Summary
Un protocolo para el análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA) y de alto rendimiento de citometría de flujo para evaluar las nanopartículas poliméricas de suministro de genes se describe. NTA se utiliza para caracterizar la distribución del tamaño de partícula de nanopartículas y la distribución de partículas por plásmido. De alto rendimiento de la citometría de flujo permite una evaluación cuantitativa eficacia de la transfección de una biblioteca de biomateriales de suministro de genes.
Abstract
No virales de suministro de genes usando nanopartículas poliméricas se ha convertido en un enfoque atractivo para la terapia génica para tratar enfermedades genéticas y 1 como una tecnología para la medicina regenerativa 2. A diferencia de los virus, que tienen problemas de seguridad importantes, las nanopartículas poliméricas se pueden diseñar para ser no tóxico, no inmunogénico, no mutagénico, más fáciles de sintetizar, químicamente versátiles, capaces de llevar a mayor carga de ácido nucleico y biodegradable y / o sensible ambientalmente. Los polímeros catiónicos se auto-ensamblan con ADN cargado negativamente a través de la interacción electrostática para formar complejos del orden de 100 nm que son comúnmente denominadas nanopartículas poliméricas. Ejemplos de biomateriales utilizados para formar nanoescala nanopartículas de suministro de genes policatiónicos incluyen polilisina, polifosfoésteres, poli (amidoaminas) s y polietilenimina (PEI), que es un no-degradable off-the-shelf polímero catiónico comúnmente usado para el suministro de ácido nucleico 1,3. Poli (beta-aminoéster) s (PBAEs) son una nueva clase de polímeros catiónicos 4 que son hidrolíticamente degradables 5,6 y se ha demostrado ser eficaz en la entrega de genes para tipos de células difíciles de transfectar tales como células de la retina humanas endoteliales (HRECs) 7, las células epiteliales mamarias de ratón 8, las células humanas de cáncer de cerebro 9 y macrovasculares (vena umbilical humana, HUVEC) células endoteliales 10.
Un nuevo protocolo para caracterizar las nanopartículas poliméricas que utilizan nanopartículas de análisis de seguimiento (NTA) se describe. En este enfoque, tanto la distribución del tamaño de partícula y la distribución del número de plásmidos por partícula se obtienen 11. Además, una placa de ensayo de alto rendimiento de transfección de 96 pocillos para la detección rápida de la eficacia de la transfección de nanopartículas poliméricas se presenta. En este protocolo, poli (beta-amino-éster) s (PBAEs) se utilizan como polímeros de modelo y células humanas endoteliales retinianas (HRECs) se utilizan como moDel células humanas. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para evaluar cualquier nanopartícula polimérica y cualquier tipo de célula de interés en un formato de placa de múltiples pocillos.
Introduction
La determinación del número de plásmidos acomplejados por nanopartículas es importante diseñar eficaces estrategias basadas en nanopartículas de suministro de genes, en particular para el cosuministro de los plásmidos múltiples a la misma célula objetivo, como se requiere a menudo en estudios de células madre reprogramación 12. Algunos enfoques para calcular el número de plásmidos asociados con una nanopartícula solo se han descrito, y cada enfoque tiene inconvenientes en las técnicas utilizadas para la estimación de 13-16. Puntos cuánticos (QD) etiquetado combinado con TEM se ha utilizado para estimar plásmidos por partícula en nanopartículas a base de quitosano. Estimación con esta técnica QD es complicado debido a la necesidad de etiquetar el ADN, que puede alterar sus propiedades de autoensamblaje, la posibilidad de que el ADN no marcado encapsulado no se detecta directamente; plásmidos potencialmente superpuestos y QDS en las imágenes de TEM 2D de partículas, y otros supuestos simplificadores 13. Un enfoque alternativo que es unpplicable cuando microdominios ordenados existen en las partículas ha sido utilizado para estudiar el ADN lipopoliamina complejos a través de la crio-microscopía electrónica de transmisión (crio-TEM), dispersión de rayos X, y dispersión de luz dinámica (DLS) 14,15. Desafortunadamente, los materiales tales como las nanopartículas poliméricas aquí investigados no son aplicables con este método. . En otro estudio, Collins et al usaron un flujo de partículas imagen técnica de análisis para estudiar (Lys) 16-que contiene péptido / ADN complejos, sin embargo, su método sólo se puede evaluar más grandes, partículas de tamaño micrométrico 16. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo ensayo y flexible para cuantificar el número de plásmidos por nanopartícula 11.
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Protocol
1. Siembra Celular
- No permitir que las células crezcan a overconfluency. Usar células tempranas de paso cuando la transfección de células primarias.
- Veinticuatro horas antes de la transfección, Tripsinizar las células, se cuentan las células usando un hemocitómetro, y se diluye la suspensión celular con los medios para conseguir la densidad celular deseada (células / volumen). Se siembran las células en el tejido claro cultivo tratado con fondo plano de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal y depósito. La densidad seleccionada debe dar 70-80% de confluencia en el día de la transfección. Por ejemplo, como se muestra en la Tabla 1, las células se diluyeron a 25 a 50 células / l durante los datos de transfección muestran aquí.
2. La transfección celular
- La dilución del polímero y las poblaciones de ADN. Descongelar polímero y soluciones de ADN de stock a temperatura ambiente (RT). Dilución de la solución stock de polímero y la solución madre de ADN, por separado en claros placas de 96 pocillos utilizando una pipeta de doce canales, Con el disolvente apropiado a las concentraciones requeridas para obtener el peso de polímero deseado para relaciones en peso de ADN (peso / peso). En este caso, el disolvente elegido es 25 mM de tampón de acetato de sodio (pH = 5,2).
- ADN de dilución. Típicamente, el ADN se almacenó a 1 mg / ml se diluye en tampón de acetato sódico a una concentración de 0,03 a 0,06 mg / ml en una clara no-cultivo de tejido tratado con placa de 96 pocillos (un pocillo para una sola formulación). Tabla 2 muestra el ADN típico protocolo de dilución para una única formulación se utiliza para transfectar cuatro pocillos replicados en una placa de 96 pocillos sembradas con células procedentes de la Etapa 1.
- Polímero de dilución. El 100 mg / ml de polímero / DMSO solución se diluye en tampón de acetato sódico de acuerdo con la concentración requerida para obtener el polímero deseado en el ADN en peso / peso de relación. El rango de peso / peso de proporciones utilizadas típicamente para la administración de genes con poli (beta-amino-éster) s (PBAEs) es de 20 a 100. Polímeros PBAE se diluye primero a 10 mg / ml, seguido por la dilución protocolo como se muestra en la Tabla 3. Las diluciones de polímero se puede realizar en un claro no de cultivo de tejido tratado con placa de 96 pocillos que coincida con la orientación de la muestra de la placa de dilución de ADN.
- Formación de nanopartículas. Añadir la solución PBAE a un volumen igual de la solución de ADN plasmídico utilizando una pipeta de doce canales y mezclar vigorosamente. Deje incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la auto-ensamblaje.
- Nanopartículas de transfección. Después de auto-ensamblaje, 20 nanopartículas mu l por pocillo se añaden gota a gota a medio de cultivo utilizando la pipeta de doce canales. Pocillos replicados se deja sin tratamiento o se transfectan con reactivos disponibles comercialmente como controles. Las células transfectadas se incubaron a 37 ° C durante dos a cuatro horas y luego los pozos se remplazó con medio fresco (100 l / pocillo). La elección del tiempo de incubación dependerá de la línea de células, condiciones de cultivo, y sistema de transfección. La diferencia en la transfeccióneficacia y toxicidad de la célula como resultado de la variación de período de incubación se cuantificó mediante el protocolo de análisis descrito en la Etapa 3.
3. Análisis de la eficiencia de transfección y toxicidad celular
Eficiencia de la transfección se analizó visualmente con un microscopio de fluorescencia y se cuantificó usando un citómetro de flujo cuarenta y ocho horas después de la transfección. Toxicidad celular se analiza visualmente con un microscopio de fluorescencia y se cuantificó usando el CellTiter 96 Aqueous One ensayo de veinticuatro horas después de la transfección.
- Microscopía de fluorescencia. Visualmente analizar los pocillos para la expresión del gen reportero transfectadas (por ejemplo, EGFP o DsRed) usando el canal de fluorescencia adecuado. Adquisición de imágenes para cada pocillo, la elección de los campos de visión que representan adecuadamente la eficacia de transfección de las formulaciones particulares (Figura 1). Tome nota de cualquier toxicidad celular observado visualmente.
- Citometría de Flujo.
- Usar pipetas multicanal para preparar la placa de 96 pocillos para la citometría de flujo. Lavar con PBS, Tripsinizar con 30 l / pocillo de tripsina / EDTA, neutralizar con 170 l de tampón FACS (PBS + 2% de FBS), pipeta hacia arriba y abajo en cada pocillo, incluyendo alrededor de los bordes, y transferir la totalidad de 200 l de volumen de cada pocillo en los pocillos correspondientes de un fondo redondo o fondo V-96-así placa.
- Centrifugar la placa a 130 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Eliminar los medios de comunicación 170 mu l de cada pocillo y las células pipeta para resuspender evitando burbujas. Para utilizar una viabilidad mancha como yoduro de propidio (PI), añadir 10 l de tampón FACS + PI (50:1 tampón FACS: PI dilución; concentración PI stock 1 mg / ml) a cada pocillo. Coloque inmediatamente en hielo y la cubierta de la luz.
- Inicie el citómetro de flujo Accuri C6, el HyperCyt 96 y el apego, y el software HyperView. Utilice el diseño de HyperView y las fichas del Protocolo de elegir el adecuado ptipo de retraso, diseño de placa y otros ajustes tales como movimiento / sip / enjuague / shake tiempo. Para el protocolo anterior, los siguientes parámetros se utilizaron, un primer pre-placa durante un minuto, y un batido de pre-placa durante 30 segundos a 2.400 rpm. Tiempo Sip se fijó durante 15 segundos a 15 rpm, una sonda de enjuague cada pocillo durante 2 seg, y una inter-así agitar cada 12 pozos de 12 segundos a 2.400 rpm. El movimiento de la inter-así es importante para mantener las células dispersas en los medios de comunicación, así como para mejorar la capacidad para procesar los datos mediante la inclusión de pausas programadas entre grupos de pozos (en este caso 12 sec).
- La pestaña HyperView identificación Bueno para procesar los datos y se separan en el pozo correspondiente (Figura 2). Con el fin de identificar los pocillos individuales, puede ayudar a utilizar el software de filtro de ruido, así como incluyendo una base de filtro, incluso bajo la configuración avanzada.
- Cuantificar el porcentaje de células transfectadas positivamente en vivo por gating conveniente separar pop diferenteulations (Figura 3). Primero ver los datos de flujo de un diagrama de dispersión de FSC frente a SSC a fin de separar las células del desechos (Figura 3A). Si yoduro de propidio (PI) se utilizó, puerta la población de células individuales y la vista que los datos sobre una parcela de FSC frente a FL3 a fin de separar las células vivas de las células muertas y la puerta de las células vivas. Con el fin de cuantificar el número de células transfectadas, ver la población de células vivas en los canales apropiados, por ejemplo, GFP puede ser visto en FL1. Uso de la población no tratada, puerta de las células no tratadas con el fin de identificar la señal de fondo (Figura 3B). Las células transfectadas positivamente a continuación, se puede aislar utilizando esta puerta y mediante la visualización de las poblaciones transfectadas utilizando tanto la dispersión y gráficos de contorno (Figura 3C y 3D). Puede haber un continuo de células transfectadas positivamente, como diferentes células se transfectaron con diferentes grados de fluorescencia.
- CellTiter 96 Aqueous One ensayo
- Transfectar otra placa exactamente de la misma manera que para las mediciones de toxicidad celular.
- Premezcla 1 ml de la solución acuosa CellTiter 96 Un ensayo con 10 ml de medio fresco. Retire el medio de las células y utilizar una pipeta multicanal para añadir 110 l de la solución premezclada + medios de comunicación por pocillo.
- Medir la absorbancia a 490 nm cada intervalo de una hora de 1 a 4 horas hasta que la absorbancia del pozo con la condición sin tratamiento está en el intervalo lineal del ensayo. Incluye cuatro pozos de control con medios de sólo + Solución para una lectura de absorbancia de fondo.
- Los valores promedio de la absorbancia de los cuatro pocillos por duplicado por condición y restar la absorbancia media de fondo de cada medio. Normalizar la media corregida para cada condición tratada con la media corregida de la condición no tratada para determinar la viabilidad celular por ciento.
- Primer sistema de la fluídica de la NS500 NanoSight mediante la ejecución de la bomba de diluyente hacia adelante a aproximadamente 1/5o la velocidad máxima y la bomba de muestra hacia atrás a aproximadamente 1/10th la velocidad máxima. Continúe hasta que el sistema de fluidos se limpia con diluyente.
- Preparar las nanopartículas para ser analizados. En el caso de PBAEs, separado diluir el ADN plásmido de archivo (1 mg / ml) y almacenadas PBAE (100 mg / ml) en tampón de acetato sódico (25 mM, pH 5) en tubos Eppendorf.
- Diluir la concentración de ADN de plásmido a 0,06 mg / ml. La concentración de polímero puede variar dependiendo de la requerida peso-peso de polímero de ADN (por ejemplo, para 60 peso / peso de las partículas de polímero se diluye a 3,6 mg / ml).
- Añadir la solución de polímero a un volumen igual de la solución de ADN plasmídico y mezclar vigorosamente. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la auto-ensamblaje.
- Dilaúd la disolución de nanopartículas 100 veces en PBS para que la concentración de nanopartículas para estar en el rango apropiado para NTA y para obtener un volumen final de al menos 500 l.
- Cargar la muestra en el NanoSight colocando el tubo de carga en la muestra de tubo de Eppendorf (Figura 4A). Asegúrese de no introducir burbujas de aire.
- En el modo de captura, aumente el nivel de la cámara hasta que las partículas se pueden ver. Ajuste el enfoque de modo que las partículas de aspecto liso (Figura 4A y 4B).
- Mientras que en el modo normal, ajustar el nivel de la cámara pasado el punto de que todas las partículas se pueden ver en pantalla. Entonces, disminuir el nivel de la cámara al nivel más bajo de tal manera que las partículas pueden todo todavía ser observado. Si el nivel de la cámara intermedia que se necesita, entre en el modo avanzado y modificar el obturador de la cámara y obtener los niveles adecuados.
- Revise visualmente para asegurarse de que son entre 20 - 100 partículas en el screen el. Un número ideal para el seguimiento de las nanopartículas es de aproximadamente 50 partículas. Si hay demasiados o muy pocos, enjuague el NS500, ajustar la dilución en PBS, y volver a cargar la muestra.
- Ajustar la duración de captura de acuerdo con el modo normal. Típicamente de 30 - 60 segundos es una longitud de captura adecuada (Figura 4B).
- Para cargar la siguiente muestra, enjuague el sistema y vuelva a cargar la nueva muestra.
- Una vez que se capturan vídeos, pase a la etapa de procesamiento mediante la apertura de un archivo de vídeo.
- Hay una serie de parámetros que se pueden sintonizar con el fin de procesar mejor un vídeo (Figura 4C). El objetivo es seleccionar los parámetros que mejor captura de cada partícula en la pantalla, como se indica por una marca de cruz roja en la pantalla sobre cada partícula (Figura 5).
- Aumentar la ganancia de la pantalla para ver mejor las partículas. En el modo estándar o avanzada, seleccione el ajuste automático de los parámetros pinchandog las casillas correspondientes. En el caso de que la configuración automática no seleccionar adecuadamente las partículas, desactive la casilla y establecer manualmente los parámetros (Figura 4C).
- Una vez que todas las partículas son recogidas en pantalla, haga clic en el botón de proceso del software para procesar el archivo de vídeo (Figura 4C). Esto proporciona la distribución del tamaño de partícula, promedio del tamaño, así como la concentración de partículas.
- Con el fin de asegurarse de que la concentración de partículas es preciso, cambiar la dilución PBS, tales como mediante el aumento de la dilución por 2x, y repetir el procedimiento anterior. Medición de múltiples diluciones de la misma muestra se recomienda para asegurar que la medición de la concentración de la muestra es correcta. Un intervalo aceptable para una medición es 10 7 -10 9 partículas / ml.
- Verificar que todos los plásmidos se incorporan en nanopartículas mediante la ejecución de la electroforesis en gel de las nanopartículas y la evaluación de si cualquier ADN libre presente.Si no todos los plásmidos se encapsulan, usar técnicas estándar para medir la absorbancia de ADN con el fin de cuantificar el total plásmidos encapsulados.
- Para calcular el número medio de plásmidos por partícula, dividir la concentración total de plásmido encapsulado por la concentración de partículas NTA medido. Con el fin de estimar el plásmido distribución de partículas por muestra, utilizar la primera partícula NTA histograma tamaño para calcular la fracción de volumen de cada bin 1-nm de partícula. Multiplicar esta distribución fracción de volumen por la cantidad de plásmido total para obtener el número de plásmidos en cada bin. Divida estos números por el número de partículas en cada intervalo para obtener el número de plásmidos-per-partículas para cada tamaño de partícula (Figura 6).
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Representative Results
La Figura 1 muestra una imagen de microscopía de fluorescencia de una muestra de una transfección con éxito de HRECs con el plásmido EGFP. La imagen de campo claro es útil para asegurar que las células mantienen su morfología habitual. Adicionalmente, ensayos de viabilidad celular, tales como MTS o ensayos similares, se puede utilizar para evaluar la toxicidad de las nanopartículas 7. La citometría de flujo, como se ha descrito, se puede utilizar para cuantificar la eficiencia de la transfección. Cuando se utiliza el HyperCyt de múltiples pocillos fijación de la placa, los datos necesitan ser procesadas adecuadamente con el fin de identificar correctamente los pocillos. Como puede verse en el panel derecho de la Figura 2, cuando los recuentos de células son buenos (en miles de células por pocillo), y los fluidos estén funcionando correctamente, los pocillos individuales son más fáciles de seleccionar manualmente y por el software. Sin embargo, si los recuentos de células son demasiado baja o existe un problema con los fluidos, se hace mucho más difícil identificar la perUAL pozos (panel izquierdo de la Figura 2), y el experimento probablemente necesita ser repetido. Sustitución del tubo de la Hypercyt menudo puede solucionar los problemas con el flujo de la muestra. Una vez que los datos de pozos individuales se obtienen, software de citometría de flujo más común puede ser usado para analizar los archivos exportados. FCS. En la Figura 3, FlowJo se utiliza para puerta de las células transfectadas positivamente mediante la comparación de los pocillos no tratados.
Las nanopartículas PBAE son por lo general entre 100 a 200 nm de tamaño, medido por el NTA NanoSight. Al realizar NTA, es importante que el número de nanopartículas en la pantalla de ser entre 20 -. 100 de modo que el software será capaz de seguir con precisión las partículas de la Figura 5A es un ejemplo de partículas de más, mientras que la figura 5B muestra un ejemplo de un número adecuado. Procesando el vídeo capturado debe hacerse de tal manera que las partículas que aparecen en pantalla observados son recogidos por el softwar e, representado con las cruces rojas. Un ejemplo de cuando el umbral para la recogida de partículas es demasiado bajo, puede verse en la Figura 5C, mientras que un ejemplo de un nivel de umbral se ve mejor en la Figura 5D. Una dilución diferente de la muestra se puede realizar para asegurarse de que la muestra está en el intervalo de concentración correcta. La concentración de partículas nueva propuesta por el NanoSight debe coincidir con la nueva dilución. Una vez que el tamaño y la concentración de partículas se obtienen, el promedio de partícula por plásmido y distribución puede ser calculado. Resultados del ejemplo se puede ver en la Figura 6. La línea de tiempo experimental se muestra en la Figura 7.
| Wells / Plata | Volumen / Bueno (l) | Células / pocillo |
| 96 | 100 | 2.500 a 5.000 |
| Wells / Plata | Volumen / Bueno (l) | Partículas de volumen / Bueno (l) | DNA / Bueno (g) | ADN (g / l) | DNA 1 mg / l de valores (l) | NaAc (l) |
| 96 | 100 | 20 | 0,6 | 0,06 | 3 | 47 |
Tabla 2. ADN típico protocolo de dilución para un formato de placa de 96 pocillos.
| Polímero: ADN (peso / peso) | Partículas de volumen / Bueno (l) | # Replicar Wells | DNA / Bueno(G) | Polímero / Bueno (g) | Polímero / 10 mg / l de stock (l) | NaAc (l) |
| 20 | 20 | 4 | 0,6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0,6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0,6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0,6 | 60 | 30 | 20 |
Tabla 3. Típica polímero protocolo de dilución para un formato de placa de 96 pocillos.
Figura1. Color único canal de imágenes de fluorescencia de HRECs transfectadas con PBAE (izquierda) GFP fluorescencia, de color verde;. (Medio) Imagen campo claro, (Derecha) Imagen compuesta.
Figura 2. Paso Hypercyt software de identificación y después de los datos recogidos (izquierda) Ejemplo de datos problemáticos debido a las cuentas bajas o problema sobre los fluidos;.. (Derecha) Ejemplo de datos limpios, con pozos fáciles de identificar Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Gating FlowJo para las células transfectadas con el plásmido EGFP (A) FSC frente a SSC para las células no tratadas;. (B) FL1 frente a FL3 para ucélulas ntreated; (C, D) FL1 frente a FL3 de las células transfectadas con PBAE. Tanto pseudo-densidad de color (C) y (D) gráficos de contorno son útiles para determinar la ubicación para dibujar puertas.
Figura 4. Captura de pantalla de algunas partes del software de análisis de nanopartículas NanoSight seguimiento, versión 2.2 (A) El control de fluidos;. (B) el modo de captura, que se utiliza para capturar vídeo de las nanopartículas, (C) Modo de procesamiento disponible después de la apertura de un vídeo capturado previamente. Cajas rojas funciones destacan tratados en el protocolo. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 5. . Ejemplo de captura de vídeo NanoSight y análisis Imágenes de la muestra antes de la captura de vídeo de muestra que no se diluye lo suficiente (A), y con la dilución adecuada (B); Capturas de pantalla del modo de análisis con umbral de detección de partículas demasiado bajo (C) y el valor apropiado (D), con cruces rojas que identifican todas las partículas adecuadamente. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 6. Tamaño y distribución de datos de plásmido por distribución de partículas de PBAE (B5S3E7, 60:1 polímero de ADN en peso / peso) de nanopartículas basadas analizaron utilizando el seguimiento de NanoSight técnica de análisis. Reimpreso de Small [14], 8, Bhise, NS, Shmueli, RB, Gonzalez ,J., y Green, JJ Un nuevo ensayo para cuantificar el número de plásmidos encapsulados en nanopartículas poliméricas, 367-373, Copyright 2012, con permiso de Wiley-VCH. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 7. Línea de tiempo Experimental.
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Discussion
Los protocolos anteriores describen métodos para evaluar la eficacia de la transfección de las formulaciones de nanopartículas, así como una forma de caracterizar el tamaño de partícula y carga de ADN de las nanopartículas. El número de plásmidos por partícula es un parámetro importante que puede ayudar a predecir la eficacia de la partícula y también se puede utilizar para la determinación de la dosis. Nanopartículas de análisis de seguimiento se puede realizar en una variedad de diferentes soluciones acuosas, tales como las diferencias en la concentración de sal. A menudo, esta caracterización se lleva a cabo en PBS, para imitar solución salina fisiológica. Si bien encolado en PBS puede dar una buena estimación del tamaño de las nanopartículas en los medios de comunicación o solución salina fisiológica, la cantidad de suero presente puede afectar al tamaño y la estabilidad de las nanopartículas 17. Por lo tanto, la caracterización de partículas en diversas concentraciones de suero puede ser importante para ciertas aplicaciones también. Con el fin de caracterizar las partículas en suero, un additional paso se recomienda debido a la dispersión de fondo alto de proteínas de suero. En este caso, las partículas deben ser etiquetados fluorescentemente, de manera que a través del uso del filtro de fluorescencia, las partículas pueden ser específicamente seguido claramente a partir de proteínas de suero.
La cuantificación del plásmido por partícula es bastante general para ser utilizado con diferentes formulaciones de nanopartículas, incluyendo otros sistemas de partículas poliméricas o inorgánicas. Debido al comportamiento de dispersión de luz diferente de diferentes materiales, la captura de vídeo y parámetros de procesamiento puede necesitar ser modificada. Además, la sensibilidad de la NTA puede cambiar en función del material. El protocolo de plásmido por partícula descrito anteriormente es un método rápido y útil para la caracterización de nanopartículas.
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Disclosures
Los autores reportan no tener ningún conflicto de interés.
Acknowledgments
Los autores agradecen al MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) y NIH R21CA152473 de apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
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