steg 1.
- Polymer spädning. 100 mg / ml polymer / DMSO-lösning späds i natriumacetatbuffert enligt den koncentration som krävs för att erhålla den önskade polymeren till DNA vikt / vikt-förhållande. Intervallet för vikt / vikt-förhållanden som typiskt används för gentillförsel med poly (beta-aminoester) s (PBAEs) är 20 till 100. PBAE polymerer först späds till 10 mg / ml, följt av utspädning protocol såsom visas i tabell 3. De polymera spädningar kan utföras på ett tydligt icke-vävnadskultur-behandlade 96-brunnars platta som matchar provet orienteringen av DNA utspädning plattan.
- Nanopartiklar bildas. Tillsätt PBAE lösningen till en lika volym av plasmid-DNA med användning av en tolv-kanals pipett och blanda kraftigt. Låt blandningen inkubera vid RT under 10 minuter för att tillåta självorganisering.
- Nanopartiklar transfektion. Efter självorganisering, är 20 pl nanopartiklar tillsattes per brunn till odlingsmediet droppvis med tolv-kanalen pipett. Replikatbrunnar lämnas obehandlade eller transfekteras med kommersiellt tillgängliga reagens som kontroller. De transfekterade cellerna inkuberas vid 37 ° C under två till fyra timmar och därefter brunnarna ersattes med färskt medium (100 | il / brunn). Valet av inkubationstiden beror på cellinjen, odlingsbetingelser, och transfektion systemet. Skillnaden i transfektioneffektivitet och celltoxicitet som ett resultat av varierande inkubationstid kommer att kvantifieras av analysen protokoll som beskrivs i steg 3.
3. Analys av transfektionseffektivitet och celltoxicitet
Transfektionseffektivitet analyseras visuellt med ett fluorescensmikroskop och kvantifieras med användning av en flödescytometer 48 timmar efter transfektion. Celltoxicitet analyseras visuellt med ett fluorescensmikroskop och kvantifieras med användning av CellTiter 96 vattenhaltiga En analys 24 timmar efter transfektion.
- Fluorescensmikroskopi. Visuellt analysera brunnarna för expression av den transfekterade reportergenen (t ex, EGFP eller DsRed) med användning av lämpliga fluorescens kanalen. Förvärva bilder för varje brunn, välja synfält som lämpligt representerar transfektionseffektiviteten för de särskilda formuleringar (figur 1). Anteckna varje cell toxicitet observerades visuellt.
- Flödescytometri.
- Använd flerkanaliga pipetter för att framställa 96-brunnsplatta för flödescytometri. Tvätta med PBS, Trypsinisera med 30 ^ / brunn av trypsin / EDTA, neutralisera med 170 ul FACS buffert (PBS + 2% FBS), pipett upp och ner i varje brunn, även runt kanterna, och överföra hela 200-xl volym varje brunn i motsvarande brunnar i en rundbottnad eller V-botten 96-brunnars platta.
- Centrifugera plattan vid 130 x g under 5 min vid 4 ° C.
- Avlägsna 170 pl medium från varje brunn och pipetten att återsuspendera celler och samtidigt undvika bubblor. Om du vill använda en livskraft fläck som propidiumjodid (PI), tillsätt 10 ul FACS buffert + PI (50:1 FACS buffert: PI utspädning, PI lager koncentration 1 mg / ml) till varje brunn. Placera omedelbart på is och täcker från ljus.
- Starta C6 Accuri flödescytometern är HyperCyt 96-håls fastsättning och HyperView programvara. Använd HyperView Design och flikarna Protokoll att välja lämplig psen typ, tallrik layout och andra inställningar som t.ex. skaka / SIP / skölj / skaka tid. För ovanstående protokoll, användes följande parametrar användes, en pre-platta prime under en minut, och en pre-platta skaka i 30 sekunder vid 2.400 varv per minut. Sip tid fastställdes till 15 sekunder vid 15 rpm, en sond skölj varje brunn i 2 sek och en inter-väl skaka var 12 brunnar för 12 sekunder vid 2400 rpm. Inter-och skaka är viktigt att hålla cellerna spridda i media, liksom för förbättrad förmåga att bearbeta data genom att inkludera tidsinställda pauser mellan grupper av brunnar (i detta fall 12 sekunder).
- Använd HyperView Well fliken Identifiering för att bearbeta data och separata till lämplig och (Figur 2). För att identifiera de enskilda brunnarna, kan det hjälpa att använda programvarans buller filter, samt även en bas även filter under de avancerade inställningarna.
- Kvantifiera andel positivt transfekterade levande celler genom lämplig gating att separera olika popdes strax (Figur 3). Först visa flödesdata på en FSC mot SSC spridningsdiagram för att separera celler från skräp (Figur 3A). Om propidiumjodid (PI) användes, grind den enskilda cellen befolkningen och anser att uppgifter om en FSC mot FL3 tomt för att separera levande celler från döda celler och gate levande celler. För att kvantifiera antalet transfekterade celler, se live cellpopulationen på lämpliga kanaler, till exempel, kan GFP ses i FL1. Med hjälp av obehandlade populationen, de obehandlade cellerna grind för att identifiera bakgrundssignalen (figur 3B). De positivt transfekterade celler kan sedan isoleras med denna grind och genom att visa de transfekterade populationerna med både spridning och tomter kontur (Figur 3C och 3D). Det kan finnas ett kontinuum av positivt transfekterade celler, eftersom olika celler kommer att transfekteras till olika grader av fluorescens.
- CellTiter 96 vattenhaltiga analys
- Transfektera en annan skylt på exakt samma sätt för mätningar celltoxicitet.
- Förblandning 1 ml av CellTiter 96 vattenfasen analyslösning med 10 ml färskt medium. Ta ut mediet från celler och använda en multikanalpipett att lägga 110 ul av den förblandade lösningen + media per brunn.
- Mät absorbansen vid 490 nm varje timme intervall från 1 till 4 h tills absorbansen från brunnen med obehandlat tillstånd är i det linjära området för analysen. Inkludera fyra kontrollbrunnar med endast medier lösning + för en bakgrund absorbans läsning.
- Genomsnittet absorbansvärden från de fyra replikatbrunnar per tillstånd och subtrahera den genomsnittliga bakgrunden absorbansen från varje genomsnittet. Normalisera korrigerade medelvärde för varje behandlad tillstånd till det korrigerade medelvärdet av den obehandlade tillstånd för att bestämma lönsamheten procent cellen.
- Prima Fluidics systemet för NanoSight NS500 genom att köra utspädningsmedlet pumpen framåt ungefär 1/5th max hastighet och provpumpen bakåt ungefär 1/10th max hastighet. Fortsätt tills Fluidics systemet spolas med lösningsmedel.
- Förbered nanopartiklar som skall analyseras. I fallet med PBAEs, separat späd lager plasmid-DNA (1 mg / ml) och lager PBAE (100 mg / ml) i natriumacetat-buffert (25 mM, pH 5) i Eppendorf-rör.
- Späd den plasmid-DNA-koncentrationen till 0,06 mg / ml. Polymerkoncentration kan variera beroende på den erforderliga vikten-viktförhållande polymer till DNA (till exempel för 60 vikt / vikt partiklar, är polymeren späds till 3,6 mg / ml).
- Tillsätt polymerlösningen till en lika stor volym av plasmid-DNA-lösning och blanda kraftigt. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 10 minuter för att tillåta självorganisering.
- Diluta nanopartiklar lösningen 100-faldigt i PBS för att nanopartiklars koncentrationen att vara i det lämpliga intervallet för NTA och för att erhålla en slutlig volym på minst 500 | il.
- Ladda provet i NanoSight genom att placera laddningsröret i provet Eppendorfrör (figur 4A). Se till att inte införa luftbubblor.
- I inspelningsläge, öka kamerans nivån tills partiklarna kan ses. Justera fokus så att partiklarna se slät (fig 4A och 4B).
- Även i standardläge, justera kamerans nivå förbi den punkt att alla partiklar kan ses på skärmen. Därefter minska kamerans nivån till den lägsta nivån, så att partiklarna kan alla fortfarande observeras. Om en mellanliggande kamera nivå behövs, gå in avancerat läge och modifiera kamerans slutare och få till lämpliga nivåer.
- Visuellt kontrollera att det finns mellan 20 till 100 partiklar på screen. En idealisk nummer för nanopartiklar spårning är ca 50 partiklar. Om det finns för många eller för få, spola NS500, justera utspädning i PBS och åter ladda provet.
- Justera fånga varaktighet enligt standarden läget tabellen. Typiskt 30 - 60 sek är en lämplig fånga längd (figur 4B).
- För att ladda nästa prov, spola systemet och sedan åter ladda den nya provet.
- När filmer fångas, gå på behandling scenen genom att öppna en videofil.
- Det finns ett antal parametrar som kan ställas in för att bearbeta en video (figur 4C). Målet är att välja parametrar som bäst fånga varje partikel på skärmen, vilket indikeras av en röd markering på skärmen över varje partikel (Figur 5).
- Öka skärmens vinst för bättre se partiklarna. Enligt standard eller avancerat läge, välj autojustering för parametrarna genom clicking. lämpliga rutor. I det fall att Auto inställningarna inte ger tillräckligt välja partiklar, unclick rutan och manuellt ställa in parametrarna (Figur 4C).
- När alla partiklar plockas på skärmen klickar du på processen knappen programvaran för att bearbeta videofilen (Figur 4C). Detta ger partikelstorleksfördelningen, medelvärden storlek, liksom partikelkoncentration.
- För att försäkra sig om att partikelkoncentrationen är korrekt, ändra PBS utspädning, till exempel genom att öka utspädning med 2x, och upprepa proceduren ovan. Mätning flera utspädningar av samma prov rekommenderas för att säkerställa att koncentrationen mätningen av provet är korrekt. Ett bra utbud för mätning är 10 7 -10 9 partiklar / ml.
- Kontrollera att alla plasmider införlivas i nanopartiklar genom att köra gelelektrofores av nanopartiklar och utvärdera huruvida eventuell fri DNA är närvarande.Om inte alla plasmider är inkapslade använda standardtekniker för att mäta DNA-absorbans för att kvantifiera den totala inkapslade plasmider.
- För att beräkna det genomsnittliga antalet plasmider per partikel, dela den totala inkapslade plasmiden koncentration NTA uppmätta partikelhalten. För att uppskatta plasmiden per partikel prov, först använda NTA histogrammet partikelstorleken att beräkna volymfraktionen av varje 1-nm bin partikel. Multiplicera denna fördelning volymfraktion med det totala plasmiden beloppet att erhålla antalet plasmider i varje fack. Dela upp dessa siffror med antalet partiklar i varje fack för att erhålla antalet plasmider per partikel för varje partikelstorlek (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en fluorescensmikroskopi bild av ett exempel på en lyckad transfektion av HRECs med EGFP-plasmiden. Den brightfield bilden är till hjälp för att säkerställa att cellerna bibehåller sin vanliga morfologi. Dessutom kan cellernas viabilitet analyser, såsom MTS eller liknande analyser, kan användas för att bedöma toxiciteten nanopartiklar 7. Flödescytometri, såsom beskrivits, kan användas för att kvantifiera transfektionseffektiviteten. När du använder HyperCyt flera brunnar kvarstad, kommer data att behöva behandlas på lämpligt sätt för att korrekt identifiera brunnarna. Såsom kan ses i den högra panelen i figur 2, när cellantalet är bra (tusentals celler per brunn), och fluidik fungerar korrekt, de individuella brunnarna är lättare att plocka ut både manuellt och av programvaran. Men, om cellantalet är för låga eller det finns ett problem med fluidik, blir det mycket svårare att identifiera den individUAL brunnar (vänstra panelen i fig 2), och experimentet måste troligen upprepas. Byte av slang för Hypercyt kan ofta åtgärda problem med provflödet. När de individuella väl data erhålls, kan de vanligaste flödescytometri mjukvara användas för att analysera de exporterade. FCS-filer. I figur 3 är FlowJo används för gate de positivt transfekterade celler genom att jämföra de obehandlade brunnarna.
De PBAE nanopartiklar är vanligtvis mellan 100 - 200 nm i storlek mätt med NanoSight NTA. När man utför NTA, är det viktigt att antalet nanopartiklar på skärmen vara mellan 20 -. 100, så att programmet kommer att kunna exakt spåra partiklama Figur 5A är ett exempel på alltför många partiklar, medan Figur 5B visar ett exempel på ett lämpligt antal. Bearbetning den fångade videon ska ske så att de observerade partiklarna skärmen plockas upp av softwar e, representerade med de röda hårkorset. Ett exempel på när tröskeln för att plocka upp partiklar är alltför låg kan ses i figur 5C, medan ett exempel på en bättre tröskelnivå visas i fig. 5D. En annan utspädning av provet kan utföras för att säkerställa att provet är i rätt koncentrationsområdet. Den nya partikelkoncentration ges av NanoSight ska matcha nya utspädning. När storlek och partikelkoncentrationen erhålles, kan plasmiden per partikel genomsnitt och distribution beräknas. Exempel resultat kan ses i figur 6. Den experimentella tidslinje visas i figur 7.
| Wells / tavla | Volym / brunn (il) | Celler / brunn |
| 96 | 100 | 2.500 till 5.000 |
| Wells / tavla | Volym / brunn (il) | Partikel volym / brunn (il) | DNA / brunn (ig) | DNA (pg / il) | DNA 1 pg / pl lager (il) | NaAc (il) |
| 96 | 100 | 20 | 0,6 | 0,06 | 3 | 47 |
Tabell 2. Typiska DNA-utspädning protokoll för en 96-brunnars plattformat.
| Polymer: DNA (vikt / vikt) | Partikel volym / brunn (il) | # Replikatbrunnar | DNA / brunn(Ig) | Polymer / Väl (ig) | Polymer / 10 ug / ul lager (il) | NaAc (il) |
| 20 | 20 | 4 | 0,6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0,6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0,6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0,6 | 60 | 30 | 20 |
Tabell 3. Typisk polymer utspädning protokoll för en 96-brunnars plattformat.
Figur1. Enda färgkanal fluorescens avbildning av HRECs transfekterade med PBAE (vänster) GFP fluorescens, färgad grön,. (Middle) Brightfield bild, (höger) sammansatt bild.
Figur 2. Hypercyt programvara väl identifiering steg efter insamlade data (vänster) Exempel på problematiska data på grund av låga räkningar eller problem med fluidik,.. (Höger) Exempel på rena data med lätt identifierade brunnar Klicka här för att se större bild .
Figur 3. FlowJo gating för celler transfekterade med EGFP-plasmiden (A) FSC mot SSC för obehandlade celler,. (B) FL1 mot FL3 för untreated celler, (C, D) FL1 vs FL3 för celler transfekterade med PBAE. Både pseudo-färgdensitet (C) och (D) plottar konturlinjer är användbara för att fastställa platsen för att dra grindar.
Figur 4. Skärmdump av delar av NanoSight nanopartiklar spårning analys programvara, version 2,2 (A) fluidik kontroll,. (B) inspelningsläge, som används för att spela in video av nanopartiklar, (c) behandlingen läge finns efter att ha öppnat en tidigare insamlad video. Röda boxar markera funktioner diskuteras i protokollet. Klicka här för att se större bild .
Figur 5. . Exempel på NanoSight videoinspelning och analys Skärmbilder av prov innan videoinspelning för prov som inte späds tillräckligt (A), och med lämplig utspädning (B), Skärmdumpar för analys läge med partikel detektionströskel för lågt (C) och ställ lämpligt (D), med röda hårkors identifiera alla partiklar lämpligt. Klicka här för att se större bild .
Figur 6. Storleksfördelning och plasmid per partikel uppgifter distribution av PBAE (B5S3E7, 60:1 polymer till DNA vikt / vikt)-baserade nanopartiklar analyseras med NanoSight teknik spårning analys. Utdrag ur [14] Liten, 8, Bhise, NS, Shmueli, RB, Gonzalez ,J., och Green, JJ En ny analys för att kvantifiera antalet plasmider inkapslade av polymera nanopartiklar, 367-373, Copyright 2012, med tillstånd från Wiley-VCH. Klicka här för att se större bild .
Figur 7. Experimentell tidslinje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen ovan beskriver metoder för utvärdering av transfektion effekten av nanopartiklar formuleringar, liksom ett sätt att karakterisera partikelstorleken och DNA lastning av nanopartiklar. Antalet plasmider per partikel är en viktig parameter som kan hjälpa till att förutsäga effektiviteten av partikeln och kan också användas för bestämning dos. Nanopartiklar spårning analys kan utföras i en rad olika vattenhaltiga lösningar, såsom de som skiljer sig i saltkoncentration. Ofta denna karakterisering utförs i PBS, för att efterlikna fysiologisk saltlösning. Medan dimensionering i PBS kan ge en god uppskattning av storleken av nanopartiklarna i media eller fysiologisk koksaltlösning, kan mängden serum närvarande påverkar storleken och stabiliteten av nanopartiklar 17. Därför kan partikelkarakterisering i olika koncentrationer av serum vara viktigt för vissa applikationer. För att karakterisera partiklama i serum, en kompletteNAL steg rekommenderas på grund av den höga bakgrunden spridningen av serumproteiner. I detta fall, bör partiklarna fluorescerande taggad, så att genom användning av fluorescens filtret, kan partiklarna specifikt spåras tydligt från serumproteiner.
Plasmiden per partikel kvantifiering är allmän nog för att användas med olika nanopartiklar formuleringar, inklusive andra polymera eller oorganiska partikelformiga system. På grund av den annorlunda ljusspridning beteende av olika material, video capture och processparametrar kan behöva ändras. Dessutom kan känslighet NTA ändras beroende på materialet. Plasmiden per partikel protokoll som beskrivs ovan är en snabb och användbar metod för karakterisering nanopartiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) och NIH R21CA152473 stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
